Artigo de método
O metabolismo plaquetário é de interesse, particularmente no que se refere ao papel da hiper e hipoatividade plaquetária no sangramento e distúrbios trombóticos. O isolamento de plaquetas do plasma é necessário para alguns ensaios metabólicos; Apresentamos aqui um método para isolamento de metabólitos intracelulares de plaquetas lavadas.
As plaquetas são células sanguíneas que desempenham um papel fundamental na hemostasia e na resposta imune inata. A hiper e hipoatividade plaquetária têm sido implicadas em distúrbios metabólicos, aumentando o risco de trombose e sangramento. A ativação plaquetária e o metabolismo estão intimamente ligados, com os numerosos métodos para medir o primeiro, mas relativamente poucos para o segundo. Para estudar o metabolismo plaquetário sem a interferência de outras células sanguíneas e componentes plasmáticos, as plaquetas devem ser isoladas, um processo que não é trivial devido à sensibilidade ao cisalhamento das plaquetas e à capacidade de ativação irreversível. Apresenta-se aqui um protocolo de isolamento plaquetário (lavagem) que produz plaquetas quiescentes sensíveis à estimulação por agonistas plaquetários. Etapas sucessivas de centrifugação são usadas com a adição de inibidores plaquetários para isolar as plaquetas do sangue total e ressuspendê-las em um tampão issomótico controlado. Este método produz reprodutivelmente 30% a 40% de recuperação de plaquetas do sangue total com baixa ativação, medida por marcadores de secreção de grânulos e atividade de integrina. A contagem de plaquetas e a concentração de combustível podem ser controladas com precisão para permitir que o usuário investigue uma variedade de situações metabólicas.
As plaquetas são células pequenas (2–4 μm de diâmetro) e anucleadas que desempenham um papel importante na hemostasia, o processo rigidamente regulado de formação de coágulos1. Embora vitais para a integridade vascular, as plaquetas também estão implicadas em eventos adversos à saúde. As plaquetas estão envolvidas na trombose venosa profunda (TVP) e na trombose arterial (TA), que são coágulos que obstruem os vasos sanguíneos, levando à diminuição do suprimento sanguíneo localmente, ou, se pedaços do coágulo se romperem (embolizarem), podem bloquear o suprimento de sangue para os pulmões, coração ou cérebro
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O estudo recebeu a aprovação do Conselho de Revisão Institucional do Campus Médico Anschutz da Universidade do Colorado. O consentimento por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Os participantes relataram que não consumiram álcool nas últimas 48 horas ou anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) nos últimos dez dias. Este projeto é apoiado pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão R61HL141794.
1. Coleta de sangue
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Os resultados representativos na Figura 2 representam 6 doadores de sangue diferentes, incluindo 3 homens e 3 mulheres. O rendimento plaquetário em relação ao sangue total é mostrado na Figura 2A. A recuperação plaquetária final foi em média de 52% ± 3% (desvio-padrão, n=6). A contagem final de plaquetas em comparação com a contaminação dos glóbulos brancos foi medida usando um analisador hematológico automatizado. A contagem de glóbulos brancos foi inferior a 0.......
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As plaquetas são muito sensíveis ao seu ambiente, incluindo estresse de cisalhamento e presença de agonistas38,39. Isso torna as plaquetas difíceis de manusear e isolar, tornando crucial o uso de inibidores e pipetas de calibre largo40. O armazenamento e a preparação adequados da IGP2 são vitais, uma vez que a não preparação da IGP2 no PBS básico resultará numa rápida degradação da IG.......
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Os autores não têm conflito de interesse a relatar.
Os autores gostariam de agradecer à Dra. Emily Janus-Bell e Clarisse Mouriaux do laboratório do Dr. Pierre Mangin e Katrina Bark do laboratório do Dr. Jorge DiPaola por sua orientação e conselho.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ Tubo Spin-X com filtro | M Millapore-Sigma | CLS8160 | Preparação de reagentes |
| Agulha de 19 G x 3/4" | McKesson Corporation | 448406 | Flebotomia |
| 21 G Agulha de 1,5 polegada com trava | luer | Amazon B0C39PJD23 | Preparação de reagentes |
| Placa de 96 poços, meia área | Greiner Bio-One | 675101 | Citometria de fluxo |
| ACD-A vaccutainers | de | Flebotomia | 364606 Fisher |
| Scientific | McKesson Corporation | 609 | Flebotomia |
| Cotonete com álcool | VWR | 15648-916 | Flebotomia |
| Apirase de batatas | Sigma | A6410-100UN | Reagente preparação |
| CD42a Anticorpo monoclonal | Thermo Fisher Scientific | 48-0428-42 | Citometria de fluxo |
| gelada microcentrífuga | ThermoFisher Scientific | 75002441 | Têmpera |
| D-Glicose | Sigma | G7021 | Reagente de preparação |
| FITC Anti-Fibrinogênio anticorpo | Abcam | 4217 | Citometria de |
| fluxo Citômetro de fluxo | Beckman Coulter | 82922828 | Gaze de citometria de fluxo |
| VWR | 76049-110 | Flebotomia | |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G5516 | Preparação de reagentes |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | Preparação de reagentes |
| Alfa-trombina humana | Prolytix | HCT-0020 | Citometria |
| de fluxo KCl | Sigma Aldrich | P9333 | Preparação de reagentes |
| KH2PO4Sigma | Aldrich | P5655 | Preparação de reagentes |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Tubos de microcentrífuga | VWR | 87003-292 | Geral |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | Preparação de reagentes |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Preparação de reagentes |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Preparação de reagentes |
| Pipeta de transferência de furo estreito | VWR | 16001-176 | Lavagem de plaquetas |
| Solução de paraformaldeído, 4% em PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Citometria de fluxo |
| PECy5 Ratinho Anti-Human CD62P | BD Pharmingen | 551142 | Citometria de fluxo |
| Tampa da placa | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | Citometria de fluxo |
| Polipropileno 15 mL tubos cônicos | VWR | 89039-658 | Preparação de reagentes |
| Polipropileno 50 mL tubos cônicos | VWR | 352070 | Lavagem de plaquetas |
| Prostaglandina I2 (sal de sódio) | Cayman Chemical | 18220 | Preparação de reagentes |
| SKC Inc. C-Chip Hemocitômetros descartáveis | Seringa | de contagem de células | 22-600-100 |
| BD Pharmingen | 14-823-41 | Preparação | |
| de reagentesTorniquete | VWR | 76235-371 | Flebotomia |
| Porta-agulha Vacutainer | BD | 364815 | Flebotomia |
| Vórtice | VWR | 102091-234 | Preparação de reagentes |
| Banho-maria | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | Lavagem de plaquetas |
| Pipeta de transferência de furo largo | VWR | 76285-362 | Lavagem de plaquetas |
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