Artigo de método

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

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DOI:

10.3791/67633

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7 de fevereiro de 2025

 , 
1Department of Physiology, Osaka Medical and Pharmaceutical University

Neste artigo

Resumo

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Resumo

A comunicação neuronal é mediada pela transmissão sináptica, que depende principalmente da liberação de neurotransmissores armazenados nas vesículas sinápticas (SVs) em resposta a um potencial de ação (PA). Como os SVs são reciclados localmente no terminal pré-sináptico, a coordenação da exocitose e endocitose do SV é importante para a transmissão sináptica sustentada. Uma proteína fluorescente verde sensível ao pH, chamada pHluorina, fornece uma ferramenta poderosa para monitorar a exo/endocitose do SV, direcionando-a para o lúmen do SV. No entanto, o rastreamento da reciclagem de SV orientada por AP com as sondas baseadas em pHluorina ainda é amplamente limitado a preparações de cultura in vitro porque a introdução de sondas geneticamente codificadas e imagens ópticas subsequentes é tecnicamente desafiadora em geral para modelos animais in vivo ou preparações de tecidos. O peixe-zebra é um sistema modelo que oferece recursos valiosos, incluindo facilidade de manipulação genética, clareza óptica e rápido desenvolvimento externo. Recentemente, geramos um peixe-zebra transgênico que expressa altamente uma sonda marcada com pHluorina nos terminais do neurônio motor e desenvolvemos um protocolo para monitorar exo/endocitose SV orientada por AP na junção neuromuscular (NMJ), um modelo de sinapse bem estabelecido que se forma in vivo. Neste artigo, mostramos como preparar a preparação de larvas de peixe-zebra NMJ adequada para imagens de pHluorin. Também mostramos que a preparação permite imagens de lapso de tempo sob microscópio de epifluorescência vertical convencional, fornecendo uma plataforma econômica para analisar a função da JNM.

Introdução

A transmissão sináptica, mediada pela liberação de neurotransmissores das vesículas sinápticas (SVs) no terminal pré-sináptico, é um processo fundamental subjacente à função nervosa1. Nos primeiros estudos, a transmissão sináptica foi medida principalmente por técnicas eletrofisiológicas que detectam a resposta pós-sináptica provocada por neurotransmissores e seus receptores. Nas últimas décadas, no entanto, vários tipos de técnicas de imagem foram desenvolvidos para visualizar diretamente a função pré-sináptica2. Uma das sondas mais utilizadas é uma proteína fluorescente verde sensível ao pH chamada pHluorin 3,4.

A reciclagem de vesículas sinápticas (SVs) no terminal pré-sináptico é um processo crucial para a transmissão sustentada de neurotransmissores5. Após a liberação de neurotransmissores por exocitose de SVs, cujo lúmen é geralmente mantido em pH ácido 6,7, as proteínas de membrana e SV são imediatamente recuperadas da membrana plasmática por endocitose. As SVs recém-formadas são então reacidificadas e os neurotransmissores são recarregados. Quando a pHluorina é direcionada para o lúmen SV fundindo-o à proteína SV, ela exibe fluorescência mínima no estado de repouso. No entanto, após a exocitose do SV, ele é exposto ao pH neutro no espaço extracelular, resultando em fluorescência brilhante. Posteriormente, a fluorescência diminui gradualmente após a reacidificação do SV. Portanto, a fluorescência de pHluorina permite o monitoramento dos processos de reciclagem de SV.

Em estudos pioneiros, a sinaptobrevin/VAMP 2, a proteína vesicular SNARE (receptor de proteína de ligação NSF solúvel) responsável pela fusão de vesículas sinápticas nas sinapses do prosencéfalo8 e a mais abundante entre as proteínas SV9, foi selecionada como parceira de fusão para a pHluorina, e a proteína de fusão resultante foi designada como sinaptopHluorin (SpH)3,4. No entanto, o SpH exibiu uma baixa relação sinal-ruído (S/N) devido à expressão superficial substancial da sonda. Portanto, outras proteínas SV foram testadas como parceiras transportadoras 10,11,12. Até o momento, os transportadores vesiculares demonstraram exibir a menor expressão de superfície 13,14,15. O uso dessas sondas foi inicialmente estabelecido em neurônios de mamíferos cultivados para rastrear a reciclagem de SV impulsionada por AP 8,9,10,11,12,13 e foi estendido a outras preparações, incluindo tecidos dissecados e animais in vivo 16,17,18,19,20,21,22.

O peixe-zebra larval é um sistema modelo com características valiosas, incluindo facilidade de manipulação genética, clareza óptica e rápido desenvolvimento externo. O peixe-zebra transgênico expressando pHluorina fundida à sinaptofisina, chamado SypHy, foi gerado e aplicado a várias configurações experimentais, por exemplo, monitoramento da fusão espontânea de SV de neurônios espinhais in vivo21, reciclagem de SV independente de AP em sinapses do tipo fita in vivo20,22 ou em células isoladas 23,24,25. No entanto, a aplicação de imagens de pHluorina da reciclagem de SV orientada por AP no modelo de peixe-zebra ainda é limitada.

A junção neuromuscular (NMJ) serve como um modelo atraente para estudar a fisiologia sináptica26, e vários estudos realizaram com sucesso a reciclagem de VS orientada por AP com SpH em camundongos 18,19. O uso de NMJs para reciclagem de VS em peixe-zebra foi iniciado por Wen et al.16. Recentemente, geramos peixes-zebra Tg que expressam altamente pHluorina marcada com um transportador GABA vesicular (VGAT) especificamente em neurônios motores27. Esta sonda também contém um HaloTag em conjunto com pHluorin na cauda luminal do VGAT e é, portanto, chamada de VpHalo. Embora o VGAT não seja expresso endogenamente em neurônios motores colinérgicos, confirmamos que o VpHalo se localiza em todos os pools de SV e é devidamente reciclado em resposta aos APs, combinando registro eletrofisiológico, marcação de SV dependente de atividade com ligantes HaloTag e imagens ao vivo de pHluorin27. Devido ao alto nível de expressão e uma fração superficial mínima de VpHalo, a preparação de NMJ a partir deste peixe Tg permitiu o monitoramento da reciclagem de SV impulsionada por AP com uma boa relação S/N. Além disso, a distribuição esparsa de NMJs no corpo transparente torna a microscopia confocal de varredura a laser desnecessária para esse fim. Embora o monitoramento da reciclagem de SV orientada por AP em peixe-zebra intacto seja a direção futura desejável, é de primordial importância estabelecer a preparação NMJ que seja adequada para validar o uso da sonda à base de pHluorina sob condições bem controladas, como foi feito em preparações cultivadas 3,4,10,11,12,13,14,15 . Aqui, descrevemos um protocolo de dissecação para preparar uma amostra NMJ de larva de peixe-zebra que pode ser usada para vários tipos de experimentos, por exemplo, registro de patch clamp de correntes de placa terminal, marcação HaloTag de SVs reciclados e imagem ao vivo de pHluorin, conforme discutido acima. Além disso, nos concentramos e fornecemos um protocolo detalhado para a imagem ao vivo de pHluorina usando esta preparação NMJ sob um microscópio epifluorescente convencional equipado com um dispositivo de estimulação elétrica e um sistema de perfusão de solução.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais na Universidade Médica e Farmacêutica de Osaka. Os peixes-zebra foram criados e mantidos sob um ciclo de 14 h de luz a 10 h de escuridão. Os embriões e larvas foram mantidos a 28-30 °C em água de ovo contendo 0,006% de sal marinho e 0,01% de azul de metileno. Os experimentos foram conduzidos em 4-7 dias pós-fertilização (dpf). Recomenda-se que os peixes sejam alimentados duas vezes ao dia a partir de 5 dpf, quando os experimentos forem realizados após 6 dpf. O meio deve ser trocado antes de cada mamada.

1. Preparação das soluções

  1. Prepare 200 mL de solução extracelular (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM de glicose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,3-7,4). Misture 6,4 mL de NaCl 3,5 M, 0,4 mL de KCl 1 M, 1 mL de HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 mL de CaCl1 M 2, 0,2 mL de 1 M MgCl2 e 360 mg de glicose e adicione água ultrapura a 200 mL. Se o pH estiver fora da faixa de 7,3-7,4, ajuste-o com 1 M NaOH. Use a solução extracelular recém-preparada para cada experimento.
  2. Prepare 100 mL de solução extracelular contendo 3 μM de D-tubocurarina (D-TBC). Adicione 20 μL de solução estoque de D-TBC a 15 mM a 100 mL de solução extracelular.
    NOTA: A solução-mãe de D-TBC é preparada em água e armazenada a -20 °C.
    CUIDADO: Use luvas e faça preparações no capuz ao manusear o pó D-TBC. Luvas também são recomendadas ao manusear a solução D-TBC.
  3. Prepare 25 mL de solução extracelular contendo tricaína a 0,02% (MS-222). Adicione 0,5 mL de solução estoque de tricaína a 1% a 25 mL de solução extracelular.
    NOTA: A solução-mãe de tricaína é preparada em água e armazenada a 4 °C. A tricaína é usada apenas para dissecação, não durante a imagem.

2. Preparação do eletrodo bipolar a partir do capilar de vidro

  1. Puxe os capilares de vidro usando o extrator de micropipeta de modo que o diâmetro da ponta fique na faixa de 3-10 μm (Figura 1A).
    NOTA: Recomendamos um protocolo com duas ou mais etapas para puxar o capilar.
  2. Conecte a pipeta de vidro (1.17 mm de diâmetro interno com 0.165 mm de espessura do septo) ao Isolador de Estímulo. Encha a pipeta com a solução extracelular. Insira um fio de platina fino (0.1 mm de diâmetro) em cada abertura do capilar de vidro e conecte a extremidade traseira do fio ao isolador de estímulo (Figura 1B). Tenha cuidado para não causar curto-circuito nos dois fios de platina.

3. Preparação da amostra

NOTA: Este protocolo foi otimizado para uso com larvas de peixe-zebra Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo)27, nas quais as duas proteínas a seguir, ligadas por um peptídeo de clivagem P2A, foram expressas bicistronicamente especificamente em neurônios motores: uma proteína fluorescente vermelha repórter TagRFP e uma proteína sensor VpHalo, que é uma proteína de fusão de pHluorin e HaloTag para a parte luminal do VGAT (Figura 2A). O promotor hb9 impulsiona a expressão do tTAad (transativador controlado por tetraciclina avançado), que por sua vez induz a expressão dos genes sob o promotor composto do elemento de resposta à tetraciclina (TRE). O sistema de expressão induzível por Tet aumenta o nível de expressão de proteínas. O pHluorin permite o monitoramento ao vivo da reciclagem de SV dependente da atividade, enquanto o HaloTag visualiza SVs reciclados durante um determinado período, marcando covalentemente a proteína fundida ( Figura 2A ). Embora ambos os métodos tenham vantagens únicas, neste artigo nos concentramos na imagem de pHluorina.

  1. Despeje 25 mL de solução extracelular contendo 0,02% de tricano na placa de Petri de vidro.
  2. Para dissecação, transfira uma larva para a placa de Petri. Descasque a pele da larva com duas pinças finas. Use a primeira pinça para manter a larva no lugar e aperte a pele do lado dorsal da bexiga natatória com a outra pinça (Figura 3A).
  3. Remova a bexiga natatória, os órgãos internos e a cabeça com bisturis. A pele de ambos os lados do corpo do peixe pode ser removida simultaneamente, veja o Vídeo 1.

4. Colocação da amostra na câmara de imagem e inserção do eletrodo estimulante

NOTA: Como o pH luminal em repouso do SV está abaixo de pH 6,0, a fluorescência da pHluorina em NMJs em peixes vivos é quase inobservável (Figura 2B). No entanto, quando o lúmen SV foi alcalinizado, observou-se localização restrita de VpHalo às JNMs (Figura 2C). Notavelmente, a imagem confocal da pilha z das JNMs mostrou que elas não se sobrepunham no plano xy, exceto nas bordas dos segmentos do corpo (Figura 2C). Com base nessa observação, postulamos que o microscópio de epifluorescência era aplicável para imagens ao vivo de VpHalo em larvas de peixe-zebra, o que foi validado conforme detalhado no protocolo a seguir.

  1. Transfira a amostra para a câmara de imagem (Figura 3B) usando uma pipeta Pasteur de vidro com uma ponta polida a fogo. Fixe mecanicamente a amostra com um fio de náilon colado a um fio de platina em forma de C de modo que fique orientado em um ângulo aproximadamente paralelo ao eletrodo de estimulação. (Figura 3C).
    NOTA: Um fio de platina em forma de C com um fio de náilon foi fabricado em laboratório. Aproximadamente 1 cm de fio de platina de 0,5 mm de diâmetro foi formado em forma de C e batido com um martelo para achatá-lo. O fio de nylon pode ser obtido de utensílios domésticos. Colamos o fio de náilon, que foi obtido desmontando um escorredor de cozinha disponível em uma mercearia. Um dispositivo de fixação semelhante é usado rotineiramente no experimento de corte de cérebro28.
  2. Perfundir continuamente a amostra com uma solução extracelular contendo 3 μM D-TBC a uma taxa de aproximadamente 1,0 mL / min usando um sistema de perfusão por fluxo por gravidade.
    NOTA: Recomenda-se que a temperatura da câmara seja controlada usando um aquecedor de solução em linha.
  3. Insira o eletrodo de estimulação na medula espinhal. Segure o eletrodo preparado a partir da pipeta de vidro na etapa 2 no porta-pipetas equipado com o micromanipulador motorizado. Insira o eletrodo na amostra de forma que a ponta fique perto dos neurônios motores espinhais, que estão localizados no lado ventral da medula espinhal e podem ser identificados como neurônios positivos para TagRFP nesta amostra (Figura 3D). Avance o eletrodo em um ângulo oblíquo do segmento adjacente até a posição alvo.
    NOTA: O limite entre os segmentos do corpo é denso e difícil de penetrar, por isso é necessário pressionar o eletrodo lentamente. A posição da ponta do eletrodo é muito importante. Se estiver distante da medula espinhal, estimula os músculos adjacentes diretamente, resultando em uma grande imagem à deriva na imagem de lapso de tempo subsequente.

5. Aquisição de imagem

  1. Selecione a região de imagem. Com base na imagem ao vivo da fluorescência TagRFP, selecione uma região de imagem que inclua mais do que alguns botões e exclua aqueles no limite do segmento corporal (Figura 2C e Figura 4A). Escolha a região dentro do mesmo segmento corporal do eletrodo de estimulação porque a inervação do neurônio motor é limitada em um único segmento corporal29,30. Troque a unidade de filtro de fluorescência por fluorescência GFP/pHluorin.
    NOTA: Nesta configuração experimental, a pHluorina foi fotografada com filtros de excitação de 470/40 nm e emissão de 510/20 nm. O TagRFP foi fotografado com excitação de 555/20 nm e filtros de emissão de 595/44 nm. O software Micro-Manager é usado para controlar simultaneamente a aquisição de imagens com uma câmera cMOS científica e o obturador TTL da fonte de luz LED. Para sincronizar a aquisição de imagens e a estimulação elétrica, o Arduino é usado como um dispositivo de E/S digital. Outra opção que não requer um script é usar o Digidata e seu software da Molecular Devices.
  2. Determine a configuração do software de aquisição de imagem e do dispositivo de E/S digital para que a aquisição de imagem e a estimulação elétrica sejam sincronizadas. Otimize a exposição e a intensidade da fonte de luz para adquirir uma imagem suficientemente brilhante em um modo de lapso de tempo de 1 Hz sem saturação e insira o tempo de exposição no campo Exposição [ms] da janela principal do Micro-Manager.
  3. Determine a frequência de estimulação, o número de potenciais de ação (APs) e o tempo entre o início da aquisição da imagem e a entrega da estimulação, codificando-os no script Arduino. Dependendo dos parâmetros, determine o número de imagens adquiridas correspondente ao comprimento total da aquisição da imagem e insira-o no campo Contagem da janela Aquisição Multidimensional do Micro-Manager. Defina 1 s no campo Intervalo para obter imagens de lapso de tempo de 1 Hz. Para estimulação elétrica, forneça pulsos de tensão constante de 1 ms (70 mV) através do isolador de estímulo.
  4. Execute a aquisição de imagens. Execute o comando digitalizador e execute a aquisição de imagem. Verifique se não há desvio de imagem inaceitável e se as respostas de pHluorina podem ser observadas. Caso contrário, a posição do eletrodo está incorreta. Retorne à etapa 4.2.
    NOTA: Danos teciduais que podem afetar potencialmente a resposta da pHluorina podem ser facilmente identificados pela imagem DIC das fibras musculares. Se nenhuma resposta de pHluorina for observada na ausência de tal dano, o posicionamento do eletrodo pode estar incorreto. Isso pode ser identificado como grande desvio de imagem porque o posicionamento inadequado do eletrodo causa contração muscular, conforme descrito na etapa 4.2. O outro problema que às vezes resulta em falha em induzir a resposta da pHluorina é o ar preso no capilar de vidro, o que leva ao isolamento elétrico do eletrodo. A contração muscular devido ao posicionamento incorreto do eletrodo causa desvio de imagem no eixo Z, que não pode ser corrigido em análises de imagem subsequentes (consulte a etapa 6.5). Portanto, recomenda-se que os dados com grandes desvios de imagem sejam identificados durante a aquisição da imagem e excluídos.
  5. Dependendo do objetivo do experimento, altere a intensidade da estimulação (ou seja, frequência e número de pulsos) e/ou temperatura. Salve as imagens de lapso de tempo como uma pilha de séries temporais de imagens TIFF. Veja o vídeo 2.

6. Análise de imagem

NOTA: Use Fiji para executar o seguinte processamento e análise de imagem. Use o Microsoft Excel ou software de planilha semelhante para calcular os resultados da medição. Use o Igor Pro para realizar o ajuste da curva no resultado obtido.

  1. Crie uma imagem de diferença que destaque as sinapses ativas, conforme descrito abaixo.
    1. Abra a pilha de imagens de séries temporais em Fiji escolhendo Arquivo > Abrir. Se as imagens exibidas estiverem esmaecidas, escolha Imagem >Ajustar >Brilho/Contraste >Automático. Não clique em Aplicar, pois isso redimensionará a intensidade do sinal, impossibilitando uma análise mais aprofundada. Escolha Analisar > Definir escala e insira o fator de calibração definido na condição de imagem.
    2. Crie uma pilha de cinco imagens tiradas durante o período de pré-estímulo selecionando Imagem > Duplicar e inserindo um número apropriado que indique o intervalo da sequência de imagens (por exemplo, 11-15 para o experimento com um período de pré-estímulo de 15 s).
    3. Selecione Pilhas de > de imagem > projeto Z e selecione Intensidade média no menu suspenso Tipo de projeção. Pressione OK para criar uma imagem representativa do período pré-estímulo (Figura 4B). O processo de média é importante para reduzir o efeito das flutuações de sinal.
    4. Crie uma imagem média do período pós-estímulo usando processamento semelhante (Figura 4B). Duplique uma pilha de cinco imagens imediatamente após o final da estimulação (por exemplo, a 26-30ª imagem para o período pré-estímulo de 15 s e o experimento do período de estímulo de 10 s). Selecione Processar > Calculadora de Imagens e defina a imagem média pré-estímulo e a imagem média pós-estímulo como Imagem 1 e Imagem 2 nos menus suspensos, respectivamente.
    5. Selecione Subtrair no menu suspenso Operação e pressione OK para criar uma imagem de diferença que destaque as sinapses ativas (Figura 4B).
  2. Defina as regiões de interesse (ROIs) a serem analisadas.
    1. Selecione Editar > Seleção > Especifique e crie um ROI circular de 7 μm de diâmetro na imagem de diferença criada na etapa 6.1. Coloque o ROI na sinapse ativa destacada e pressione T para adicionar o ROI no ROI Manager. No resultado representativo mostrado na Figura 4C-D, 6 ROIs foram posicionadas ao redor dos botões.
    2. Posicione outras 5 ROIs do mesmo tamanho em regiões onde nenhum aumento de sinal é observado. Use sua fluorescência média como sinal de fundo na próxima etapa. Salve os ROIs selecionando Mais >Salvar no menu Gerenciador de ROI.
  3. Meça a intensidade do sinal e calcule a mudança substancial na fluorescência.
    1. Selecione a pilha de séries temporais original e transfira os ROIs salvos na etapa 6.2 para a pilha. Selecione Analisar > Definir Medidas e marque apenas a caixa de seleção Valor médio de cinza. Meça a intensidade média de fluorescência nos ROIs em todos os pontos de tempo selecionando Mais > Medida múltipla no menu Gerenciador de ROI.
    2. Copie todos os valores na janela Resultados e cole-os em um programa de planilha. Calcule o sinal de fundo médio das 5 ROIs de fundo e subtraia-o de cada ROI sináptico, o que fornece uma mudança substancial de fluorescência em cada botão (Figura 4D). Calcule a média de todos os dados de uma única visualização (neste caso, 6 boutons), contados como n = 1 experimento. Na Figura 4E, cada traço obtido pela média é representado como F / F0 , dividindo o valor em todos os pontos de tempo pelo valor médio durante o período inicial da linha de base.
  4. Estime a constante de tempo de decaimento de fluorescência (tau) por ajuste de curva.
    1. Abra uma nova tabela de dados no Igor Pro selecionando Janela > Nova Tabela. Copie os dados do ponto de tempo e F / F0 da planilha e cole-os na tabela em uma linha diferente. Escolha Janela > Novo gráfico, selecione os dados F/F0 como Onda Y e os dados do ponto de tempo como Onda X e pressione Do It para criar um gráfico.
    2. Escolha Janela > Mostrar informações e defina o intervalo de dados a serem analisados colocando um cursor no pico do sinal e o outro no final do rastreamento. Escolha Análise > Ajuste de curva e selecione exp_XOffset no menu suspenso Função e as Ondas X e Y apropriadas no menu suspenso Onda.
    3. Clique em Opções de dados e pressione o botão Cursores para definir o intervalo de ajuste da curva. Clique em Coeficientes, insira 1 para Y0 e pressione Fazer. O ajuste da curva por este procedimento fornece um valor tau que representa a taxa de decaimento da fluorescência, que reflete as taxas de endocitose e reacidificação do SV.
  5. Execute a correção manual de desvio (opcional) conforme descrito abaixo.
    1. Se ocorrer desvio de imagem e o ponto selecionado se mover para fora do ROI de 7 μm de diâmetro durante o período de aquisição da imagem, execute o plug-in de correção de desvio manual. Abra a pilha de imagens de série temporal em Fiji selecionando Arquivo > Abrir. Selecione a ferramenta Ponto clicando na barra de ferramentas Ponto.
    2. Encontre o bouton mais brilhante como um ponto de referência e coloque um ponto no centro dele. Pressione T para adicionar o ponto ao gerenciador de ROI. Repita esse processo para toda a sequência de imagens. Exiba a primeira imagem e selecione Plug-ins > Registro > Correção manual de desvio. Salve a pilha de séries de imagens corrigidas como um novo arquivo e use-a para análise.
      NOTA: Embora o desvio XY possa ser corrigido, o desvio Z excessivo não pode ser corrigido com este método.

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Resultados

Se a amostra dissecada for preparada sem danos graves ao tecido e o eletrodo de estimulação for inserido adequadamente na medula espinhal, uma resposta robusta de pHluorina pode ser obtida por estimulação elétrica de alta frequência ( Figura 4D , E ). A fluorescência basal pré-estímulo foi provavelmente devido à sonda presente na superfície da pré-sinapse. O aumento da fluorescência durante a estimulação reflete a liberação exocitótica da sonda para a superfície. O decaiment...

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Discussão

A larva de peixe-zebra NMJ é um sistema modelo emergente para o estudo da fisiologia e patologia sináptica26,31. Um peixe-zebra transgênico expressando SpH de maneira neuroespecífica já foi gerado e empregado para a análise de um mutante exibindo um defeito locomotor17. Wen et al.17 demonstraram um aumento de aproximadamente 2 vezes na fluorescência da pHluorina durante a estimulaçã...

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Divulgações

Nenhum conflito de interesse é declarado.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI Grant 18K06882 para F. O.; e Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI Grant 21K06429 e 24K10020 para Y.E.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Objetiva de imersão em água 40xOlympusLUMPLFLN40XW sistema de
perfusão de fluxo gravitacional de 4 canaisALAVCPlus-4G
Objetiva de 5xOlympusNPLN5X
Câmara de imagem feita por clientePhysiotechcustum feitoUma placa de acrílico preto (10,7 cm de diâmetro, 3 mm de espessura) com um poço (1 cm de diâmetro na parte inferior, 1,5 cm de diâmetro na parte superior) segurando aproximadamente 0,5 ml de perfusato. 
Dispositivo de E/S digitalArduinoUno Rev3
D-Tubocurarina dicloreto pentahidratadoSigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
Pinça finaAsOne7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipetaIWAKIIK-PAS-5PA ponta deve ser aparada e polida até que o diâmetro final seja 1,5; 2 mm. 
Placa de Petri de vidroAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
Aquecedor de solução em linhaWarner InstrumentsSF-28
Sistema de iluminação LEDX-cyteXYLIS
Azul de metilenoWako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
Mini braçadeira magnética para tubo de perfusãoWarner Instruments64-1553
Micromanipulador motorizadoScientificaPatchStar
Placa de amostra móvel motorizadaScientificaMMSP
Suporte de pipetaNarishigeH-13
Extrator de pipetasNarishigePC-100
Fio de platina (φ 0.1mm)NilacoPT-351165
Fio de platina (φ 0,5 mm)NiacoPT-351381
BisturiAsOne8-3086-02 (Pena # 11)
Câmera cMOS científicaThorlabsCC215MU
sal marinhoNAPQOMicroscópio estéreo oceânico
OlympusSZX7
Estímulo isolaterAMPIISO-FLEX
Tubo de sucçãoWarner InstrumentsST-3, 64-1406
Controlador de temperaturaWarner InstrumentsTC-324C
Capilar de vidro ThetaSutter InstrumentBT-150-10
Tricaína (MS-222)TCIT0941
Microscópio verticalOlympusBX51WI
instantâneo

Referências

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206(2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245(2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936(2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503(2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

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