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Artigo de método

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

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DOI:

10.3791/67666

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31 de janeiro de 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Physiology and Cell Biology, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Center for Systems Neuroscience (ZSN)

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Resumo

O trato gastrointestinal (TGI) serve tanto na digestão dos alimentos quanto na absorção de nutrientes, mas também como uma barreira protetora contra patógenos. Tradicionalmente, a pesquisa nessa área depende de experimentos com animais, mas há uma demanda crescente por métodos alternativos que aderem aos princípios 3R - substituir, reduzir e refinar. Os organoides suínos surgiram como uma ferramenta promissora, oferecendo uma replicação in vitro mais precisa das condições in vivo do que os modelos celulares tradicionais. Um grande desafio com os organoides intestinais é sua superfície apical voltada para dentro e a superfície basolateral voltada para fora. Essa limitação pode ser superada criando camadas organoides bidimensionais (2D) em inserções transwell (doravante denominadas inserto(s)), fornecendo acesso a ambas as superfícies. Neste estudo, desenvolvemos com sucesso culturas bidimensionais de jejuno suíno e organoides do cólon. O processo de cultivo envolve duas fases principais: primeiro, a formação de uma monocamada celular, seguida pela diferenciação das células usando meios personalizados. O crescimento celular é rastreado medindo a resistência elétrica transepitelial, que se estabiliza no dia 8 para organoides do cólon e no dia 16 para organoides do jejuno. Após uma fase de diferenciação de 2 dias, o epitélio está pronto para análise. Para quantificar e rastrear processos ativos de transporte eletrogênico, como a secreção de cloreto, empregamos a técnica da câmara de Ussing. Este método permite a medição em tempo real e a caracterização detalhada dos processos de transporte epitelial. Este modelo inovador in vitro , combinado com técnicas estabelecidas como a câmara de Ussing, fornece uma plataforma robusta para caracterizar fisiologicamente o TGI suíno dentro da estrutura 3R. Também abre oportunidades para investigar mecanismos fisiopatológicos e desenvolver possíveis estratégias terapêuticas.

Introdução

O TGI desempenha um papel central na digestão, absorção de nutrientes e excreção de resíduos pelas fezes1. Além disso, funciona como uma barreira contra patógenos, um papel apoiado por uma composição celular diversificada, incluindo células-tronco, células caliciformes produtoras de muco, células enteroendócrinas e enterócitos absorventes2. A homeostase intestinal pode ser interrompida por vários fatores, como infecções bacterianas3 ou processos inflamatórios4, levando a graves consequências para o organismo, como má absorção, diarreia ou até mesmo morte5. A investigação de tais cenários fisiopatológicos é comumente feita usando animais de laboratório ou, de acordo com o princípio3R 6, culturas de células derivadas de várias espécies. A previsão precisa e a transferibilidade dos resultados são cruciais ao empregar modelos específicos de espécies7. Apesar dessa necessidade, há uma notável falta de culturas de células derivadas de porcos que reproduzam adequadamente a complexidade e a funcionalidade do trato intestinal.

Para enfrentar esse desafio, também relevante para outras espécies, organoides tridimensionais (3D) foram desenvolvidos na tentativa de replicar a complexidade fisiológica do GIT8. Inicialmente, os organoides foram criados a partir de intestinos humanos e de camundongos; Até o momento, organoides suínos de suínos juvenis e adultos também foram desenvolvidos e cultivados com sucesso 9,10. Desde a sua criação, esses organoides suínos têm sido utilizados em vários estudos, com foco principalmente em infecções intestinais 11,12,13,14. Pesquisas voltadas para a caracterização de propriedades fisiológicas, como transporte de nutrientes ou processos secretores, permanecem limitadas15. Isso pode ser devido à orientação dos organoides intestinais, com a superfície apical voltada para dentro e o lado basolateral para fora, limitando a acessibilidade à superfície apical. Essa limitação foi abordada com o cultivo bem-sucedido de organoides suínos em formato bidimensional16, um método que foi avançado ainda mais com o uso de tecido congelado para gerá-los17.

O cultivo 2D de organoides suínos fornece acesso a ambos os lados do epitélio, permitindo a aplicação de métodos bem estabelecidos para estudar os processos de transporte através da camada epitelial. Um desses métodos é a câmara de Ussing18, que permite a observação em tempo real dos processos eletrogênicos de absorção e secreção através do epitélio. O uso extensivo deste sistema proporcionou uma compreensão abrangente da função intestinal suína in vivo, cobrindo todo o eixo intestinal. Isso inclui estudos sobre transporte de monossacarídeos ou transporte de ácidos graxos de cadeia curta ou respostas a metabólitos secundários de plantas, como o resveratrol, que influenciam as características do transporte intestinal 19,20,21,22,23,24. O corpo substancial de dados desses estudos facilita comparações diretas entre as condições in vivo bem caracterizadas e o ambiente in vitro de organoides suínos, aumentando nossa compreensão de sua relevância fisiológica.

Neste estudo, apresentamos um protocolo para geração e cultivo de monocamadas 2D a partir de organoides suínos 3D. Além disso, detalhamos a abordagem metodológica para quantificar os processos de transporte intestinal usando a técnica da câmara de Ussing. O protocolo oferece ferramentas para estudar características absortivas e secretoras in vitro em organoides jejuno e cólon, permitindo a comparação direta com condições in vivo bem caracterizadas. Aplicações futuras deste protocolo podem incluir a investigação dos efeitos de substâncias farmacológicas ou toxicológicas, bem como a exploração de interações entre o epitélio e patógenos.

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Protocolo

Para este protocolo, dois suínos saudáveis (porco Bentheim Blacked Pied; 1 macho, 1 fêmea; 4,5 meses de idade; aproximadamente 65 kg) foram sacrificados por tiro de parafuso em cativeiro e sangramento. De acordo com a Lei de Proteção Animal, isso (abate e remoção de tecidos) não é classificado como um experimento animal, mas deve ser anunciado ao oficial de bem-estar animal (registro nº. TiHo-T-2023-15) da Fundação Hannover da Universidade de Medicina Veterinária.

1. Revestimento de inserções

NOTA: Todas as etapas são realizadas com materiais estéreis sob um gabinete de segurança. Todas as etapas do protocolo são realizadas no gelo, se não for indicado o contrário.

  1. Descongele a membrana basal congelada no gelo por pelo menos 1 h em temperatura ambiente ou durante a noite no gelo a 4 °C. Misture a membrana basal 1:40 (v/v) com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) gelada em um tubo cônico.
  2. Remova as placas estéreis com inserções da embalagem. Adicione 200 μL de mistura de membrana basal ao compartimento apical de cada inserto.
  3. Recoloque a tampa da placa do poço e incube por pelo menos 1,5 h a 37 °C, 5% de CO2 em uma incubadora.
  4. Aspire a solução cuidadosamente antes de semear as células. Certifique-se de que a ponta não toque na membrana durante a aspiração.

2. Geração de monocamadas organoides 2D

NOTA: Os organoides do cólon suíno são gerados e cultivados conforme descrito para organoides jejunais suínos25. Após a geração de organoides 3D, eles devem ser cultivados por pelo menos 3-4 semanas durante a passagem semanal para garantir um crescimento consistente. O número de células dentro de cada cúpula contendo organoides 3D, que são dissolvidos nas etapas subsequentes, é suficiente para cobrir um único filtro transmembrana. Antes da geração da monocamada, os organoides 3D foram submetidos ao controle de qualidade óptica para verificar o crescimento prévio e possível contaminação (Figura 1).

figure-protocol-1
Figura 1: Organoides 3D representativos. Os organoides tridimensionais (A) jejuno e (B) do cólon são cuidadosamente examinados ao microscópio antes de gerar monocamadas. Atenção especial é dada à avaliação de padrões de crescimento anteriores, integridade estrutural e presença de quaisquer impurezas ou contaminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Remova o meio organoide (Tabela 1) dos poços com organoides de cripta 3D. Adicione 1 mL de PBS gelado por poço e dissolva suavemente a membrana basal pipetando para cima e para baixo com uma ponta p1000.
  2. Colete todos os organoides dissolvidos em um tubo de 15 mL pré-preenchido com 10 mL de PBS gelado. Centrifugar o tubo a 250 x g, 10 min a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
  3. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tripsina/EDTA quente (37 °C) a 0,05% (v/v) (2 tubos podem ser agrupados nesta fase). Incubar durante 5 min a 37 °C em banho-maria e colocar diretamente no gelo para interromper a reação.
  4. Ressuspenda no gelo 20x com ponta p1000 e outro 15x com ponta p1000 + ponta p200 por cima. Adicione 10 mL de DMEM gelado suplementado com 10% (v/v) de soro fetal de bezerro (FCS).
  5. Tubo de centrífuga a 1.000 x g, 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio monocamada (Tabela 1).
  6. Determine o número de células vivas por mL usando uma câmara de Neubauer de acordo com as instruções do fabricante.
  7. Retirar a solução de revestimento neste ponto do compartimento apical e substituí-la por 500 μl de meio monocamada quente (37 °C). Adicione 3 mL de meio monocamada ao compartimento basolateral.
  8. Determine a resistência em branco (TEER) de cada inserto de transwell vazio, conforme descrito em detalhes na etapa 3. O tempo em que nenhum meio está presente na câmara apical deve ser o mais curto possível para evitar que as células sequem.
  9. Remover o meio monocamada apical e adicionar para a cultura 2D jejunal 2 x 105 células epiteliais e para a cultura 2D colónica 1,5 x 105 células epiteliais em 500 μL de meio monocamada na câmara apical de cada poço.
  10. Troque o meio e meça o TEER a cada 2-3 dias. Meça o TEER antes que o meio seja trocado. Aspirar cuidadosamente o meio do compartimento apical e basal e substituí-lo por 500 μL ou 3 ml de meio fresco e quente (37 °C).
    1. Para organoides jejuno: no dia 16, após a semeadura, mude de meio monocamada para meio de diferenciação (Tabela 1). Para organoides do cólon: mude o meio no dia 7 para o meio de diferenciação.
  11. Troque o meio de diferenciação todos os dias e realize a medição TEER durante cada troca de meio. No dia 18 (para organoides jejunais) ou no dia 9 (para organoides do cólon), após a semeadura, prossiga com os experimentos funcionais.

3. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)

NOTA: Todas as medições são realizadas sob um gabinete de segurança para evitar contaminação. Antes de semear as células, cada transwell revestido vazio é medido para obter valores individuais em branco. O volt-ohm

  1. Limpe o eletrodo do pauzinho com etanol a 70% (v/v) e deixe o eletrodo secar completamente. Enquanto isso, remova a placa da incubadora e coloque-a sob o gabinete.
  2. Introduza o braço curto do eletrodo do pauzinho no compartimento apical das pastilhas e o braço longo no compartimento basolateral da pastilha. Evite o contato do braço curto com a camada de células.
  3. Meça a resistência elétrica transepitelial de cada poço trans. Deixe o volt-ohmímetro se equilibrar para garantir uma medição estável. Meça os valores TEER clicando no botão Armazenar.
  4. Continue as etapas 3.2 e 3.3 com os poços restantes. Depois de chegar ao último poço, o volt-ohm Clique em Salvar.
  5. Limpe o eletrodo após cada placa e no final da medição e deixe-o secar completamente antes de armazená-lo.
  6. Subtraia os valores em branco determinados antes de semear as células dos valores celulares medidos.

4. Estudos de transporte eletrofisiológico utilizando a técnica da câmara de Ussing

NOTA: A determinação dos estudos de transporte eletrofisiológico é realizada usando uma câmara de Ussing composta por dois compartimentos de câmara, que são divididos pelo epitélio. Esta câmara é conectada a um grampo de tensão por eletrodos Ag / AgCl. Esta técnica permite o rastreamento de processos ativos de transporte eletrogênico do epitélio através das mudanças na corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela pinça de tensão, bem como a resistência do tecido (Rt) calculada pela lei de Ohm. Isc e Rt são registrados a cada 6 s durante todo o experimento. Durante o experimento, o tecido investigado é aerado com carbogênio e incubado com soluções de Krebs-Henseleit modificadas para garantir condições viáveis. A indometacina (10 μM) é adicionada às soluções tampão para inibir a síntese de prostaglandinas26.

  1. Aquecer as soluções tampão da mucosa e da sorosidade a 37 °C e arejar com carbogénio. Monte as câmaras individuais usando um inserto vazio para cada câmara individual. Certifique-se de que os lados apicais dos transpoços estejam todos voltados para a mesma direção.
  2. Encha todas as câmaras com 5 mL de solução tampão mucosa pré-aquecida (Tabela 2). Conecte todos os eletrodos do grampo de tensão às câmaras individuais de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que nenhuma bolha de gás esteja interferindo nos eletrodos para garantir a medição correta.
  3. Calibre o software da câmara de Ussing com essas condições clicando no botão Rf/dpI no voltage clamp software. A resistência de todas as pastilhas vazias usadas deve ser igual (~ 70 Ohm) e a corrente deve ser em torno de 0 mV (± 5 mV). Se este não for o caso de algumas câmaras, verifique a colocação adequada de eletrodos ou bolhas no sistema.
  4. Remova todos os eletrodos e descarte a solução tampão usada. Abra todas as câmaras individuais e remova as inserções vazias. Certifique-se de que a ordem das câmaras individuais seja mantida.
  5. Mova a placa do poço com inserções da incubadora para o gabinete de segurança. Aspire cuidadosamente o meio basolateral e apical.
  6. Lave as células adicionando 500 μL de tampão mucoso quente (37 ° C) à câmara apical e 3 mL de tampão seroso à câmara basolateral. Aspire os tampões e repita 2x.
  7. Remova as inserções da placa. Remova cuidadosamente os suportes das inserções. Coloque os insertos nas câmaras de Ussing e certifique-se de que a orientação dos insertos seja a mesma da fase de calibração. Monte as câmaras individuais conforme exibido na Figura 2.
  8. Encha as câmaras voltadas para o lado basolateral das células com 5 mL de tampão seroso (Tabela 2) e a câmara voltada para a câmara apical com 5 mL de tampão mucoso.
  9. Conecte os eletrodos e os tubos de aeração a cada câmara individual. Inicie a medição no software Ussing. Deixe o equilíbrio por 15 min.
  10. Altere as condições de circuito aberto para condições de curto-circuito. Equilibre por 5 min a 10 min. Adicione 10 μM de forscolina à câmara serosa.
    NOTA: A adição de forscolina pode ser substituída por outros agentes / substâncias, dependendo de segmentos intestinais individuais e questões de pesquisa.
  11. Após 15 minutos, adicione mais agentes da mesma maneira que a forscolina ou interrompa a medição. Remova os tubos de aeração e eletrodos de câmaras individuais. Despeje as soluções tampão de ambas as câmaras em uma tigela.
  12. Desmonte as câmaras e descarte as inserções ou use-as para análise de acompanhamento (por exemplo, imuno-histoquímica ou análise de expressão)

figure-protocol-2
Figura 2: Estrutura esquemática da câmara de Ussing. Exibidas são ambas as câmaras divididas pela membrana com a monocamada 2D crescida. Ambas as câmaras são aeradas com carbogênio; A tensão e a corrente são monitoradas por dois eletrodos por câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Análise dos dados gerados pela configuração da câmara de Ussing

  1. Importe os dados gerados pelo software de pinça de tensão para um editor de planilhas adequado.
  2. Para determinar os valores basais Isc e Rt , calcule a média de 10 pontos de dados consecutivos obtidos 10 minutos após a inicialização das condições de curto-circuito. Cada câmara individual serve como uma réplica técnica, enquanto cada passagem de organoides serve como uma réplica biológica.
  3. Para avaliar os efeitos dos agentes aplicados, calcule a média de 10 pontos de dados consecutivos imediatamente antes da adição do agente. Compare essa média com o valor máximo (ou mínimo) observado após a aplicação do agente. Os dados obtidos são apresentados como média ± desvio padrão (DP).

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Resultados

Este protocolo facilita a geração confiável de monocamadas 2D suínas, desagregando organoides 3D derivados do jejuno e do cólon de porcos. Durante um período de cultivo de 16 dias para organoides do jejuno e 9 dias para organoides do cólon, são formadas monocamadas intactas. Essas monocamadas podem ser usadas posteriormente para avaliar propriedades de transporte eletrogênico e fisiológico usando a técnica da câmara de Ussing.

Depois de desintegrar os organoides 3D, células individuais são sem...

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Discussão

Este protocolo descreve um método para converter organoides 3D suínos estabelecidos em células únicas, que são então semeadas em membranas transwell para formar uma monocamada intacta. Essa configuração concede acesso ao lado apical das células, facilitando o uso de câmaras de Ussing para monitorar processos de absorção e secreção.

A etapa inicial e crucial neste processo de várias etapas é a desintegração precisa dos organoides 3D. Alcançar a semeadura unifor...

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Divulgações

Não temos conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Ministério Federal da Alimentação e Agricultura (BLE # 28N-2-071-00) pelo financiamento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 24 poçosSARSTEDT AG & Co. KG8,33,922
A83-01MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10432Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
accujet SBrand GmbH + Co KG, Wertheim, Alemanha26351
Advanced DMEM/F12Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA12634010Loja em 4 ° C
Suplemento B27Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA17504044Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
CaCl2.2 H2OMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaC3306Armazenar em temperatura ambiente
D(+)-Glicose (wasserfrei)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.08337Armazenar em temperatura ambiente
DAPTMedChemExpress, New Jersey, USAHY-13027Armazenar a -20 ° C. Descongelar quando necessário
D-ManitolMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaM4125Armazenar em temperatura ambiente
DMSOSigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha154938Armazenar em temperatura ambiente
Conjunto de eletrodos (AgCl / PtIr / Std.)Instrumentos Científicos, Simmerath, Alemanha#1316
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburgo, Alemanha3123000063
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburgo, Alemanha3123000047
EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm MeterWorld precision instruments, Sarasota, EUAEVM-MT-03-01
FBSSigma-Aldrich, Schnelldorf, AlemanhaF7524Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
ForskolinSigma-Aldrich, Schnelldorf, AlemanhaF6886Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
gasprofi 1 SCS microWLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Alemanha60,04,000
Gastrin 1MedChemExpress, New Jersey, USAHY-P1097Loja a -20 °C. Descongele quando necessário
GlutamaxThermo Fisher Scientific, Waltham, EUA35050061Loja a 4 °C. 
HClSigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha1090571000Armazenar em temperatura ambiente
HEPESSigma-Aldrich, Schnelldorf, AlemanhaH0887Armazenar em 4 ° C
Herasafe 2025 Gabinete de Segurança Biológica Classe IIThermo Fisher Scientific, Waltham, EUAIncubadora 51033316
ICO105Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Alemanha62,20,143
IndometacinaMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaI7378Armazenar em temperatura ambiente
KClMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.04936Armazenar em temperatura ambiente
L-GlutaminaSigma-Aldrich, Schnelldorf, AlemanhaG7513Loja a -20 °C. Descongele quando necessário
LWRN Supernatantselfmade Armazene a -20 ° C. Descongele quando necessário. O suplemento LWRN é produzido de acordo com Miyoshi et al. (2012
)Matriz de Membrana Basal Matrigel, sem LDEV, 10 mLCorning Incorporated - Life Sciences354234Store a -20 °C. Descongele cuidadosamente no gelo quando necessário
Megafuge 1.ORHeraeus Instruments, Osterode, Alemanha75003060
MgCl2.6 H2OMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.05833Armazenar em temperatura ambiente
Na2HPO4.2H2OMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.06580Armazenar em temperatura ambiente
N-Acetil-L-cisteínaSigma-Aldrich, Schnelldorf, AlemanhaA7250Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
NaClMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.06404Armazenar em temperatura ambiente
NaH2PO4. H2OMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.06346Armazenar em temperatura ambiente
NaHCO3Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.06329Armazenar em temperatura ambiente
Câmara melhorada NeubauerGlaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhö n, Alemanha40442712
Microscópio invertido Olympus IX70Olympus Corporation, Hamburgo, Alemanha
Pen/StrepThermo Fisher Scientific, Waltham, EUA15140122Loja a -20 °C. Descongele quando necessário
PolymyxinBSigma-Aldrich, Schnelldorf, AlemanhaP4932-1MUArmazene a -20 °C. Descongele quando necessário
Suporte de microscópio Primovert com fototubo binocularZeiss415510-1101-000
rm EGFPrepotech, New Jersey, USA315-09Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
SB202190MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10295Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário
Snapwell 3801Corning Incorporated - Life Sciences3801
Tripsina/EDTAThermo Fisher Scientific, Waltham, EUA25300054
Ussing Base SystemScientific Instruments, Simmerath, Alemanha#1317
Ussing Diffusion ChamberScientific Instruments, Simmerath, AlemanhaSKU 1307
Voltage/Current Clamp VCC6Scientific Instruments, Simmerath, AlemanhaSKU 1310
Y27632MedChemExpress, New Jersey, EUAHY-10583Armazene a -20 graus C. Descongele quando necessário

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