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Artigo de método

Detecção de Suscetibilidade a Drogas e Interações Medicamentosas em Mycobacterium tuberculosis usando Microtitulação de Resina e Ensaio Quadriculado

923 vistas

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DOI:

10.3791/67672

⸱

24 de outubro de 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar e padronizar o ensaio de microtitulação de resazurina (REMA) e sua variação quadriculada para avaliar a suscetibilidade a drogas e perfis de interação de Mycobacterium tuberculosis. Esse método fornece insights, in vitro, para otimizar combinações de medicamentos a serem usados em esquemas de tratamento e combater a tuberculose multirresistente.

Resumo

O surgimento da tuberculose multirresistente (MDR-TB) requer métodos rápidos e precisos de teste de suscetibilidade a medicamentos (DST) para orientar o tratamento eficaz. Este estudo apresenta uma metodologia que combina o ensaio de microtitulação de resazurina (REMA) e o ensaio quadriculado para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e avaliar as interações medicamentosas de medicamentos antituberculose contra Mycobacterium tuberculosis. O REMA, adaptado para um formato de 96 poços, aproveita a redução do corante resazurina por M. tuberculosis metabolicamente ativo como um indicador visual de suscetibilidade a medicamentos. Concentrações variadas de drogas anti-TB são testadas contra isolados de M. tuberculosis , e mudanças de cor são observadas para determinar a CIM. Posteriormente, um ensaio quadriculado é empregado para avaliar potenciais efeitos sinérgicos, aditivos ou antagônicos entre combinações de medicamentos. Este método simples e barato produz resultados em sete dias, oferecendo uma vantagem significativa sobre os métodos tradicionais de horário de verão. Este método fornece informações valiosas sobre o DST de isolados de M. tuberculosis e facilita a identificação de combinações de medicamentos promissores para melhores resultados de tratamento contra MDR-TB.

Introdução

A tuberculose (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo um formidável desafio de saúde global, exacerbado pelo surgimento de cepas resistentes a medicamentos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2023, houve uma estimativa de 10,6 milhões de novos casos de TB e 1,3 milhão de mortes, destacando a necessidade premente de estratégias diagnósticas e terapêuticas mais eficazes1. A TB multirresistente (TB-MDR) e a TB extensivamente resistente (TB-XDR) representam grandes desafios para o controle da doença devido à complexidade, toxicidade e duração prolongada dos regimes de tratamento atuais 2,3.

A recente introdução de novos agentes anti-TB, como bedaquilina e delamanida, visando vias bioquímicas únicas em M. tuberculosis, representa um avanço no tratamento da TB 4,5. Esses medicamentos foram aprovados principalmente para uso em casos de TB resistente a fluoroquinolonas e rifampicina como parte de esquemas de TBMR mais longos e mais curtos endossados pela OMS 6,7. No entanto, a determinação de combinações ideais de medicamentos e regimes de dosagem, particularmente quando esses agentes são usados em conjunto com terapias estabelecidas, continua sendo uma área crítica de investigação 8,9. Os métodos atuais para testes de suscetibilidade a medicamentos (DST), embora confiáveis, geralmente consomem muito tempo, recursos e são impraticáveis para avaliar combinações complexas de medicamentos em um ambiente clínico ou de pesquisa10. Isso ressalta a necessidade de ensaios fenotípicos simples e escaláveis que possam avaliar a eficácia do medicamento e os perfis de interação em M. tuberculosis.

Dentre essas abordagens fenotípicas, o ensaio de microtitulação de resazurina (REMA) emergiu como um método amplamente aceito e convencional para avaliar a suscetibilidade a drogas. O ensaio é baseado na redução do corante resazurina azul a resorufina rosa por bactérias metabolicamente ativas, servindo como um indicador visual da viabilidade celular. Embora popularizado por Palomino et al. em 200211, o princípio do uso da resazurina para avaliar o crescimento bacteriano remonta ao trabalho de Pital et al.12. Nas últimas duas décadas, o método REMA foi amplamente validado e incorporado aos procedimentos operacionais padrão para pesquisa de micobactérias e testes diagnósticos 13,14,15.

Complementando o REMA, o ensaio quadriculado, conforme introduzido por Caleffi-Ferracioli et al., amplia a utilidade do REMA, permitindo estudos de interação com dois medicamentos em um formato de microdiluição usando a mesma leitura baseada em resazurina16. Embora promissor em princípio, esse método continua sendo principalmente uma ferramenta de pesquisa útil para a triagem de possíveis combinações de medicamentos sinérgicos ou antagônicos durante a avaliação pré-clínica precoce, em vez de um ensaio diagnóstico de rotina.

Este manuscrito não apresenta o REMA ou sua variante quadriculada como novos métodos. Em vez disso, o objetivo deste estudo é fornecer uma representação visual de uma metodologia útil e validada para determinação de CIM e teste de interação medicamentosa, que foi descrita e aplicada com sucesso em estudos anteriores. Fornecemos um protocolo passo a passo com orientação detalhada sobre preparação de inóculo, titulação de medicamentos, layout da placa, interpretação do MIC e análise de interação quadriculada. Este manuscrito tem como objetivo apoiar o uso mais amplo e consistente de ensaios REMA e checkerboard no desenvolvimento de medicamentos para TB e farmacologia experimental.

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Protocolo

NOTA: Os produtos químicos e materiais utilizados nos experimentos de exemplo estão disponíveis no arquivo Tabela de Materiais.

1. Preparação do meio 7H9-S

  1. Para 100 mL de meio 7H9-S, pesar 0,47 g de pó 7H9 e 0,1 g de casitona e, em seguida, dissolver em 90 mL de água destilada; mexa até dissolver totalmente.
  2. Esterilizar o caldo num balão de 250 ml com um autoclave a 121 °C durante 15 min.
  3. Depois de autoclavado e resfriado, adicione 10 mL de suplemento de Albumina Dextrose Catalase Oleica (OADC) e 0,5 mL de glicerol.
  4. Incubar durante a noite a 37 °C para verificar a esterilidade.
    NOTA: A esterilidade do meio 7H9-S preparado é verificada incubando-o durante a noite a 37 °C. O meio deve permanecer claro no dia seguinte, sem turbidez observada.
  5. Armazene o meio 7H9-S a 4 °C, longe da luz direta.

2. Preparação do inóculo de M.tuberculosis

  1. Preparação de inóculo a partir de cultura de M. tuberculosis cultivada em meio sólido Lowenstein Jensen (LJ)
    1. Utilizando uma alça de inoculação estéril, recolher uma alça completa de cultura de M. tuberculosis de um meio LJ recentemente cultivado (21-28 dias de idade).
      NOTA: Evite raspar muito fundo no meio, o que pode perturbar as colônias mais velhas.
    2. Coloque as bactérias coletadas em uma garrafa de bijuteria estéril contendo esferas de vidro estéreis e 2,5 mL de caldo 7H9-S. Certifique-se de que as contas de vidro ajudem na ruptura mecânica de aglomerados durante o vórtice.
      NOTA: Culturas frescas entre 21-28 dias são essenciais para garantir resultados confiáveis do teste de suscetibilidade. Evite usar culturas mais antigas, pois elas podem levar a resultados inconsistentes.
    3. Prenda a bijuteria e o vórtice vigorosamente por pelo menos 1 min. Garanta a mistura contínua para quebrar os aglomerados bacterianos, resultando em uma suspensão relativamente turva. O objetivo é uma distribuição homogênea de bactérias dentro do meio.
    4. Transfira a suspensão de cultura para uma garrafa de bijuteria fresca e deixe-a repousar sem ser perturbada por 15 min. Esta etapa permite que os aglomerados bacterianos maiores se depositem no fundo.
    5. Usando o padrão McFarland 1.0 como referência, verifique a turbidez da suspensão da cultura e ajuste com caldo 7H9-S até que a turbidez desejada seja alcançada.
      NOTA: Um padrão McFarland, normalmente 1.0, é usado como referência para turbidez equivalente a aproximadamente 1.97 × 106 UFC / mL17. O padrão é preparado combinando 0,1 mL de cloreto de bário a 1% e 9,9 1 mL de ácido sulfúrico a 1%, resultando em um precipitado fino de sulfato de bário, que fornece a turbidez. A suspensão bacteriana é visualmente comparada com o padrão McFarland, segurando os dois tubos contra um fundo branco com linhas pretas. A turbidez da suspensão bacteriana é ajustada para corresponder ao padrão.
  2. Preparação do inóculo a partir de cultura de M. tuberculosis cultivada em meio líquido 7H9
    1. Usando uma pipeta estéril, transfira 2,5 mL de cultura de M. tuberculosis (2-3 semanas de idade) para uma garrafa de bijuteria fresca com esferas de vidro.
    2. Vortex a mistura por pelo menos 1 min para garantir uma suspensão homogênea. A ação de vórtice ajuda a quebrar quaisquer aglomerados.
    3. Transfira os 2,5 mL de suspensão de cultura para uma garrafa de bijuteria fresca e deixe agir por 15 minutos para permitir que os grumos se depositem no fundo.
    4. Compare a turbidez com o padrão McFarland 1.0 e ajuste usando caldo 7H9-S para atingir a concentração necessária.
  3. Diluição do inóculo
    1. Prepare uma diluição de 1:10: Para diluir o inóculo, adicione 1 mL da suspensão bacteriana a 9 mL de caldo 7H9-S em um recipiente estéril (isso dará aproximadamente 1,97 × 105 UFC / mL).

3. Preparação de antibióticos e armazenamento

  1. Preparação de estoque e soluções de trabalho: Prepare os medicamentos usados no experimento de exemplo, juntamente com seus métodos de preparação de estoque e solução de trabalho, conforme resumido na Tabela 1.
    1. Isoniazida (INH ou I): Para preparar uma solução estoque de 1 mg / mL de isoniazida, dissolva 2 mg de pó de isoniazida em 2,0 mL de água destilada. Esterilize a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
    2. Moxifloxacina (MOX ou M): Para preparar uma solução estoque de 1 mg / mL de Moxifloxacina, dissolva 2 mg de pó de moxifloxacina em 2,0 mL de água destilada. Esterilize a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
    3. Bedaquilina (BDQ ou J): A bedaquilina é pouco solúvel em água. Para preparar uma solução estoque de 1 mg / mL, dissolva 2 mg de pó de bedaquilina em 2,0 mL de DMSO. Esterilize a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
    4. Delamanida (DEL ou D): Semelhante à bedaquilina, a delamanida tem baixa solubilidade em água. Para preparar uma solução estoque de 1 mg / mL, dissolva 2 mg de pó de delamanida em 2,0 mL de DMSO. Esterilize a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
  2. Armazenamento: Alíquota de 100 μL de cada solução estoque de medicamento em criogeniais estéreis e armazene-os a -20 °C por até 3 meses. Depois de descongelado, descarte qualquer solução restante. Não congele novamente.

4. Preparação da solução de Resazurin e armazenamento

  1. Dissolva a resazurina até uma concentração final de 0,01% ou 0,02% em água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm para esterilização.
  2. Conservar a solução esterilizada de resazurina a 4 °C até 1-2 semanas, protegida da luz para evitar a degradação.

5. Preparação da placa REMA

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter um guia visual sobre a configuração da placa de microtitulação REMA de 96 poços. A placa de 96 poços fornece espaço suficiente para executar ensaios de medicamentos em duplicata para cada medicamento em seis diluições duplas.

  1. Adicione o caldo 7H9-S: Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de caldo 7H9-S às colunas 2-11, linhas BG. Certifique-se de que a distribuição seja uniforme em todos os poços.
  2. Adicione soluções de medicamentos: Adicione 100 μL da solução de INH de trabalho aos poços B2 e B6. Da mesma forma, adicione as soluções de trabalho MOX, DEL e BDQ aos seus respectivos poços (B3 e B7, B4 e B8, B5 e B9).
  3. Dilua as concentrações do medicamento: Usando uma pipeta multicanal, execute diluições seriais duplas das linhas B a G (colunas 2-9), garantindo o descarte dos 100 μL finais após a mistura na linha G.
  4. Poços de controle de crescimento: Adicione 100 μL de caldo 7H9-S aos poços B10 e C10 para o controle de crescimento.
  5. Controles negativos e de esterilidade: Adicione 200 μL de caldo 7H9-S aos poços B11 e C11 para servir como controles negativos e de esterilidade.
  6. Evitar a evaporação: Adicione 200 μL de água destilada estéril a todos os poços externos para minimizar a evaporação durante a incubação.
  7. Inocular placas: Inocular cada alvéolo com 100 μL da suspensão de cultura diluída 1:10, exceto o poço de controle negativo. Garanta uma inoculação uniforme em todos os poços.
  8. Selar e incubar: Sele as placas em sacos plásticos para manter a esterilidade e incube a 37 °C por 7 dias.

6. Ensaio de titulação quadriculada REMA

NOTA: Consulte a Figura 2A, B para obter um guia visual sobre o modelo de ensaio de titulação quadriculada REMA para combinações de medicamentos (por exemplo, BDQ e DEL).

  1. Dilua os medicamentos vertical e horizontalmente: Dilua o primeiro medicamento (BDQ) verticalmente (linhas BH) e o segundo medicamento (DEL) horizontalmente (colunas 2-8) para gerar várias combinações de dois medicamentos.
    NOTA: Prepare a solução de trabalho diluída em série em um frasco estéril (de 4 μg / mL - 0,06 μg / mL) para um medicamento diluído horizontalmente.
  2. Adicionar solução de trabalho BDQ para diluição vertical: Adicionar 100 μL da solução BDQ de trabalho aos poços B2 e B8.
  3. Adicione o caldo 7H9-S: Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de caldo 7H9-S às colunas C2-H8. Certifique-se de que a distribuição seja uniforme em todos os poços.
  4. Dilua as concentrações do medicamento: Usando uma pipeta multicanal, execute diluições duplas das linhas BH (colunas 2-8), garantindo o descarte dos 50 μL finais após a mistura na linha H.
  5. Adicione a solução de trabalho DEL para diluição horizontal: Adicione soluções de trabalho diluídas em série dos medicamentos de 4 μg / mL a 0,06 μg / mL aos poços correspondentes.
  6. Poços de controle de crescimento: Adicione 100 μL de caldo 7H9-S aos poços B9 e C9 para o controle de crescimento.
  7. Controles negativos e de esterilidade: Adicione 200 μL de caldo 7H9-S aos poços B10 e C10 para servir como controles negativos e de esterilidade.
  8. Inocular placas: Inocular cada alvéolo com 100 μL da suspensão de cultura diluída 1:10, exceto o poço de controle negativo. Garanta uma inoculação uniforme em todos os poços.
  9. Selar e incubar: Sele as placas em sacos plásticos para manter a esterilidade e incube a 37 °C por 7 dias.

7. Incubação e interpretação dos resultados

  1. Coloração com resazurina: Após 7 dias de incubação, adicione 30 μL de resazurina (0,01%-0,02%) a cada poço. Sele e incube a placa durante a noite para o desenvolvimento da cor.
  2. Interprete a mudança de cor.
    1. Examine os poços visualmente sob luz branca consistente ou iluminação equilibrada à luz do dia.
      NOTA: O controle de crescimento (sem medicamento) deve ficar azul para rosa, indicando metabolismo bacteriano ativo. Uma cor azul indica inibição completa do crescimento. O rosa denota crescimento ativo, enquanto o roxo (uma tonalidade mista) representa inibição parcial.
    2. Compare a intensidade da cor com o controle negativo (somente mídia) e o controle positivo (crescimento bacteriano sem medicamento) para uma interpretação precisa. Para minimizar o viés do observador, use leituras independentes duplas ou fotografia de placa.
      NOTA: O julgamento visual pode variar de acordo com as condições de iluminação ambiente, portanto, uma iluminação consistente é essencial.
  3. Concentração inibitória mínima (CIM)
    1. Defina a CIM como a concentração mais baixa do fármaco na qual o poço permanece completamente azul, indicando ≥99% de inibição da atividade metabólica. Considere poços com cor roxa ou rosa indicativa de crescimento parcial ou completo.
      NOTA: A determinação da CIM pelo REMA aproxima-se dos princípios do método clássico de proporção, em que a CIM é considerada a menor concentração que inibe ≥99% do inóculo em relação ao controle livre de drogas. Embora o REMA não use contagens de UFC, o desfecho visual representa um correlato fenotípico desse limiar baseado em proporção. Essa interpretação está alinhada com protocolos colorimétricos previamente estabelecidos11,14.

8. Cálculo do índice de concentração inibitória fracionada (FIC)

NOTA: O índice de concentração inibitória fracionada (FIC) ajuda a determinar a interação entre dois medicamentos (sinergia, antagonismo ou indiferença). É calculado com base nos valores de CIM obtidos no ensaio quadriculado.

  1. Identifique a CIM para cada medicamento isoladamente: A partir do ensaio REMA, determine a CIM para cada medicamento quando usado individualmente.
  2. Identifique a CIM para cada medicamento em combinação: A partir do ensaio de titulação quadriculada, identifique a CIM de cada medicamento quando usado em combinação com o segundo medicamento.
  3. Calcule o FIC para cada medicamento.
    NOTA: Consulte a Tabela 2 para obter as fórmulas usadas para calcular o FIC e o índice FIC. A Tabela 3 mostra a CIM consolidada com base no ensaio REMA. Os valores representativos dos índices MIC e FIC são mostrados na Tabela 4.
    1. Interprete o índice FIC da seguinte maneira:
      FIC ≤ 0,5: Indique sinergia - os medicamentos trabalham juntos para inibir o crescimento de forma mais eficaz do que qualquer medicamento sozinho.
      FIC > 0,5 a < 4.0: Indica aditividade - o efeito combinado é igual à soma dos efeitos individuais.
      FIC ≥ 4.0: Indicam antagonismo - as drogas interferem na atividade umas das outras.
  4. Exemplo: Calcular o índice FIC para BDQ e DEL em H37Rv
    1. Determine a CIM do BDQ para H37Rv (por exemplo, 0,125 μg/mL). Em combinação com DEL, registre o MIC de BDQ como 0,03 μg/mL.
    2. Determine a CIM de DEL para H37Rv (por exemplo, 0,063 μg/mL). Em combinação com BDQ, registre o MIC de DEL como 0.125 μg/mL.
    3. Calcule o FIC para BDQ:
      FIC (BDQ) = MIC de BDQ em combinação/MIC de BDQ sozinho = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. Calcular FIC para DEL:FIC(DEL) = MIC de DEL em combinação / MIC de DEL sozinho = 0,125 / 0,063 = 1,98
    5. Adicione ambos os FICs para obter o Índice FIC:Índice FIC = FIC (BDQ) + FIC (DEL) = 0,24 + 1,98 = 2,26
    6. Interprete o resultado.
      NOTA: Um índice FIC de 2,26 está dentro da faixa de interação aditiva (>0,5 a <4,0), indicando que a combinação de BDQ e DEL tem um efeito aditivo na inibição do crescimento de M. tuberculosis.

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Resultados

Determinação da CIM de medicamentos anti-TB pelo ensaio REMA
As atividades de bedaquilina, delamanida, moxifloxacina e isoniazida foram avaliadas usando REMA contra H37RV sensível a drogas e isolado clínico resistente a drogas de M. tuberculosis. Bedaquilina, Delamanida e Isoniazida foram usadas na faixa de concentração de (1 μg/mL a 0,03 μg/mL) e Moxifloxacina na faixa de (2 μg/mL a 0,06 μg/mL). As suspensões bacterianas de isolados clínicos resistentes a medicamentos de M. tuberculosis<...

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Discussão

A ameaça global representada pela tuberculose resistente a medicamentos (TB-DR) tornou-se uma questão premente 1,19. Isso criou uma necessidade urgente de desenvolver métodos aprimorados e rápidos para testes de suscetibilidade a medicamentos (DST), particularmente para medicamentos anti-TB de segunda linha e mais novos. Tais métodos são essenciais para aprimorar as estratégias de tratamento, gerenciar os medicamentos anti-TB de ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frasco quadrado de 250 mL com tampaSchott Duran218203655Preparação de mídia
Caldo 7H9Becton Dickinson271310Meios de crescimento para M. tuberculosis (temperatura ambiente)
Placa de 96 poços com tampaCorning3596Microplacas de poliestireno de fundo plano transparente de 96 poços tratadas com TC, embaladas individualmente, com tampa, estéreis (temperatura ambiente)
ART-Tips (1000 μ L)TARSONS528106Filtros de polietileno hidrofóbico com  Ponta de filtro de polipropileno estéril (temperatura ambiente)
Dicas de arte (200 μ L)TARSONS528104Filtros de polietileno hidrofóbico com  Ponta de filtro de polipropileno estéril (temperatura ambiente)
Cloreto de bário di-hidratadoMerck217565Preparação padrão de McFarland (temperatura ambiente)
Bedaquilina (BDQ)Jansen e JansenPresente de Jansen e JansenMedicamento anti-TB (4 ° C)
CasitoneBecton Dickinson225930Suplemento para cultura bacteriana (temperatura ambiente)
Delamanida (DEL)Otsuka FarmacêuticaPresente da Otsuka PharmaceuticalsMedicamento anti-TB (4 ° C)
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich67-68-5Preparação de estoque de medicamentos (temperatura de sala)
Filtro 0.2 μ mMilliporeSLGVR33RS0,22  μ m PVDF, filtro de seringa descartável e estéril (temperatura ambiente)
GlicerolMerck356350Adicionado aos meios de cultura (Temperatura ambiente)
Alça de inoculaçãoSigma-AldrichI8263Para preparação de suspensão de cultura (temperatura ambiente)
Isoniazida (INH)Sigma-AldrichI3377-5GMedicamento anti-TB (4 ° C)
LJ inclinação médiaBD Micobactosel221414Meios de crescimento para M. tuberculosis (4 ° C)
Garrafa de boca estreita McCartney Bijou, 14 mLSupertek12.124.0014Para preparação de suspensão de cultura (temperatura ambiente)
Garrafa de boca estreita McCartney Bijou, 7 mLSupertek12.124.0007Para preparação de suspensão de cultura (temperatura ambiente)
Micropipetas (1000 μ L)GilsonF144059MPara manuseio preciso de líquidos (temperatura ambiente)
Micropipetas (200 μ L)GilsonFA10005MPara manuseio preciso de líquidos (temperatura ambiente)
Moxifloxacina (MOX)Sigma-AldrichSML1581-50MGMedicamento anti-TB (4 ° C)
Pipeta multicanal(20– 200 μ L)VWR849070024Para pipetagem simultânea entre poços
OADCBecton Dickinson211886Suplemento para cultura bacteriana (4 ° C)
Enchimentos de pipetasMerckZ333980Para manuseio preciso de líquidos (temperatura ambiente)
Sal de sódio de resazurinaSigma-Aldrich62758-13-8Indicador redox para ensaios REMA (temperatura ambiente)
Pipetas sorológicas, 10 mLCorningCLS4100Foram utilizadas pipetas descartáveis estéreis de poliestireno (temperatura ambiente)
Contas de vidro maciço, diâmetro 6 mmSigma-AldrichZ265950Para preparação de suspensão de cultura (temperatura ambiente)
Ácido sulfúrico 95-ndash; 97%Merck100731Preparação padrão de McFarland (temperatura ambiente)
Seringas para filtroDispo Van100032Para uso com filtros de seringa
Misturador de vórticeREMICM-101 PLUSPara preparação de suspensão de cultura
Saco poli com zíperSigma-AldrichZ162949

Referências

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