Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Summary

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Abstract

Compreender a expressão gênica é essencial para decifrar as funções celulares. No entanto, os métodos para analisar a expressão de vários genes in situ dentro de um determinado tecido permanecem limitados. O protocolo EASI-FISH descrito aqui foi adaptado para detectar a expressão de dezenas de genes no sistema nervoso central (SNC) adulto intacto de Drosophila usando reagentes disponíveis comercialmente. Este protocolo inclui uma nova formulação de gel que aumenta a robustez do gel, permitindo várias rodadas de hibridização e permitindo a incorporação de vários cérebros por gel. Essa melhoria aumenta o rendimento, facilita a comparação ideal das condições experimentais e reduz os custos de reagentes. Além disso, ao empregar o sistema GAL4-UAS para co-detecção de proteína fluorescente verde (GFP), a expressão gênica pode ser visualizada em tipos específicos de células neuronais ou gliais. Notavelmente, a alta resolução alcançada por meio da microscopia de expansão, combinada com a sensibilidade do método, permite a detecção de transcritos de RNA único. Essa abordagem integra efetivamente alta qualidade de imagem com alto rendimento, tornando-se uma ferramenta poderosa para estudar a expressão gênica em todo o cérebro intacto da mosca.

Introduction

FISH foi utilizado pela primeira vez em Drosophila há mais de 40 anos para mapear genes em cromossomos politênicos^1,2. Hoje, o FISH de molécula única é o padrão-ouro para localizar espacialmente e quantificar transcritos de mRNA em tecido intacto³. No entanto, devido a questões de integridade da amostra e perda de RNA, as técnicas de FISH de molécula única de montagem inteira em Drosophila foram limitadas a apenas alguns genes que podem ser analisados na mesma amostra^4,5,6,7. Embora o recente desenvolvimento do código de barras (por exemplo^8,9,10) aumente o número de transcritos que podem ser detectados em até várias centenas, mesmo em tecido espesso^11,12, o estabelecimento de tais protocolos requer um investimento considerável de recursos, o que pode ser um obstáculo para a implementação. De fato, muitas técnicas transcriptômicas espaciais inventivas nunca se espalharam além de suas instituições de origem¹³. Portanto, um método direto e comparativamente barato para detectar a expressão de dezenas de genes no mesmo cérebro intacto facilitaria vários objetivos de pesquisa: validação de dados de seqüência de RNA e atlas celular, mapeamento de tipos de células moleculares em todo o SNC, quantificação de diferenças específicas de desenvolvimento, sexo ou espécie na expressão gênica ou medição de mudanças na expressão gênica induzidas pela grande variedade de perturbações genéticas ou ambientais disponíveis em Drosophila.

A microscopia de expansão é uma técnica que permite aos pesquisadores observar tecidos em maior resolução, expandindo-os em um hidrogel expansível¹⁴. O EASI-FISH combina microscopia de expansão e RNA FISH¹⁵, que utiliza a reação em cadeia de hibridização (HCR), uma técnica não enzimática para detectar a ligação da sonda oligo¹⁶. O EASI-FISH foi desenvolvido pela primeira vez como uma abordagem alternativa ao FISH de tecido fino para mapear padrões de expressão de dezenas de genes em fatias de tecido espesso (300 μm) do hipotálamo lateral de camundongo¹⁷. Este método é ideal para aplicação em cérebros de moscas adultas, uma vez que este tecido tem menos de 300 μm de espessura, e um protótipo de protocolo EASI-FISH de mosca foi recentemente descrito¹⁸. Aqui, cérebros de Drosophila dissecados e fixados são incorporados em um hidrogel expansível, onde o mRNA e as proteínas são covalentemente ancorados ao polímero de gel com os agentes alquilantes Melphalan-X e Acryloyl-X (Ac-X), respectivamente. Após a digestão de proteínas, que permite a expansão isotrópica do cérebro, as sondas oligo de DNA específicas do gene são hibridizadas com o mRNA no tecido para localizar transcritos de interesse. Grampos de cabelo de DNA marcados com fluorescência são então adicionados em uma segunda etapa de hibridização. Várias moléculas de grampo de cabelo polimerizam na reação HCR para formar polímeros de DNA metaestáveis. Isso leva a uma amplificação do sinal para transcritos individuais, que podem ser detectados como pontos brilhantes por folha de luz ou microscopia confocal.

A ancoragem covalente de mRNA e proteína à matriz de gel e a digestão proteolítica de proteínas após a formação do gel criam um ambiente onde os transcritos de mRNA são relativamente estáveis e potencialmente mais acessíveis à ligação da sonda. A estabilidade do mRNA e do gel permite várias rodadas de re-sondagem e imagem, com a remoção de sondas de DNA e produto HCR por incubação com a enzima DNase1 entre rodadas^15,17. Além disso, a expansão da amostra reduz a autofluorescência e o espalhamento de luz por desaglomeração molecular e aumenta efetivamente a resolução da imagem¹⁴. Portanto, transcritos individuais de mRNA podem ser resolvidos com mais facilidade.

GFP sustenta o procedimento o suficiente para permanecer detectável por fluorescência ou ligação de anticorpos pós-expansão. Portanto, este relator pode ser usado para marcar e segmentar tipos de células de interesse. Em conjunto com as muitas linhas de driver GAL4 divididas específicas de neurônios disponíveis (por exemplo, ^19,20), isso abre a possibilidade de obter mais informações sobre a identidade molecular de um tipo neuronal ou identificar subtipos moleculares que não podem ser facilmente distinguidos por sua anatomia.

Descrito aqui está uma versão atualizada do protótipo do protocolo EASI-FISH¹⁸ que apresenta excelente retenção de mRNA, remoção de dificuldades técnicas e maior robustez do gel. As modificações incluem aumentar a concentração de PFA, diminuir a temperatura de fixação e facilitar a preparação da amostra, montando os cérebros antes da incubação com Melphalan-X e Ac-X. Este protocolo também incorpora uma nova receita de gel para aumentar a robustez do gel, o que reduz efetivamente os danos ao gel ao realizar muitas rodadas de FISH e imagens. Essas modificações tornam o protocolo mais simples de executar, diminuindo o tempo de processamento e o uso de reagentes e aumentando a confiança em resultados consistentes. É importante ressaltar que a capacidade de multiplexação é aumentada de tal forma que dezenas de genes podem ser investigados no mesmo cérebro durante um período de meses. Isso é ilustrado pelos padrões de expressão de vários genes neuronais no cérebro adulto de Drosophila em uma variedade de níveis de expressão.

Protocol

Este protocolo foi realizado em fêmeas adultas (5-6 dias de idade) de Drosophila melanogaster, mas qualquer sexo ou espécie de Drosophila é aplicável. Para receitas de âncora de gel, consulte a Tabela Suplementar 1; para a receita do gel, Tabela Suplementar 2; e para outros reagentes EASI-FISH, Tabela Suplementar 3. Para obter um guia diário de materiais e reagentes, consulte a Tabela Suplementar 4. Para suporte de gel de microscópio de folha de luz, consulte o Arquivo Suplementar 1. Figura 1A-C mostra uma representação esquemática da incorporação de cérebros em géis antes da expansão e hibridização da sonda (etapas 2.1 a 3.8). Figura 1D é uma fotografia dos cérebros incorporados, Figura 1E mostra um suporte de gel para microscopia de folha de luz e Figura 1F descreve a linha do tempo de um experimento típico. Os detalhes comerciais dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissecção e fixação do cérebro da mosca

1. Dissecar cérebros de moscas ou SNC em meio S2 frio (para mais detalhes de dissecação, consulte reference²¹)
2. Para consertar os cérebros, adicione até 20 cérebros ou 10 SNC a 2 mL de PFA / PBS a 4% frio e incube durante a noite em um nutador a 4 ° C.
   CUIDADO: O PFA é prejudicial se ingerido ou inalado, irritante para a pele e os olhos e pode ser cancerígeno.
3. Enxágue a amostra (1x) com 2 mL de PBT frio (0,5%, consulte a Tabela Suplementar 4) e, em seguida, lave a amostra com 2 mL de PBT frio (4x) por 15 min em um nutador a 4 ° C.
4. Enxágue a amostra (1x) com 2 mL de EtOH 70% frio. Armazene os cérebros em 2 mL de EtOH a 70% a 4 °C por até 6 meses.

2. Montando cérebros e adicionando RNA e ligantes de proteínas (Dia 1)

NOTA: Use luvas o tempo todo e limpe consistentemente o equipamento e o espaço de trabalho com o RNase Away. As luvas são necessárias (1) para manter as RNases longe das amostras e (2) como proteção contra vários reagentes que representam um risco à saúde.

1. Prepare as câmaras de gel limpando uma lâmina não carregada com um reagente de descontaminação RNase. Remova o filme opaco que protege o adesivo da junta de silicone, cole a junta (com até 4 câmaras) na lâmina e cubra cada superfície da câmara com 1 μL de polilisina usando uma ponta de pipeta P20. Seque ao ar e repita o processo.
   NOTA: A etapa 2.1 pode ser feita no dia anterior.
2. Transfira os cérebros para um tubo de PCR de 0,2 mL (até 4 cérebros por tubo) e reidratie por (2x) 5 min em 150 μL de PBT (0,1%) e (2x) por 5 min em PBS.
3. Para montar os cérebros, adicione 40 μL de PBS por câmara e, em seguida, cole suavemente os cérebros em uma fileira no centro da câmara com uma pinça fina, deixando algum espaço entre os cérebros (ver Figura 1D). É possível montar até 6 cérebros ou 2 SNC por câmara.
4. Remova o PBS e adicione imediatamente 50 μL de tampão MOPS de 20 mM. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
5. Enquanto os cérebros estão se equilibrando no tampão MOPS, descongele as soluções estoque de Melfalano-X e Ac-X e prepare 75 μL de solução de Melfalano-X / Ac-X por câmara (dilua o estoque de Melfalano-X 1: 1 com tampão MOPS e adicione Ac-X a 1: 100). Vortex e gire brevemente para coletar a solução; cronometre a preparação de forma que a solução esteja pronta ao final do tempo de incubação de 30 minutos, não antes.
   CUIDADO: O Melphalan-X é prejudicial se ingerido ou inalado, irritante para a pele e os olhos e pode ser cancerígeno.
6. Remova todo o tampão MOPS e adicione 50 μL de solução de Melphalan-X / Ac-X.
7. Cubra a câmara colocando uma lamínula por cima, mas não use o adesivo da junta para selar. Coloque a câmara em uma caixa umidificada e incube protegida da luz durante a noite em RT.

3. Digestão de gelificação e proteinase K (dia 2)

1. Remova cuidadosamente a lamínula e o Melphalan-X / Ac-X e lave os cérebros montados (2x) por 2 min com 100 μL de PBT (0,1%) e (1x) por 2 min com 100 μL de PBS.
2. Descongele a solução TREx-1000, 4HT, TEMED e APS e mantenha no gelo.
   NOTA: TREx-1000 pode precipitar a -20 °C; vórtice bem para dissolver completamente após o descongelamento.
   CUIDADO: Esses reagentes são prejudiciais ou tóxicos quando ingeridos ou inalados, bem como irritantes para a pele e os olhos.
3. Prepare a solução de gel misturando TREx-1000 com 4HT, TEMED e APS na proporção de 94:2:2:2. Vórtice e mantenha no gelo. Para cada câmara, preparar 150 μL de solução de gel.
4. Remova o PBS da câmara com uma ponta de pipeta e remova cuidadosamente qualquer PBS restante com um pano sem fiapos. Para cada câmara, adicione imediatamente 40 μL de solução de gel no topo do cérebro. Incubar a 4 °C durante 10 min.
5. Retirar a solução de gel e adicionar 40 μL de solução de gel fresco, incubando a 4 °C por mais 10 min.
   NOTA: Colete a solução residual de gel em um tubo de microcentrífuga e polimerize antes de descartá-la.
6. Remova a solução de gel e retire a película protetora transparente do adesivo da superfície da junta. Adicione 45 μL finais de solução de gel fresco, coloque suavemente uma lamínula sobre a câmara e evite prender bolhas de ar. Pressione a lamínula para selar a câmara e incubar a 4 °C durante 10 min (para um total de 30 min de equilíbrio a 4 °C).
7. Polimerizar o gel a 37 °C durante 1,5 h.
8. Assim que os géis endurecerem, deixe-os esfriar na bancada por alguns minutos. Retire cuidadosamente a lamínula e remova a junta de silicone com uma nova lâmina de barbear. Em seguida, corte o gel em um retângulo e corte o canto superior direito para rastrear a orientação da amostra.
9. Remova os géis da lâmina com um pincel fino umedecido com uma pequena quantidade de ProK Buffer e transfira-os individualmente para tubos de microcentrífuga de 2 mL.
10. Incubar cada gel com 500 μL de tampão ProK e 5 μL de enzima ProK (1:100) a 37 °C durante a noite.

4. Digestão de DNA e hibridização de sonda (Dia 3)

1. Lave os géis (3x) por 10 min com 1 mL de PBS em RT.
   NOTA: Use pipetas de transferência de ponta fina para evitar danificar o gel ao substituir as soluções.
2. Incube géis por 30 min em 1 mL de tampão DNase1 a 37 °C.
3. Adicione 50 μL de enzima DNase1 a 450 μL de tampão DNase. Misture delicadamente, mas não vórtice. Incubar cada gel em 500 μL de DNase1 por 2 h 37 °C. Lavar (4x) 15 min com 1 mL de PBS em RT.
   NOTA: Os géis podem ser armazenados em 5x SSC a 4 °C antes ou depois da digestão/lavagem de DNase por várias semanas.
4. Descongele a hibridização (hyb) e o tampão de lavagem da sonda. Incubar os géis em 500 μL de tampão hyb sem sondas por 30 min a 37 °C.
   CUIDADO: O tampão de lavagem do híbio e da sonda contém formamida, que é suspeita de causar câncer.
5. Diluir as sondas 1:100 em tampão hyb (10 nM), preparando 300 μL por gel. Incube os géis com tampão hyb e sondas durante a noite a 37 °C. Mantenha o tampão de lavagem da sonda e PBS a 37 °C.

5. Lavagens da sonda (Dia 4)

1. Lave os géis (3x) por 30 min com 750 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
2. Lave os géis (3x) por 30 min, depois (3x) por 1 h com 1 mL de PBS a 37 °C.
3. Lave os géis em 2 mL de PBS em RT durante a noite ou 4 °C no fim de semana.

6. Reação em Cadeia de Hibridização (HCR) com grampos de cabelo fluorescentes (Dia 5)

NOTA: Para o princípio HCR, consulte reference²².

1. Incube os géis em 500 μL de tampão de amplificação (amp) por 30 min em RT.
2. Aqueça os grampos de cabelo fluorescentes a 95 ° C por 90 segundos em uma máquina de PCR e resfrie rapidamente a 25 ° C por 30 min.
3. Para cada sonda, dilua os pares de grampos de cabelo correspondentes (h1 e h2) 1:50 em tampão de amperes, preparando 300 μL por gel e vórtice.
4. Incubar os géis com a mistura hairpin durante 3 h a RT no escuro.
5. Lave os géis (2x) por 15 min com 750 μL de SSCT 5x e (2x) por 30 min com 1 mL de SSCT 0,5x em RT.
6. Se os cérebros expressarem GFP, cove-se com 500 μL de anticorpo anti-GFP-AF488 (1:500) em PBT (0,1%) contendo 5 mg / mL de BSA ultrapuro e incube durante a noite (ou no fim de semana) a 4 ° C.

7. Montagem de géis e imagens (Dia 6)

1. Após a incubação do anticorpo, enxágue os géis uma vez e lave (1x) por 30 min com 1 mL de PBT (0,1%), seguido de (3x) por 30 min com 1 mL de PBS.
   NOTA: A lavagem em PBS resultará em expansão de 2x; para expansão 3x, lave com 0.05x SSC.
2. Durante a lavagem, cubra a superfície de fixação do gel do suporte de gel do microscópio de folha de luz duas vezes com 1 μL de polilisina, deixando-o secar a 37 °C entre as demãos. Da mesma forma, para imagens confocais, cubra a área de fixação do gel de um prato com fundo de vidro com aplicações repetidas de polilisina.
3. Pinte os géis por 30 min em RT em 1 mL de 5 μg / mL DAPI / PBS ou DAPI / 0,05x SSC ou, alternativamente, core durante a noite a 4 ° C.
4. Para montar o gel no suporte de gel (microscópio de folha de luz) ou prato de fundo de vidro (microscópio confocal), coloque o gel em uma lamínula e seque cuidadosamente as bordas com um pano sem fiapos. Certifique-se de que o gel esteja orientado de forma que o tecido fique mais próximo do objetivo. Usando um pincel, coloque suavemente o gel na superfície de polilisina em um movimento. Para imagens, banhe o gel em PBS (ou 0,05x SSC se expandir para 3x).
   NOTA: Após a imagem, os géis podem ser removidos suavemente da superfície de polilisina com um pincel úmido e transferidos para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
5. Para uma nova sondagem imediata, prossiga para o dia 7. Para armazenamento de longo prazo (1 semana a 6 meses), armazene os géis em 1 mL de 5x SSC a 4 °C. Quando estiver pronto para usar, lave os géis (3x) por 10 min com 1 mL de PBS antes de prosseguir.
   NOTA: A extensão da expansão é geralmente consistente nos buffers descritos (~ 2x em PBS e ~ 3x em 0,05x SSC). Para verificar o fator de expansão, meça o tamanho de um cérebro antes e depois da expansão em imagens tiradas em um estereomicroscópio de fluorescência. Para visualizar o cérebro após a expansão, cove-o brevemente com DAPI. O fator de expansão aproximado é o tamanho pós-expansão dividido pelo tamanho pré-expansão.

8. Remoção de sondas e grampos de cabelo para multiplexação (Dia 7)

1. Incubar os géis durante 30 min em 1 ml de tampão DNase1 a 37°C.
2. Adicione 50 μL de DNase1 a 450 μL de tampão DNase. Misture delicadamente, mas não vórtice. Incubar os géis em 500 μL de DNase1 durante 2 h a 37 °C.
3. Lave (4x) por 15 min com 1 mL de PBS em RT. Os géis agora estão prontos para a próxima rodada de hibridização (Dia 3, etapa 6).

Results

O desempenho deste protocolo EASI-FISH modificado é demonstrado pela detecção da expressão de vários genes diferentes associados a neurotransmissores e neuropeptídeos em todo o cérebro adulto de Drosophila em várias rodadas. Normalmente, cérebros gelificados e expandidos foram hibridizados com duas ou três sondas por rodada, seguidos por HCR com pares de grampos conjugados com Alexa Fluor (AF) 488 (a menos que GFP fosse expresso), AF546 e AF647 ou Janelia Fluor (JF) 669. A imagem foi realizada principalmente em ...

Discussion

O protocolo EASI-FISH descrito para o sistema nervoso Drosophila intacto permite a detecção de dezenas de transcritos no mesmo cérebro ou SNC. É robusto, direto e sensível, e pode ser combinado com a detecção de GFP para identificar subconjuntos de neurônios ou glia. Como esse método é fácil de implementar, ele deve facilitar a pesquisa dos laboratórios de Drosophila com interesse em mapear e quantificar a expressão gênica no cérebro intacto da mosca.

O EASI-FISH oferece vári...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de PCR de 0,2 mL	Científica dos EUA	1402-4700
Tubos de microcentrífuga com tampa de rosca de 0,5 mL, Amber	USA Scientific	1405-9707
0.5M EDTA, PH 8, livre de RNase	Invitrogen	AM9260G
10M NaOH	Sigma	72068
10x PBS	Fisher	BP 3994
20x SSC	ThermoFisher	AM 9763
40% Acrilamida	Bio-Rad	1610140
4-Hidroxi-TEMPO (4HT)	Sigma	176141
5 M NaCl livre de RNase	Thermofisher	AM97060G
Tubo de Transferência de 5 ml- Ponta Fina	Global Scientific	134070-S20
Placa de Fundo de Vidro de 6 Poços	Cellvis	P06-1.5H-N
Acetonitrila, anidro	ThermoFisher	042311-K7
Ácido Acrílico	TCI	A0141
Acriloil-X	ThermoFisher	A20770
Persulfato de amônio (APS)	Sigma	A3678
Tampão de amplificação	Instrumentos moleculares	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
DMSO anidro	Invitrogen	D12345
AstA_B2	Instrumentos moleculares	PRR477
ChAT_B1	Instrumentos moleculares	PRG115
Crz_B5	Instrumentos moleculares	PRR480
DAPI	Sigma	D9542
FIJI	https://imagej.net/software/fiji/		de código aberto
FMRFa_B2	Instrumentos Moleculares	PRR487
GAD1_B5	Instrumentos Moleculares	RTE581
GFP Anticorpo Policlonal, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21311
Instrumentos Moleculares		de Tampão de Hibridização
Imaris Stitcher	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
visualizador Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE	Tocris	6420
Melphalan	Caymen Chemicals	16665
MOPs Buffer	Fisher	BP308-100
N,N Metileno-Bis-acrilamida	Bio-Rad	1610142
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Sigma	T22500
Água Livre de Nuclease	Sondas Oligo Ambion	AM9932
	Instrumentos Moleculares	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Paraformaldeído (PFA)	EMS	15710
PBS	Fisher
Photoflo-200	EMS	74257
Poli-L-lisina hidrobrometo (polilisina)	Sigma	P1524
Sonda Tampão de Lavagem	Instrumentos Moleculares	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Proteinase K	NEB	P8107S
QIAquick Kit de Remoção de Nucleotídeos	Qiagen	28306
RNase Away	ThermoFisher	7003, reagente
DNase1 livre de RNase1	Qiagen	79254
S2 Médio	ThermoFisher	21720024
Juntas de Silicone	Invitrogen	P24743
Tdc2_B5	Molecular Instruments	RTE880
Tk_B5	Molecular Instruments	PRR484
UltaPure 10% SDS	Thermofisher	15553027
Ultrapure BSA	ThermoFisher	AM2616
Unconjugated e Alexa Fluor-conjugated Grampos de cabelo	Instrumentos	moleculares
VAChT_B1	Molecular Instruments	RTA904
vGLUT_B2	Molecular Instruments	RTB212
Zeis Z7 Suporte de Gel	Janelia	Arquivos CAD disponíveis a pedido
Zeiss LSM 980 microscópio confocal invertido	Zeiss	https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
microscópio de folha de luz Zeiss Z7	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html