As concussões pediátricas podem resultar em sequelas a longo prazo com perturbações fisiológicas e psicológicas. Este modelo de camundongo com concussão pediátrica resulta em neuroinflamação de longo prazo, alterações na substância branca e modificações neuronais com disfunção comportamental. O modelo pode ser adaptado a locais de impacto diferencial ou concussões repetidas para avaliar mudanças ao longo da vida.
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Artigo de método
Um modelo de concussão pediátrica em camundongos: traumatismo craniano fechado com distúrbios de longo prazo (CHILD)
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Concussões e lesões cerebrais traumáticas leves (mTBI) durante a infância representam um risco significativo à saúde, com muitos pacientes mais tarde na vida exibindo resultados fisiológicos, neurológicos e psicossociais debilitantes. Os mecanismos fisiopatológicos celulares e moleculares são relativamente desconhecidos, e essa lacuna significativa impede efetivamente investigações sobre estratégias terapêuticas específicas para mitigar sequelas crônicas. Nenhum modelo de concussão animal recapitula todas as características relatadas em seres humanos, e os modelos atuais são projetados para responder a questões específicas de pesquisa. Decidimos desenvolver uma concussão juvenil que recapitula a sintomatologia clínica precoce e de longo prazo encontrada, denominada Traumatismo Craniano Fechado com Transtorno de Longo Prazo (CHILD). Neste modelo, uma força concussiva por meio de um impactador eletromagnético é aplicada à cabeça de um camundongo pós-natal 17º dia (P17) levemente anestesiado e sem restrições, permitindo a rotação livre da cabeça. Os camundongos são colocados em uma folha de estanho bem esticada em um dispositivo estereotáxico, e o impactador é cuidadosamente alinhado com a região cortical alvo. O impactor eletromagnético facilita a seleção da profundidade de impacto, permanência e duração para determinar a gravidade da lesão. Um ponto forte desse modelo é que ele permite a rotação da cabeça, uma característica clínica importante. Após o impacto, os ratos são imediatamente monitorados quanto ao tempo de endireitamento e tempo para explorar seu ambiente, seguido por seu retorno à barragem. O aumento da gravidade da concussão resulta em sangramentos intracranianos em um subconjunto de camundongos. Os camundongos podem ser monitorados rotineiramente quanto ao comportamento e neuroimagem ao longo de sua vida, conforme desejado. Várias gravidades de lesões imitam a natureza heterogênea das concussões juvenis. O modelo CHILD padrão atual não exibe fratura craniana, nenhuma alteração de neuroimagem convencional observável (semelhante à clínica), mas leva a morte neuronal progressiva e persistente, ressonância magnética de difusão alterada, atividade neuronal e plasticidade modificadas, aumento da gliose e perturbações comportamentais progressivas com a idade. Em resumo, este modelo CHILD imita as características iniciais e de longo prazo observadas em muitos pacientes com concussão clínica.
Introdução
O traumatismo cranioencefálico pediátrico (TCE) é um grande problema de saúde, pois representa a principal causa de consultas médicas de emergência pediátrica e está associado a resultados de saúde debilitantes mais tarde na vida. Mesmo o TCE leve (mTBI), que representa 75% de todos os casos de TCE1, leva a anormalidades de longo prazo, incluindo disfunções fisiológicas, psicológicas, neurológicas e cognitivas2. Apesar da alta ocorrência de mTBI pediátrico e seus significativos riscos à saúde associados, os mecanismos patológicos, celulares e moleculares que precedem os déficits crônicos ainda são pouco explorados. Essa lacuna no conhecimento impede o desenvolvimento de tratamentos e métodos diagnósticos eficazes para mTBI pediátrico.
Os modelos de TCE de roedores adultos incluem queda de peso, impacto cortical controlado e lesão por percussão de fluido e podem ser titulados para provocar lesões moderadas a graves (dependendo das medidas de resultado)3,4. Muitos desses modelos adultos foram adaptados para TCE pediátrico 5,6. Durante a última década, modelos de mTBI foram desenvolvidos em roedores com traumatismo cranioencefálico fechado, bem como em modelos rotacionais7. No entanto, a implementação desses modelos em roedores em desenvolvimento é escassa em comparação com a literatura de TCE em adultos8. Para abordar a relevância clínica, abrangendo uma ampla gama de gravidades que modelam a heterogeneidade clínica pediátrica, este estudo desenvolveu o modelo de TCE de Traumatismo Cranioencefálico Fechado com Distúrbio de Longo Prazo (CHILD). O CHILD é um modelo de concussão não cirúrgica e desenfreada usando camundongos P17, uma idade de desenvolvimento que corresponde ao pico de mielinização observado em crianças de 2-3 anosde idade9. Uma força concussiva é fornecida usando um impactador eletromagnético sobre o córtex somatossensorial de um camundongo levemente anestesiado com isoflurano. O impacto da cabeça desenfreada resulta em forças rotacionais no cérebro10, conforme relatado em muitos relatórios clínicos de concussão. Consistente com o mTBI clínico, o modelo CHILD não leva à fratura do crânio ou anormalidade visível na neuroimagem convencional.
O modelo CHILD tem várias vantagens. Primeiro, características patológicas precoces e de longo prazo foram observadas em CHILD, imitando as características clínicas patológicas observadas em pacientes com concussão juvenil. Foi observada gliose tardia, ressonância magnética de tensor de difusão alterada e perturbações comportamentais progressivas com a idadede 10,11 anos, atividade neuronal modificada e plasticidade11,12. Curiosamente, consequências periféricas insuspeitas também foram encontradas com anormalidades cardíacas em longo prazo após uma única lesão pediátrica13. Em segundo lugar, esse modelo é replicável e mostrou resultados comparáveis entre pesquisadores e entre laboratórios13. Em terceiro lugar, o modelo CHILD é flexível e pode ser expandido para encapsular a natureza heterogênea dos TCEs. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que diferentes velocidades e profundidades de impacto resultam em diferentes gravidades10,11. Finalmente, um ponto forte adicional deste modelo é que o CHILD pode ser administrado repetidamente e pode ser facilmente aplicado a locais diferenciais para sondar respostas a lesões repetidas e identificar regiões cerebrais vulneráveis.
No geral, o modelo CHILD replica mTBI e concussão pediátrica clínica e serve como uma ferramenta de pesquisa para facilitar a compreensão das características fisiopatológicas do mTBI pediátrico. Embora nenhum modelo encapsule todos os aspectos das características descritas em casos reais de TCE, este modelo pode abordar muitas das questões de pesquisa pendentes que permanecem sem resposta.
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Protocolo
Os experimentos foram reproduzidos em 2 locais, a Universidade de Bordeaux (França) e a Universidade da Califórnia Riverside (CA, EUA).
Em Bordeaux, todos os experimentos foram realizados em camundongos P17 C57Bl6J machos e fêmeas criados no biotério da Universidade. Os reprodutores iniciais foram obtidos de uma fonte comercial e criados em condições padrão com um ciclo escuro/claro de 12/12 h, uma temperatura de 21 °C ± 1 °C e uma umidade de 55% ± 10%, e comida e água fornecidas ad libitum. Os procedimentos experimentais estão de acordo com os regulamentos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Bordeaux, as leis francesas que regem o uso de animais de laboratório (autorização # 29324-2021012118549817 v3), as diretivas do Conselho Europeu (86/609 / EEC) e as diretrizes ARRIVE. Este protocolo, sendo um modelo leve de lesão cerebral traumática, não produz dor ou angústia. Como tal, não requer nenhum controle específico da dor fora do controle regular da dor. O desmame dos filhotes (TBI, Shams) foi efetivo em P25.
Em Riverside, camundongos fêmeas C57Bl6J prenhes E13 foram obtidos comercialmente, e todos os experimentos foram realizados nas ninhadas resultantes em filhotes machos e fêmeas com idade P17. Os animais foram criados com um ciclo escuro / claro automatizado de 12/12 h e uma temperatura de 21 °C. Barragens e filhotes tinham acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Riverside e cumpriram a Lei de Bem-Estar Animal e a política do Serviço de Saúde Pública. Todos os filhotes (TBI, Sham) naquela instalação foram desmamados em P21.
Os detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Etapas preliminares
- Para evitar hipotermia, aqueça a câmara para indução anestésica e as gaiolas de recuperação com antecedência com almofadas de aquecimento.
- Regular o aparelho estereotáxico com o pêndulo montado num ângulo de 90°.
- Verifique se todas as peças estão devidamente apertadas e fixadas e se o pistão está firmemente aparafusado ao pêndulo.
- Corte uma folha de alumínio que caiba no aparelho estereotáxico (neste caso, 18 cm x 30 cm). O alumínio usado aqui é de qualidade padrão de alumínio. Enrole a moldura estereotáxica com a folha para formar uma almofada na qual o animal será colocado. Prenda a posição e a tensão da folha com fita adesiva comum para sustentar o peso do animal.
- Ligue o controlador do pêndulo e, em função da gravidade da lesão, ajuste a velocidade do impacto para 2 m.s-1 para grau 1 (G1) ou 3 m.s-1 para grau 2 (G2) para um impacto mais grave (modificar este parâmetro afetará a gravidade da concussão).
- Pese os animais. Em P17, o peso dos animais deve ser superior a 5,9 g para camundongos C57Bl6. Os animais que se enquadram nesse peso são excluídos.
NOTA: Para alguns estudos, foram utilizados camundongos CD1 e, para P17, o limite foi fixado em mais de 6,5 g (dados pessoais).
2. Procedimento de lesão cerebral traumática leve juvenil
- Anestesiar o camundongo com uma exposição de 5 minutos ao isoflurano. Defina a composição do gás para uma mistura de 2,5% (neste caso, o transportador é uma mistura de ar sintético com 21% de oxigênio) com uma vazão de 1,5 L/min.
NOTA: A partir desta etapa, todas as ações devem ser feitas rapidamente, pois os animais não impactados acordarão em 5 minutos. - Posicione a cabeça do mouse sob o impactor. O filhote deve ser espalhado em todos os comprimentos. A ponta tem 3 mm de diâmetro e é coberta com borracha para minimizar o efeito do metal no crânio.
- Baixe o pêndulo colocando o botão na posição Estender .
- Abaixe aproximadamente o impactor e posicione o mouse de forma que o impactor fique apenas entre as orelhas. Em seguida, deslize o mouse para que a ponta do pistão seja movida para frente para o equivalente a uma ponta de pistão e uma ponta de pistão para a esquerda do animal (veja a Figura 1).
NOTA: Os animais simulados são posicionados ligeiramente afastados do pistão (nenhuma parte do animal deve ser impactada). - Abaixe o impactor de modo que ele entre em contato com a cabeça do animal (Figura 1E2).
- Coloque o pêndulo em Retração (Figura 1E3).
- Para determinar a gravidade da lesão, mova o pistão 1 mm para baixo para o grau 1 (G1). Para um grau de impacto mais severo 2 (G2), mova o pistão 3 mm para baixo (Figura 1E4).
- Defina o tempo de permanência para 0.1 s, independentemente da gravidade (modificar este parâmetro não afetará a gravidade da concussão).
- Pressione Impact no botão direito (Figura 1E5).
- Coloque rapidamente o botão esquerdo na posição desligado para que o sistema não superaqueça. Consulte o fluxograma para obter mais informações (Figura 2).
Figura 1: Posicionamento da ponta do impactor. (A) A ponta do impactor é posicionada primeiro na linha média entre as orelhas. (B) A ponta é então movida 3 mm para frente (o equivalente a um diâmetro de ponta). (C) Finalmente, a ponta do pistão é movida 3 mm no lado esquerdo do mouse. (D, E) Posições possíveis da ponta do impactor em relação ao cilindro magnético. (D) O pêndulo tem 3 posições em relação ao corpo do êmbolo (neutro, retraído ou estendido/impacto) com alcance de 5 mm entre elas. (E) Posições da ponta do impactor em relação à superfície do crânio nas diferentes fases do procedimento. (1) Posição do impactor na posição neutra; (2) o pistão é movido para tocar suavemente o crânio do animal (etapa 2.5); (3) o pêndulo é então colocado para retrair (passo 3.6); (4) Todo o corpo do pêndulo é deslocado x mm para baixo (passo 2.7). Para o grau G1, uma velocidade de impacto (y) de 2 m.s-1 com 1 mm de profundidade (x) para G1 ou uma velocidade de impacto (y) de 3 m.s-1 com 3 mm (x) de profundidade para G2. (5) Uma vez pressionado o impacto da alavanca, a ponta do impactor move-se x mm abaixo da superfície do crânio a uma velocidade y durante o tempo de permanência ao voltar para a posição neutra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxograma CHILD. Fluxograma detalhando as etapas para induzir CHILD em camundongos PND17 codificados por cores para denotar diferentes fases de indução de concussão. As fotografias da configuração incluem (A) toda a configuração de indução CHILD (o dispositivo de anestesia não é visível), incluindo o controlador de impacto, o dispositivo estereotáxico com o impactor e a ponta posicionados acima da folha de estanho esticada e a caixa de recuperação localizada no topo de uma almofada de aquecimento. (B) Ponta de impacto de borracha (3 mm) com escala. (C) O dispositivo estereotáxico com folha de estanho esticada ao longo da estrutura estereotáxica e o solenóide do impactor com a ponta de impacto posicionada acima da folha. (D) Câmara de recuperação assentada na almofada térmica. (E) O controlador de impacto com duas chaves de controle, destacadas como no fluxograma (caixa vermelha = estender/retrair/desligar; caixa roxa = alternar impacto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Acompanhamento pós-trauma
NOTA: As etapas a seguir podem ser gravadas em vídeo para análise offline, permitindo que o experimentador execute CHILD em vários animais seguidos. No entanto, avaliações regulares e repetidas do bem-estar animal devem ser realizadas.
- Observe a duração da apneia, se presente (imediatamente após o impacto) e se houve rotação da cabeça durante o impacto.
- Posicione o mouse em seu flanco direito em uma gaiola de recuperação.
- Observe o tempo de endireitamento do mouse (empinando em 4 pernas) e o tempo de retomada de um comportamento exploratório. Normalmente, os camundongos simulados acordam dentro de 3-4 minutos e retomam um comportamento exploratório 3-4 minutos depois (Figura 3). Os camundongos CHILD acordam dentro de 7-12 minutos após o impacto (Figura 3A) e retomam a exploração dentro de 12-18 minutos após o impacto (Figura 3B), de acordo com o sexo e a gravidade do impacto (Figura 3A, B).
NOTA: Se o animal impactado não retomar seu comportamento exploratório em 30 minutos, o animal será excluído. - Depois de totalmente recuperado, devolva os animais à gaiola de origem. Neste ponto, o comportamento de camundongos simulados e CHILD (gravidade G1 ou G2) deve ser exatamente semelhante, e os grupos de animais não devem ser distinguíveis dentro da ninhada.
NOTA: Os animais podem ser mantidos até 18 meses após a lesão14 nas condições indicadas no início dos métodos. As avaliações de resultados comportamentais podem ser realizadas usando uma bateria de testes em associação com medições de ressonância magnética, imagens de miniscópio, histologia e imuno-histoquímica12. A imuno-histoquímica para GFAP e NeuN pode ser usada em pontos iniciais para validar o modelo e a presença de alterações teciduais.
4. Imuno-histoquímica
NOTA: Um dia após a lesão, os animais dos grupos G2 e sham (n = 4 camundongos para G2 e n = 4 para Sham) foram anestesiados e perfundidos transcardialmente com paraformaldeído (PFA) a 4% preparado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,1 M, pH 7,4 a 4 °C. Os cérebros foram extraídos10 do crânio e imersos na mesma solução de PFA durante a noite e, em seguida, transferidos para PBS com azida sódica (0,1%) antes do corte. Os cortes coronais foram então preparados com 50 μm de espessura usando um vibratome. Para armazenamento prolongado, os cortes foram colocados em meio crioprotetor (30% de etilenoglicol e 20% de glicerol em PBS) a -20 °C até o uso. Para caracterizar o impacto da concussão na gliose cerebral e na perda neuronal, a imuno-histoquímica direcionada a GFAP e NeuN foi realizada conforme descrito abaixo.
- Lave as seções cerebrais 4 vezes por 10 min em PBS.
- Transfira as seções em solução de bloqueio (1% BSA, 0,3% Triton X-100 em PBS) por 10 min em temperatura ambiente (RT).
- Incubar secções durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio: anti-GFAP de galinha (1:3000) e anti-NeuN de coelho (1:500).
- Lave as fatias 4 vezes por 10 min em PBS sob agitação.
- Em seguida, transfira as seções em solução de bloqueio contendo os anticorpos fluorescentes secundários diluídos 1:1000 por 1 h em RT, Alexa-Fluor-488-nm anti-coelho para cabras e Alexa-Fluor-568-nm anti-cabra para frango.
- Lave então as seções 4 vezes por 10 min em PBS sob agitação.
- Monte as seções em slides usando um meio de montagem e adicione uma lamínula. Manter os diapositivos a 4 °C até à aquisição da imagem.
- Adquira imunofluorescência usando um microscópio de epifluorescência e um software microgerenciador. Use um plug-in de costura com uma lente de 10x para obter imagens lado a lado dos hemisférios ipsilateral e contralateral.
NOTA: A coloração de controle negativo em que o anticorpo primário ou anticorpo secundário foi omitido não mostrou marcação detectável. Para uma análise de imagem mais detalhada, o software Fiji15 pode ser usado para quantificar os parâmetros de imunomarcação em várias regiões de interesse16.
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Resultados
O modelo CHILD é um modelo relativamente rápido e reprodutível de mTBI em camundongos pediátricos, permitindo também variações na gravidade e localização. Os camundongos CHILD, como esperado, exibiram tempos de recuperação significativamente mais longos do traumatismo craniano fechado (Figura 3). Quando as coortes (n = 36 fêmeas sham, n = 140 machos sham, n = 30 fêmeas G1, n = 55 machos G1, n = 32 fêmeas G2, n = 141 machos G2) foram agregadas, observou-se um atraso no tempo de endireitamento...
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Discussão
Etapas críticas no protocolo
O protocolo CHILD descrito aqui requer o uso de um impactor eletromagnético (Figura 2A) que (1) padroniza os parâmetros de impacto (velocidade, profundidade, duração), (2) garante a reprodutibilidade dentro e entre os laboratórios e (3) está prontamente disponível comercialmente. Outro componente crítico é a ponta do impactor que atinge a cabeça do roedor. Uma variedade de possibilidades pode ser usada, varian...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este artigo de método foi financiado por Eranet Neuron Neuvasc (Badaut), Agence Nationale de la Recherche Nanospace (Badaut), CNRS IRP IINOVAtion (Badaut) e NIH NINDS Grant No. 1R01NS119605 (Obenaus, Badaut) e 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo). A Figura 1 é criada com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | A7030 | |
| C57Bl6J ratos | Charles River Laboratory France CRLF 9 All. Moulin Berger, 69130 e Eacute; cully, França | Bordeaux | |
| Impactor eletromagnético | Leica Biosystems, Richmond, IL EUA | Impact One impactor | |
| Microscópio de epifluorescência | Olympus, BX41, Center Valley, PA | ||
| Etilenoglicol | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | 102466 | |
| GFAP anticorpo primário | Millipore, Billerica, MA | AB5541 | anticorpo secundário anti-GFAP GFAP de frango |
| Molecular Probes, Invitrogen | A11034 | cabra anti-coelho AlexaFluor 488 | |
| Glicerol | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | G5516 | |
| Folha de alumínio resistente | Kirkland | RK611 | obtida no |
| software Cosco Micromanager | (NIH, EUA | ||
| NeuN anticorpo primário | AbCam, Discovery Drive, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, CB2 0AX, Reino Unido | AB128886 | coelho anti-NeuN |
| anticorpo secundário NeuN | Sondas moleculares, Invitrogen | A11041 | cabra anti-frango AlexaFluor 568 |
| PBS | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | P5493 | |
| PFA | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | 1.04003 | |
| Azida | sódicaSigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | 26628-22-8 | |
| Quadro estereotáxico - base | Instrumentos KOPF 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis | 900-C | |
| Quadro estereotáxico - manipulador de eletrodos | KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis | 960 | |
| Quadro estereotáxico - u-frame | KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis | 900-U | |
| Triton x-100 | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex França | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000-10 | Meio de montagem |
| Vibratome | Leica Biosystems, Richmond, IL EUA | VTS1000 | |
| Laboratório Jackson O Laboratório Jackson 600 Main Street Bar Harbor, ME USA 04609 | UCR |
Referências
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Reimpressões e permissões
