Artigo de método

Abordagens de Biologia Estrutural e Química Analítica para Caracterização de Enzimas Metabólicas de C-Glicosídeos na Microbiota Intestinal Humana

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DOI:

10.3791/67629

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23 de maio de 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Estudos recentes destacam os papéis das enzimas da microbiota intestinal humana no metabolismo dos glicosídeos C. Aqui, apresentamos uma metodologia abrangente que integra técnicas de química analítica (LC-MS / MS e NMR) com abordagens de biologia estrutural para caracterizar sistematicamente as cadeias de reação estruturais e enzimáticas dessas enzimas metabolizadoras de glicosídeos C.

Resumo

A microbiota intestinal emergiu como um modulador chave da saúde do hospedeiro, principalmente por causa de sua capacidade de metabolizar glicosídeos dietéticos. Embora os glicosídeos C demonstrem estabilidade química superior e resistência à clivagem enzimática em comparação com os glicosídeos O, bactérias intestinais especializadas podem metabolizá-los seletivamente, melhorando sua biodisponibilidade. Desde a identificação das enzimas C-glicosidase microbianas, os mecanismos precisos da reação permanecem incompletamente compreendidos, e as metodologias padronizadas para estudar esses processos ainda não estão bem estabelecidas. Para preencher essa lacuna, introduzimos uma abordagem multidisciplinar integrada combinando biologia estrutural, enzimologia e técnicas analíticas, incluindo cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e ressonância magnética nuclear (RMN), para caracterizar sistematicamente essas atividades enzimáticas. Essa abordagem abrangente permite a caracterização precisa do metabolismo do glicosídeo C nos níveis molecular, enzimático e metabólico.

Introdução

Recentemente, a microbiota intestinal humana ganhou atenção considerável por seu papel crucial no apoio à saúde do hospedeiro 1,2. Essas comunidades microbianas metabolizam compostos derivados do hospedeiro, produzindo metabólitos biologicamente ativos 1,2,3. Por exemplo, os flavonóides, entre os compostos naturais mais abundantes em nossa dieta diária, existem principalmente como glicosídeos O ou C, que são mal absorvidos no intestino humano4. No entanto, a microbiota intestinal pode transformar esses glicosídeos em derivados mais bioativos, como glicosídeos secundários ou agliconas, reduzindo sua solubilidade e aumentando sua absorção, melhorando assim suas bioatividades em comparação com suas formas nativas 5,6.

Historicamente, os mecanismos de hidrólise dos O-glicosídeos têm sido extensivamente estudados 7,8. Os glicosídeos C, caracterizados por suas ligações glicosídicas C-C, apresentam maior estabilidade química e resistência à clivagem 9,10. Apesar disso, certas bactérias intestinais desenvolveram a capacidade de desglicosilatar os glicosídeos C 11,12. Em 1988, Hattori et al. demonstraram pela primeira vez que algumas bactérias intestinais poderiam remover grupos glicosil dos glicosídeos C 13. Estudos subsequentes isolaram a primeira cepa bacteriana capaz dessa atividade, permitindo uma maior exploração dos mecanismos de clivagem do glicosídeo C 14. Até o momento, no entanto, apenas um número limitado de cepas bacterianas intestinais e enzimas metabolizadoras de glicosídeos C foi identificado e caracterizado 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Estudos recentes mostraram que as enzimas de desglicosilação da puerarina (daidzeína-8-C-glicosídeo) (DgpA/B/C) na cepa PUE são capazes de clivar a puerarina em daidzeína e glicose por meio de processos de duas etapas: DgpA, uma oxidorredutase da família Gfo/Idh/MocA, oxida a puerarina em 3''-oxo-puerarina, que então sofre uma reação de eliminação β mediada pelo complexo DgpB/C para produzir a aglicona e a glicose 10, 26. No entanto, as características estruturais e funcionais das enzimas metabolizadoras de glicosídeos C, particularmente o sistema DgpA/B/C, permanecem incompletamente compreendidas, e há necessidade de metodologias mais avançadas, particularmente a integração de estratégias biológicas e químicas, para avançar nas pesquisas nesse campo24.

Para resolver essa lacuna, empregamos abordagens multidisciplinares integradas para investigar a microbiota intestinal humana DgpA / B / C catalisada Nessa reação, o DgpA catalisa a oxidação glicosil dos glicosídeos C, posteriormente, o DgpB e o DgpC formam um complexo DgpB / C que cliva especificamente os produtos oxidados do glicosídeo C 10 , 26 , 27 . Primeiramente, realizamos a expressão recombinante e a purificação de DgpA e DgpB/C separadamente. As proteínas DgpA e DgpB/C purificadas foram então cristalizadas e suas estruturas tridimensionais foram determinadas por cristalografia de raios-X. Finalmente, reconstituímos a função de clivagem do glicosídeo C usando o sistema enzimático DgpA/B/C completo, com análise abrangente do produto metabólico conduzida por meio de espectroscopia acoplada de LC-MS/MS e RMN27. Com base nessas abordagens, estudamos o metabolismo do glicosídeo C catalisado pelo sistema enzimático DgpA/B/C.

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Protocolo

1. Produção e purificação de proteínas

  1. Construção do vetor de expressão
    NOTA: Neste estudo, os genes DgpA, DgpB e DgpC da microbiota intestinal humana, cepa PUE , servem como um sistema modelo. O primeiro passo envolve o uso de plasmídeos de expressão para produzir as proteínas recombinantes correspondentes.
    1. Obtenha a sequência de cluster do gene DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) do NCBI. Em seguida, sintetize comercialmente o DNA DgpA/B/C e clone individualmente os genes DgpA, DgpB e DgpC em um vetor pET-28a modificado, que produzirá a proteína-alvo com o SUMO N-terminal e a tag 6×His (tag His-SUMO)28.
    2. Transforme cada um dos plasmídeos DgpA, DgpB ou DgpC em células competentes para E. coli BL21 (DE3). Posteriormente, cultura de bactérias em meio LB com 50 μg/mL de canamicina a 37 °C.
    3. Adicione 0,2 mM IPTG ao meio quando a densidade bacteriana (OD600) atingir 0,6. Cultivar as bactérias a 16 °C durante 16 h.
    4. Centrifugue cada uma das culturas bacterianas que expressam DgpA, DgpB e DgpC a 4.000 x g por 20 min a 4 °C. Ressuspenda o pellet celular em 20 mL de tampão A (Tabela 1) para cada 1 L de cultura bacteriana.
  2. Purificação de proteínas
    NOTA: Quantidades suficientes e de alta pureza de enzimas recombinantes são essenciais para a caracterização funcional e estudos de biologia estrutural. DgpB e DgpC formam um complexo proteico estável (formam espontaneamente o complexo DgpB / C durante o procedimento de lise) para funcionalidade10,26. A purificação da proteína DgpA e do complexo DgpB/C é então realizada.
    1. Adicione 1 mM de PMSF à ressuspensão bacteriana. Misture a suspensão bacteriana DgpB e DgpC da etapa 1.1.4 e, em seguida, lise a suspensão bacteriana DgpA ou a mistura DgpB e DgpC (para formar o complexo DgpB / C funcional) usando um disruptor de célula ultrassônico.
    2. Centrifugue o lisado bacteriano a 48.000 x g por 40 min a 4 °C. Guarde o sobrenadante contendo a proteína e descarte o pellet bacteriano.
    3. Purificar o complexo DgpA ou DgpB/C do sobrenadante utilizando uma coluna de cromatografia de afinidade de níquel (Ni-NTA). Eluir as proteínas ligadas aplicando um gradiente de concentração de imidazol de 0 a 50% com tampão A e tampão B (Tabela 1) no purificador ÄKTA.
    4. Pegue 10 μL de amostras eluídas e misture-as com 2 μL de corante proteico 5 ×, em seguida, execute a eletroforese SDS-PAGE a 220 V por 45 min usando um sistema de eletroforese vertical, seguido pela coloração Coomassie Blue para visualizar as bandas de proteínas. Recolha frações contendo DgpA ou o complexo DgpB/C com base na análise SDS-PAGE para utilização futura.
      NOTA: O DgpA (44 kDa) com uma banda de etiqueta His-SUMO (17 kDa) migra em torno de 61 kDa (Figura 2D), enquanto DgpC (33 kDa) com uma etiqueta His-SUMO (17 kDa) migra em torno de 50 kDa, e DgpB (15 kDa) com uma etiqueta His-SUMO (17 kDa) migra em torno de 33 kDa (Figura 2J).
    5. Dialise as amostras do complexo DgpA ou DgpB/C da etapa 1.2.3 usando a membrana de diálise de corte de peso molecular de 10 kDa contra o tampão C para remover o imidazol e com a protease 1 semelhante à ubiquitina (ULP1; Tabela de Materiais) enzima para remover a etiqueta His-SUMO29.
    6. Carregue a amostra de proteína dialisada no tampão C (Tabela 1) através da coluna de cromatografia de troca iônica (coluna Q). Em seguida, eluir a proteína ligada da coluna usando um gradiente de concentração de cloreto de sódio variando de 100 mM a 600 mM, preparado com tampão C e tampão D (Tabela 1) no purificador ÄKTA.
    7. Realizar a análise SDS-PAGE do complexo DgpA e DgpB/C eluído a partir da coluna Q como o passo 1.2.3, anotando os pesos moleculares: etiqueta His-SUMO (17 kDa), DgpA (44 kDa), bandas oligoméricas de DgpA (acima de 95 kDa) (Figura 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), bandas oligoméricas de DgpB e DgpC (entre 53 kDa e 95 kDa) (Figura 2K).
    8. Purifique a proteína usando uma coluna de exclusão de tamanho (SEC) com o tampão E (Tabela 1). Realize a análise SDS-PAGE usando proteínas da fração de eluição, seguida pela coloração com azul de Coomassie para visualizar as bandas de proteínas. Recolher as fracções que contêm a proteína-alvo DgpA ou o complexo DgpB/C após análise por SDS-PAGE.
      NOTA: A banda DgpA é vista em torno de 44 kDa com banda DgpA oligomerizada acima de 95 kDa (Figura 2F), enquanto DgpC está em torno de 33 kDa, e DgpB está em torno de 15 kDa com DgpB e DgpC oligomerizados (entre 53 kDa e 95 kDa) (Figura 2L).
    9. Meça a concentração proteica do complexo DgpA ou DgpB/C usando uma nanogota a 280 nm. Em seguida, concentre o complexo DgpA ou DgpB / C a cerca de 20 mg / mL com tubos de ultrafiltração, alicote Armazene o complexo DgpA ou DgpB/C a -80 °C para uso futuro.
  3. Coleta de dados de espectro de dicroísmo circular (CD)
    NOTA: Uma vez que a oxidação glicosílica catalisada por DgpA serve como a etapa crucial de iniciação na via metabólica, a espectroscopia de CD foi empregada especificamente para verificar o estado de dobramento adequado e a integridade estrutural secundária de DgpA. Esses parâmetros estruturais são extremamente importantes tanto para a atividade enzimática quanto para a cristalização bem-sucedida de proteínas.
    1. Dilua a proteína DgpA a 0,2 mg / mL com 1 x tampão PBS (pH 7,4) (Tabela 1).
    2. Carregue 1x tampão PBS (pH 7,4) em uma cubeta de quartzo e registre o espectro de CD de linha de base em 200 - 260 nm usando um espectrômetro de CD para detectar com sensibilidade a estrutura secundária e as diferenças de estado de dobramento27.
    3. Substitua a cubeta tampão por amostras de proteínas de 1.3.1, registre o espectro de CD acima de 200 - 260 nm e subtraia a linha de base do tampão para obter o espectro de CD para a amostra de proteína.
    4. Colete três varreduras para precisão e analise os dados quanto às características da estrutura secundária e ao estado de dobramento da proteína (Figura 3G, 3H).

2. Cristalografia de proteínas e determinação da estrutura

NOTA: Depois de confirmar que o DgpA manteve a integridade estrutural e de dobramento adequadas, abordagens de biologia estrutural foram empregadas para determinar as estruturas tridimensionais de ambos os DgpA. Dado que a competência catalítica do complexo DgpB / C havia sido confirmada bioquimicamente por meio de ensaios funcionais anteriores10 , 26 , a etapa de verificação espectral do CD foi omitida.

  1. Crescimento e otimização de cristais de proteínas
    1. Misture 0,5 μL de DgpA purificado (20 mg / mL) ou complexo DgpB / C (20 mg / mL) com um volume igual (0,5 μL) de solução reservatório de kits de cristalização em placas de cristal de 48 poços em um método de gota sentada30. Transfira as placas de cristal para 16 °C para o crescimento do cristal.
      NOTA: Observe essas gotas sentadas com um microscópio para identificar as condições (incluindo concentração de proteína e precipitantes, como PEG 3350, formato de magnésio, etc.) para o crescimento de cristais do complexo DgpA ou DgpB / C.
    2. Execute a otimização da cristalização para o complexo DgpA e DgpB / C usando o método de difusão de vapor suspenso30.
    3. Para DgpA, comece com a condição identificada na etapa 2.1.1 (20 mM de formato de magnésio, 20% PEG3350) e aplique uma abordagem de otimização ortogonal testando seis gradientes de concentração de PEG3350 (17%, 18%, 19%, 20%, 21% e 22%) contra quatro gradientes de concentração de formato de magnésio (16 mM, 18 mM, 20 mM e 22 mM) 30 .
    4. Prepare gotas de cristalização misturando 0,8 μL de solução de proteína DgpA (10 ou 20 mg / mL) com 0,8 μL de solução reservatório em lamínulas de vidro silanizadas. Em seguida, inverta as lamínulas sobre placas de cristalização de 24 poços e incube a 16 ° C para o crescimento do cristal.
    5. Para a otimização do complexo DgpB/C, siga a mesma abordagem: misture 0,8 μL de complexo proteico (10 ou 20 mg/mL) com 0,8 μL de solução reservatório contendo acetato de magnésio (16, 18, 20 ou 22 mM) e PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% ou 13%). Da mesma forma, coloque gotas suspensas em lamínulas silanizadas sobre placas de 24 poços e incube a 16 ° C.
    6. Deixe os cristais de proteína do complexo DgpA e DgpB / C crescerem até o tamanho máximo até que parem de crescer e, em seguida, transfira os cristais para uma solução de imersão contendo tampão reservatório e 5 mM dos compostos substratos (glicose e puerarina) do complexo DgpA e DgpB / C a 16 ° C por 30 min.
    7. Transfira os cristais, incluindo DgpA (com glicose ou sem substrato) e complexo DgpB/C (sem substrato), para uma solução crioprotetora contendo a condição tampão de imersão suplementada com 25% de glicerol e armazene-os imediatamente em nitrogênio líquido para coleta de dados.
      NOTA: Embora os cristais do complexo DgpA e DgpB / C tenham sido embebidos em substratos (glicose e puerarina), apenas a glicose foi incorporada com sucesso ao centro catalítico de DgpA. Consequentemente, três formas cristalinas distintas foram obtidas para análise estrutural: DgpA com glicose (Figura 3E); DgpA livre de substrato (Figura 3B-C); e complexo DgpB/C livre de substrato (Figura 3D). A solução crioprotetora protege os cristais de proteínas, evitando a formação de gelo durante o resfriamento instantâneo em nitrogênio líquido, preservando assim sua integridade estrutural e minimizando os danos induzidos pela radiação. Normalmente formulada usando o licor-mãe como base, a solução é complementada com concentrações otimizadas de crioprotetores (por exemplo, glicerol ou etilenoglicol).
  2. Coleta de dados e determinação da estrutura
    1. Colete os dados de difração de raios-X do cristal para DgpA com glicose ou em formas livres de substrato e complexo DgpB/C em forma livre de substrato na Instalação de Radiação Síncrotron de Xangai (SSRF) da Instalação Nacional de Ciência de Proteínas de Xangai (NFPS) com um comprimento de onda incidente de 0,978 Å.
    2. Processe os três conjuntos de dados de difração de raios X, incluindo DgpA e complexo DgpB/C, usando um software de processamento de dados cristalográficos31. Primeiro, carregue os dados brutos e, em seguida, execute sequencialmente as funções de índice, integração e escala clicando nos botões correspondentes no software. Gere um file de saída processado (output.sca) adequado para a determinação subseqüente da estrutura.
    3. Determine as estruturas de DgpA com glicose ou em formas livres de substrato (Figura 3B-C, 3E) e complexo DgpB / C em livre de substrato (Figura 3D) usando o método de substituição molecular (Tabela de Materiais). E, em seguida, refine as estruturas e os mapas de elétrons incorporando ligantes relevantes (como glicose, Mn2+, H2O, etc.)31.

3. Monitoramento da atividade de reação e determinação de parâmetros cinéticos

NOTA: O sistema DgpA / B / C medeia as transformações de glicosídeo C por meio de uma cascata definida em duas etapas: DgpA inicia a catálise oxidando a porção de açúcar, gerando um intermediário que o complexo DgpB / C subsequentemente cliva ou isomeriza 10,26,27. Neste estudo, DgpA/B/C refere-se às enzimas responsáveis por essa cascata de reação, embora deva ser observado que não ocorre interação direta entre DgpA e o complexo DgpB/C. Essa atividade acoplada pode ser rigorosamente quantificada usando três abordagens complementares: análise de produto HPLC, ensaios espectrofotométricos acoplados a DCPIP monitorando a transferência de elétrons ou caracterização cinética detalhada dos parâmetros de reação27,32. Especificamente, os produtos de clivagem do C-glicosídeo (daidzeína) gerados pela catálise de DgpA/B/C foram analisados por HPLC (detecção UV a 265 nm). A formação do produto foi quantificada usando uma curva de calibração padrão (o método para estabelecer a curva padrão é descrito em detalhes na nota da Etapa 3.3.2.), e os parâmetros cinéticos foram determinados ajustando as taxas de formação do produto ao modelo de Michaelis-Menten por meio de análise de regressão não linear27,32. O ensaio de inibição que mede o efeito da glicose na clivagem da ligação C-glicosídica da puerarina forneceu evidências corroborantes de que os sacarídeos podem servir como substratos para DgpA. Posteriormente, o ensaio DCPIP monitora as reações de oxidação do açúcar medindo a redução do 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) de cor azul a leuco-DCPIP incolor, pois aceita elétrons de açúcares oxidados33, refletindo assim a atividade catalítica do DgpA.

  1. Monitoramento da atividade DgpA/B/C por HPLC
    1. Conduza a reação de clivagem ou isomerização do glicosídeo C catalisado por DgpA / B / C em 500 μL de tampão F (Tabela 1) contendo 20 μM de complexo DgpA e DgpB / C (da Etapa 1.2.7) e 0,1 mM de: puerarina ou genisteína-8-C-glicosídeo para reações de clivagem, ou daidzina ou genistina para reações de isomerização27. Efectuar as reacções a 37 °C durante 8 h e terminá-las adicionando 1,5 ml de metanol à mistura de reacção.
    2. Centrifugue a solução de reação a 16.000 × g por 15 min para remover o precipitado de proteína formado devido à desnaturação enzimática induzida por metanol. Filtrar o sobrenadante com uma membrana filtrante de 0,22 μm.
    3. Realize a análise de HPLC com eluição gradiente, a uma taxa de fluxo de 1 mL / min com um volume de injeção de 10 μL e comprimento de onda de detecção de UV 265 nm.
      NOTA: As fases móveis foram acetonitrila (Fase Móvel A) e ácido acético aquoso a 0,1% (Fase Móvel B), com eluição gradiente. O gradiente da eluição da fase móvel é o seguinte: 5%-20% A em 0-5 min, 20%-45% A em 5-15 min, 45%-52% A em 15-18 min, 52%-55% A em 18-19 min, 55%-5% A em 19-21 min e 5% A em 21-23 min. O sistema enzimático DgpA / B / C exibe eficiências catalíticas marcadamente diferentes em relação a substratos como daidzina e genistina, resultando em variações substanciais em suas respectivas taxas de formação de produtos. Para avaliar quantitativamente a cinética de conversão do substrato e a dinâmica de acúmulo do produto, uma análise abrangente do curso de tempo foi realizada usando HPLC em intervalos de 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 e 48 h.
  2. Monitoramento da atividade de DgpA com ensaio de 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP)
    NOTA: O ensaio DCPIP monitora a oxidação do açúcar medindo a redução do DCPIP azul a leuco-DCPIP incolor, pois aceita elétrons de açúcares oxidados33. Aqui, o ensaio repórter DCIPIP foi utilizado para registrar a atividade de oxidação de DgpA em diferentes compostos glicosilados, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos. DgpA do tipo selvagem e seus mutantes defeituosos de ligação ao açúcar, incluindo D182A, Δ (308-316) e Δ (311-316) foram usados27.
    1. Incubar 0,8 mM de DCPIP, proteína de 50 μM, incluindo DgpA de tipo selvagem e seus três mutantes defeituosos de ligação ao açúcar (DgpA D182A, DgpA Δ (308-316) ou DgpA Δ (311-316)), com substratos de 10 mM, incluindo puerarina, vitexina, genistina, amido solúvel, maltotriose, lactose, sacarose, glicose ou maltose em 1x tampão PBS (pH 7,4).
    2. Após 20 h de reação, registre a mudança de absorbância do DCPIP a 600 nm usando um leitor de microplacas33.
  3. Determinação da taxa de inibição da glicose na reação de clivagem da ligação C-glicosídica de puérperas
    NOTA: DgpA pertence à família de enzimas da oxidorredutase do açúcar, capaz de oxidar a porção de açúcar dos C-glicosídeos. A Figura 3E demonstra que a glicose está ligada ao centro catalítico DgpA, e o protocolo para determinar a estrutura DgpA é detalhado na etapa 2.2.3. Para examinar a ligação competitiva de DgpA entre glicose e o C-glicosídeo puerarina, os seguintes experimentos foram conduzidos.
    1. Efectuar a reacção em 1 × tampão PBS (pH 7,4). Adicione diferentes concentrações de glicose (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM e 100 mM) ao sistema de reação de clivagem do glicosídeo C (puerarina) conforme descrito na etapa 3.1. Efectuar a reacção a 37 °C durante 12 h.
    2. Efectuar uma análise quantitativa do produto (daidzeína) utilizando a curva de calibração por HPLC para o composto de referência (daidzeína-padrão). Calcule a taxa de inibição determinando primeiro a diferença no rendimento do produto entre reações contendo concentrações variáveis de glicose e reações de clivagem de glicosídeo C desinibidas (sem glicose) e, em seguida, dividindo essa diferença pelo rendimento do produto da reação não inibida.
      NOTA: Para gerar uma curva de calibração para análise quantitativa de HPLC, prepare uma diluição em série de um padrão de referência (por exemplo, puerarina ou daidzeína) em uma faixa de concentração (por exemplo, 0,1-1 mM, em incrementos de 0,1 mM). Analise cada concentração por HPLC, registre as áreas de pico e plote-as em relação às concentrações padrão correspondentes. Realizar análise de regressão linear (y = mx + b, onde y = área de pico, x = concentração) para estabelecer a curva padrão. A equação de regressão pode então ser usada para interpolar concentrações de amostras desconhecidas de suas áreas de pico medidas.
  4. Determinação dos parâmetros cinéticos
    NOTA: Os parâmetros cinéticos são amplamente reconhecidos como padrões ouro críticos para avaliar quantitativamente a eficiência catalítica enzimática. Para avaliar quantitativamente as reações catalisadas por DgpA/B/C, foram determinados os parâmetros cinéticos para as reações de clivagem da puerarina do glicosídeo C catalisadas por DgpA/B/C.
    1. Prepare gradientes de concentração de C-glicosídeo (puerarina) do substrato (variando de 0,01 a 4 mM em incrementos de 2 vezes) para a reação de clivagem do glicosídeo C catalisada por DgpA / B / C.
    2. Efectuar a reacção a 37 °C durante 8 h de acordo com o método descrito no passo 3.1. Realizar análise quantitativa do produto (daidzeína) usando a curva de calibração HPLC da daidzeína padrão. Em seguida, calcule a taxa de reação (taxa de formação do produto) dividindo a quantidade quantificada pelo tempo de reação.
    3. Determine os parâmetros cinéticos Km e kcat ajustando a taxa de reação calculada e a concentração do substrato ao modelo Michaelis-Menten usando software estatístico (Tabela de Materiais).

4. Preparação e detecção do produto intermediário da reação

NOTA: Além da atividade de clivagem do glicosídeo C, o DgpA/B/C também catalisa a isomerização de O-glicosídeos em glicosídeos C. Portanto, quando os O-glicosídeos são usados como substratos para DgpA/B/C, os produtos intermediários serão produzidos como os C-glicosídeos isomerizados. Para caracterizar o produto intermediário (puerarina), o composto intermediário foi purificado e posteriormente analisado usando ferramentas de química analítica, incluindo LC-MS/MS e espectroscopia de RMN.

  1. Preparação do produto intermediário da reação na reação de isomerização de glicosídeo C catalisado por DgpA / B / C 27
    1. Preparar a reacção de isomerização de O-glicosídeo catalisada por DgpA/B/C utilizando 0,2 mM de O-glicosídeo (daidzina) como substratos e 20 μM de complexo DgpA e DgpB/C num volume de reacção de 90 ml, seguindo o protocolo descrito no passo 3.1 acima.
    2. Purificar o produto intermédio glicosídeo C (puerarina) utilizando uma HPLC preparativa de acordo com a estratégia de eluição gradiente (NOTA).
      NOTA: As fases móveis foram acetonitrila (Fase Móvel A) e ácido acético aquoso a 0,1% (Fase Móvel B), com eluição gradiente. O gradiente da eluição da fase móvel é o seguinte: 5%-20% A em 0-5 min, 20%-45% A em 5-15 min, 45%-52% A em 15-18 min, 52%-55% A em 18-19 min, 55%-5% A em 19-21 min e 5% A em 21-23 min.
    3. Calcular a concentração do produto intermédio purificado utilizando a curva HPLC de calibração padrão no passo 3.3.2, obter cerca de 6 mg de puerarina no sistema de reacção de 90 ml no passo 4.1.1 e, em seguida, secar os produtos intermédios purificados com um concentrador centrífugo a vácuo para utilização futura.
  2. Caracterização do produto intermediário da reação com LC-MS/MS
    1. Recolher os produtos intermédios secos do passo 4.1.3. Pese 100 μg dos intermediários derivados da daidzina e, em seguida, dissolva-os em 2 mL de metanol para atingir uma concentração final de 50 μg / mL. Centrifugue a 13.500 x g por 10 min e colete o sobrenadante para análise LC-MS/MS.
    2. Utilizar o mesmo programa de eluição de gradiente de HPLC no passo 4.1.2 para a análise de LC-MS/MS com um volume de injeção de 5 μL.
  3. Caracterização do produto intermediário da reação com RMN
    1. Dissolver 4 mg dos produtos intermédios purificados da reacção da daidzina em 340 μl de dimetilsulfóxido-d 6 para espectroscopia de RMN de 1H e 13C. Defina os parâmetros do instrumento da seguinte forma: temperatura a 298 K, calço 3 vezes, largura de pulso 18 μs, atraso de relaxamento 1.5 s, 48 varreduras, com outros parâmetros nas configurações padrão27.
    2. Colete os espectros de RMN 1H e 13C usando um instrumento de RMN de 600 MHz.

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Resultados

Seguindo os procedimentos descritos em Figura 1, primeiro expressamos os genes DgpA, DgpB e DgpC em E. coli BL21(DE3). Uma vez que DgpB e DgpC formam um complexo enzimático estável (complexo DgpB/C)10,26,27,34, as células que expressam essas duas proteínas foram combinadas para co-purificação. Após a lise celular, o sobrena...

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Discussão

Atualmente, as características estruturais e funcionais das enzimas do metabolismo do glicosídeo C no campo permanecem obscuras, e faltam métodos de pesquisa apropriados 10,24,26. Aproveitando as vantagens significativas da química e biotecnologia combinadas 40,41,42,43,44,45, o estudo propõe uma metodologia de pesquisa que utiliza biologia estrutural, enzimologia e outras téc...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este estudo é financiado com o programa de fundos de inicialização da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM) (90011451310011) para W.M., o programa de fundo de emergência contra COVID-19 da BUCM (1000061223476) para W.M., a equipe de inovação e o programa de cultivo de talentos da administração nacional da medicina tradicional chinesa (ZYYCXTD-C-202006) para W.M. e o projeto de pesquisa independente para estudantes de pós-graduação da BUCM(ZJKT2023012) para H.P. Agradecemos a todos os membros do laboratório Wenfu Ma pela discussão útil.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,6-dicloroindofenol (DCPIP)Solarbio Ciência e TecnologiaD6350
2-Mercaptoetanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 &vezes; Corante de Carga de ProteínaSangon BiotechC508320
Ácido AcéticoShanghai MACKLINA111247
AcetonitrilaThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz Espectrômetro NMRBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III Centrífuga 400 MHz
5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus CD espectrômetroApplied PhotophysicsChirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) células competentesThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteínaXangai Yuanye Bio-TecnologiaS31565
Genisteína-8-C-glicosídeoXangai Yuanye Bio-TecnologiaBP2095
GenistinXangai Yuanye Bio-TecnologiaS31591
GlicoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prisma 9GraphPad SoftwareVersão? Prisma 9Calcule os parâmetros cinéticos Km e kcat
HiLoad Superdex 200 pg colunas SEC preparativasCytiva28989335
HisTrap HP Colunas de purificação de proteínas de etiqueta Cytiva17524802
HiTrap Q FF coluna de cromatografia de troca aniônicaCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  versão 723
HPLC Coluna TC-C18(2), 170Å, 5 µ m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactoseSigma-Aldrich17814
LC-20AT, cromatografia líquida de alta eficiênciaShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
Cloreto de manganêsShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MetanolThermo Fisher Scientific™? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Ciência e TecnologiaN8110
Microscópio Estéreo Olympus SZX12OLYMPUS SZX7
fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)Sigma-AldrichP7626
PhenixA equipe de desenvolvimento do Phenix1.21.2O Phenix é um pacote de software abrangente para determinação da estrutura cristalina de proteínas, incorporando métodos SAD (Dispersão Anômala de Comprimento de Onda Único) e MR (Substituição Molecular) com o software Phaser.
Cromatógrafo líquido preparativo de alto desempenhoKit2545/2998
Hampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Incubadora de agitaçãoShanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd  ZQZY-AF8
Pele de Cobra™ Membrana de diálise, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Amido solúvelSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Superspeed CentrifugeThermo Fisher Scientific™
Leitor de Microplacas Multimodo SpectraMax i3xDISPOSITIVOS MOLECULARESSpectraMax i3x 
Especificações do Espectrofotômetro de Microvolume SpectraMax QuickDropDISPOSITIVOS MOLECULARESQuickDrop
SacaroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep ColumnWaters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Protease 1 semelhante à ubiquitinaThermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
Freezer de temperatura ultra baixaThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Concentrador centrífugo a vácuoBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
de Triagem de Cristais de Proteína Waters 75006590

Referências

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