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Artigo de método

Avaliação da fagocitose microglial de detritos de mielina in vitro sob estimulação magnética repetida

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DOI:

10.3791/67642

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17 de junho de 2025

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1Department of Rehabilitation Medicine, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 2Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Children's Rehabilitation, Linyi People's Hospital, 4Department of Endocrinology, People's Hospital of Dongxihu District, 5Department of Rehabilitation, Hengyang Medical School, The First Affiliated Hospital, University of South China

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo foi desenvolvido para avaliar o efeito da estimulação magnética repetitiva na capacidade da micróglia de fagocitar detritos de mielina. Um sistema de co-cultura de microglia in vitro e detritos de mielina foi estabelecido para isso.

Resumo

A microglia, os fagócitos residentes do sistema nervoso central (SNC), desempenham um papel fundamental na manutenção da integridade e homeostase do SNC, removendo células danificadas, detritos celulares e remanescentes de mielina. O acúmulo de detritos de mielina está implicado em uma série de distúrbios do SNC, incluindo esclerose múltipla, doença de Alzheimer, lesão cerebral traumática e lesão da medula espinhal. A presença de detritos de mielina não apenas exacerba a neuroinflamação, mas também dificulta o potencial regenerativo da mielina. Portanto, aumentar a capacidade da microglia de limpar os detritos de mielina por meio da fagocitose representa uma estratégia terapêutica promissora. A estimulação magnética surgiu como uma modalidade de tratamento inovadora para doenças do SNC, com evidências crescentes sugerindo seu potencial para promover a fagocitose microglial e apoiar a recuperação do SNC. Para elucidar ainda mais os efeitos da estimulação magnética na depuração microglial de detritos de mielina, projetamos um experimento in vitro envolvendo a co-cultura de microglia e detritos de mielina. A co-cultura foi submetida a estimulação magnética repetitiva para avaliar seu impacto na atividade fagocítica microglial no contexto da patologia do SNC.

Introdução

A mielina é uma estrutura de membrana tubular estável que envolve os axônios produzidos por oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC). Esta bainha de mielina desempenha um papel crítico na facilitação da propagação rápida e eficiente dos potenciais de ação1. No entanto, vários distúrbios neurológicos, como esclerose múltipla (EM), acidente vascular cerebral e lesões traumáticas, incluindo lesão medular (LM) e lesão cerebral traumática (TCE), podem levar à perda da integridade da mielina. Isso resulta na geração de detritos de mielina devido à ruptura da bainha de mielina e danos diretos às estruturas de mielina 2,3,4. O acúmulo de detritos de mielina não apenas impede a remielinização e a recuperação funcional, mas também exacerba a neuroinflamação 5,6. Portanto, a depuração eficaz dos detritos de mielina é essencial para resolver a neuroinflamação, promover a regeneração axonal e restaurar a homeostase no sistema nervoso após doenças neurológicas.

Os detritos de mielina são eliminados principalmente por fagócitos, como macrófagos e micróglia no sistema nervoso central (SNC). A microglia, as células imunes residentes do SNC, examina constantemente seu ambiente em busca de ameaças potenciais e protege o SNC removendo mielina danificada e detritos de mielina. Além disso, a fagocitose microglial desempenha um papel crucial na promoção da neurogênese por meio da eliminação de detritos 7,8. Evidências crescentes sugerem que o aumento da fagocitose microglial de detritos de mielina pode mitigar os efeitos nocivos da inflamação, reduzir os danos ao SNC e promover a regeneração axonal após lesão nervosa. 4,9,10.

A terapia de estimulação magnética, uma técnica de neuromodulação não invasiva, ganhou ampla utilização no tratamento de vários distúrbios neurológicos11. Notavelmente, a estimulação magnética transcraniana repetida (EMTr) mostrou-se promissora como uma abordagem terapêutica para a doença de Alzheimer (DA), lesão cerebral e acidente vascular cerebral 12,13,14. Um estudo recente demonstrou que a EMTr pode aumentar a fagocitose microglial da beta-amiloide (Aβ) e da apolipoproteína E (ApoE), inibindo assim a progressão patológica da DA em modelos animais15. Da mesma forma, nosso trabalho recente descobriu que a estimulação magnética transespinhal repetida (rTSMS) promove fagocitose microglial de detritos de mielina após lesão medular em ratos16.

No entanto, o impacto da estimulação magnética repetitiva na microglia tem sido predominantemente comprovado por meio de modelos experimentais em animais 17,18,19. De fato, a estimulação magnética demonstrou modular a excitabilidade neuronal por meio da indução de correntes20. Consequentemente, não se pode desconsiderar que a interação entre neurônios e microglia pode influenciar a função da micróglia. Consequentemente, a experimentação in vitro é necessária para verificar se o impacto da estimulação magnética na microglia é independente da alteração na excitabilidade neuronal. Estudos recentes identificaram um efeito modulatório da estimulação magnética repetitiva na microglia em modelos experimentais. Alguns estudos demonstraram que a estimulação magnética repetitiva poderia promover a polarização da micróglia em direção a M219,21. No entanto, uma exploração mais aprofundada de sua função de microglia ainda precisa ser elucidada. Notavelmente, Amelie Eichler et al. intervieram em fatias de tecido cerebral in vitro usando estimulação magnética de 10 Hz e descobriram que a estimulação magnética de 10 Hz foi capaz de promover a liberação de citocinas da microglia para influenciar a excitabilidade neural e a plasticidade22. Embora este estudo tenha expandido a compreensão dos efeitos da estimulação magnética na microglia, é necessária uma investigação mais aprofundada no nível celular para elucidar completamente seus mecanismos.

Assim, estabelecemos um protocolo para verificar se a estimulação magnética pode promover a fagocitose de detritos de mielina in vitro. Ao contrário dos detritos de mielina após doença ou dano tecidual, que é um produto de lesão, os detritos de mielina usados neste experimento têm a forma da bainha de mielina depois que ela se decompõe. Além disso, o conceito de detritos de mielina é um produto da desintegração da mielina. Como as principais células fagocíticas do cérebro, a microglia desempenha um papel fundamental na eliminação de células danificadas e detritos de mielina23, que está associada a doenças como esclerose múltipla e Alzheimer24,25. O acúmulo de detritos de mielina demonstrou exacerbar a neuroinflamação e dificultar a regeneração26. O objetivo do estudo é investigar o potencial da estimulação magnética para aumentar a fagocitose microglial de detritos de mielina, reduzindo assim a neuroinflamação e apoiando a recuperação do SNC em condições neurodegenerativas e traumáticas. Em resumo, o estudo emprega uma abordagem de co-cultura, em que a microglia é co-cultivada com detritos de mielina e a estimulação magnética repetida é realizada para verificar o efeito da estimulação magnética repetitiva na capacidade fagocítica da micróglia.

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Protocolo

Aqui, três ratas SD (com idades entre 2-3 semanas) foram usadas para extrair detritos de mielina por centrifugação com gradiente de sacarose. Todos os ratos foram comprados do Animal Core Facility da Nanjing Medical University, Nanjing, China (licença animal: SYXK (Su) 2021-0023). Todos os ratos foram criados em condições de controle (temperatura de 22 ± 2 °C, período claro/escuro de 12 h/12 h, 55% ± 5% de umidade relativa). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing (No. IACUC-1903031 e No. IACUC-2005001) e tiveram como objetivo minimizar o sofrimento e o número de animais utilizados.

1. Isolamento de mielina

NOTA: Os detritos de mielina foram extraídos conforme descrito anteriormente, e algumas modificações foram feitas27. Certifique-se de que todas as etapas foram executadas a 4 °C e em condições estéreis.

  1. Isolamento da mielina bruta
    1. Extração de tecido cerebral
      1. Após a anestesia com pentobarbital (50 mg / kg, injeção intraperitoneal), avalie a profundidade da anestesia pela resposta de pinça do dedo do pé. Decapite as ratas fêmeas. Disseque toda a cabeça no gelo e corte o crânio com uma tesoura para expor totalmente o cérebro e facilitar a remoção de todo o cérebro.
      2. Extirpar as membranas, o cerebelo e o hipocampo com tesouras e fórceps de maneira meticulosa e asséptica para evitar a contaminação da mistura de sacarose do tecido cerebral. Limpe o cérebro 3x com PBS para remover qualquer sangue ou tecido residual.
      3. Transfira os cérebros limpos para 10 mL de solução estéril de sacarose 0,32 M e corte o tecido cerebral com a tesoura microcirúrgica em5 mm 3 pedaços para obter uma mistura de sacarose do tecido cerebral.
    2. Homogeneização do tecido cerebral
      1. Transfira a mistura de sacarose do tecido cerebral para um homogeneizador estéril de 50 mL e adicione 30 mL de solução estéril de sacarose 0,32 M. Use um homogeneizador de vidro de 50 mL para homogeneizar por 2 min para obter um homogeneizado de tecido cerebral liso.
      2. Dilua o homogeneizado do tecido cerebral a 90 mL com solução estéril de sacarose 0,32 M, misture e distribua lentamente na parte superior de seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno estéril de paredes finas de 38,5 mL contendo 20 mL de solução estéril de sacarose 0,83 M. Adicione 15 mL de homogenato a cada tubo de centrífuga e, em seguida, nivele com solução estéril de sacarose 0,32 M.
    3. Coleta bruta de detritos de mielina
      1. Pré-resfrie um rotor de ultracentrífuga a 4 °C e centrifugue a amostra a 75.000 x g por 45 min. Após o processo de centrifugação, recolher os detritos de mielina da interface entre as duas densidades de sacarose utilizando um tubo de Pasteur estéril.
        NOTA: É imperativo durante o processo de coleta ter cuidado e evitar a coleta inadvertida de outros componentes da amostra contaminada.
  2. Primeira separação isotônica e purificação
    1. Transfira a solução de detritos de mielina coletada para um tubo de centrífuga de 50 mL e ajuste o volume para 35 mL com tampão salino tampão salino (PBS) estéril pré-resfriado. Transferir a solução para um novo homogeneizador estéril de 50 ml e homogeneizar durante 2 min para obter um homogeneizado.
    2. Distribua o homogeneizado de detritos de mielina uniformemente em seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno de parede fina estéreis de 38,5 mL, adicionando tampão PBS estéril. Submeter os tubos à centrifugação a 75.000 x g durante 45 min a 4 °C.
  3. Segunda separação isotônica e purificação
    1. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento branco sólido em 10 ml de tampão PBS estéril pré-arrefecido, a fim de obter uma suspensão de detritos de mielina. Distribua a suspensão uniformemente em dois tubos de ultracentrífuga de polipropileno de parede fina estéreis de 38,5 mL, com o volume equilibrado pela adição de tampão PBS estéril.
    2. Centrifugue as amostras a 4 °C a 75.000 x g por 45 min.
  4. Coleta de mielina purificada
    1. Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento branco sólido em 6 ml de tampão PBS estéril. Divida a suspensão de detritos de mielina em seis tubos de centrífuga de 1,5 mL e, em seguida, submeta à centrifugação a 4 °C e 12.000 x g por 10 min.
    2. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento branco sólido em 100 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) pré-arrefecida.
  5. Quantificação de detritos de mielina
    1. Tome 3 μL da suspensão de detritos de mielina para quantificação do teor de proteína usando um kit de quantificação de proteína BCA. Conservar a suspensão restante dos detritos de mielina a -80 °C.

2. Marcação fluorescente de detritos de mielina

  1. Incubação de éster N-succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína
    1. Descongele os detritos de mielina necessários a 4 ° C ou água gelada e centrifugue a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender os restos de mielina em 200 μL de solução de éster N-succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE; 50 μM).
    2. Incube em temperatura ambiente no escuro por 30 min. Após o período de incubação, centrifugue a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
    3. Descarte o sobrenadante e lave as amostras 3x com 500 μL de tampão PBS estéril. Após o processo de lavagem, ressuspenda os detritos de mielina em 100 μL de tampão PBS estéril pré-resfriado para obter uma suspensão de detritos de mielina marcados com fluorescência, que podem ser armazenados a -80 °C.

3. Cultura de microglia

  1. Cultura de células BV-2 em CO2 a 5% umidificado a 37 °C em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 10% (v/v), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL). Semeie quase 50% de células Bv-2 na placa de 12 poços e na placa de 24 poços para testes adicionais.

4. Estimulação magnética repetida in vitro

  1. Realize a intervenção de estimulação magnética repetida in vitro com a seguinte configuração: frequência de tratamento de 20 Hz, intensidade de tratamento de 1% da intensidade máxima de saída (ou seja, 0,035 Tesla), tempo de estimulação de 5 s, período de descanso de 20 s. Administre 600 pulsos com um único tempo de tratamento de 2,5 min.
  2. Durante a estimulação magnética, posicione o centro da bobina alinhado com o centro da placa de cultura e certifique-se de que a bobina se encaixe perfeitamente na parte inferior da placa de cultura.
    1. Predetermine os parâmetros de estimulação magnética e fixe a direção da bobina de estimulação magnética para ser perpendicular ao solo e orientada para cima. Esterilize a bobina de estimulação magnética com álcool para evitar a contaminação das células.
    2. Em seguida, recupere a placa de cultura de células da incubadora e posicione-a acima da bobina de estimulação magnética para estimulação magnética. Esterilize a placa borrifando álcool sobre ela e devolva-a à incubadora. Mantenha a placa coberta durante todo o processo.

5. Teste de fagocitose microglial de detritos de mielina

  1. Tratamento de estimulação magnética repetida para o grupo LPS+rMS
    1. Use CFSE (50 μM) para marcar detritos de mielina para avaliar a fagocitose. Placa 1 x 104 células BV-2 em placas de 24 poços durante a noite. Mude o meio para meio sem soro e trate as células com lipopolissacarídeo (LPS; 1 μg / mL) por 12 h. Aspire suavemente o meio antigo usando uma pipeta e, em seguida, adicione o novo meio sem soro imediatamente usando a pipeta.
    2. Após um período de 12 h de intervenção LPS, adicione os detritos de mielina (100 μg/mL) ao meio para co-cultura em condições escuras. Sujeitar as células a intervenções repetidas de estimulação magnética, conforme descrito no passo 4.2.
  2. Imunofluorescência e imagem
    1. Lave os detritos de mielina não adsorvidos com PBS suavemente e fixe as células com PFA a 4% por 15 min. Bloqueie as células com PBS contendo 10% de albumina sérica de burro e 0,3% de Triton X-100 por 1 h à temperatura ambiente, depois lave com PBS e incube com anticorpo primário (IBA-1, 1:200) a 4 ° C durante a noite.
    2. Incubar as células com anticorpos secundários (1: 300, ratinho) durante 2 h à temperatura ambiente. Capture imagens usando um microscópio confocal em 40x e 20x.

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Resultados

Neste estudo, inicialmente alimentamos células de microglia BV-2 in vitro , extraindo detritos de mielina derivados do cérebro e utilizando estimulação magnética repetitiva para aumentar sua capacidade fagocítica. Posteriormente, as células da microglia BV-2 foram cultivadas e submetidas à intervenção LPS antes da estimulação magnética, emulando assim o estado in vivo da microglia sob rigorosa validação neurológica. Posteriormente, a intervenção rMS foi aplicada após a estimulação do LPS. Para validar a...

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Discussão

A estimulação magnética repetitiva (rMS) é uma técnica de neuroestimulação não invasiva que tem sido amplamente aplicada no tratamento de vários distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo deficiências cognitivas, doença de Alzheimer (DA), acidente vascular cerebral, lesão cerebral e lesão medular (LM). O rMS utiliza um campo magnético pulsado para modular o potencial de membrana dos neurônios, influenciando seletivamente a excitabilidade neural dentro do sistema nervoso

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82302877, 82172541), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Hunan (2023JJ30549).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de montagem antidesbotamento com DAPIBeyotime, ChinaP0131
BCA KitThermoFisher Scientific, América23227
Célula Bv-2ATCCCBP60922
Placas de 12 poços de cultura de célulasBiofil, China
Placas de 24 poços de cultura de célulasBiofil, China
Varredura a laser confocal MicroscópioZeiss, Alemanha800
Incubadora de temperatura constanteThermoFisher Scientific, América
CFSEMedChemExpress, AméricaHY-158820
DMEM-Meio de culturaKeyGen, ChinaKGL1202-500
FBSGibco, América16250078
Iba1Abcam, Américaab48004
Aparelho de estimulação magnéticaYiruide, ChinaCCY-IA
Bobina de estimulação magnéticaYiruide, China
ParaformaldeídoBioSharp, China
PBSKeyGen, ChinaKGL2210-500
Penicilina-EstreptomicinaGibco, América15140-122
SacaroseMedChemExpress, AméricaHY-B1779
TripsinaKeyGen, ChinaKGL2107-100
UltracentrífugaBeckman, AméricaL-100XP

Referências

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