Artigo de método

Inoculação intradérmica de Mycobacterium avium na orelha de camundongo

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DOI:

10.3791/67675

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3 de julho de 2025

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1Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of Washington School of Medicine, 3Department of Global Health, University of Washington

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para realizar uma inoculação intradérmica de baixa dose de Mycobacterium avium em uma orelha de camundongo para refletir condições semelhantes à exposição.

Resumo

Em contraste com as exposições naturais a micobactérias não tuberculosas (NTM) ou infecções cuja patologia se baseia em um organismo de replicação lenta, a infecção por aerossol em um modelo de camundongo pode causar uma proliferação elevada do crescimento bacteriano nos pulmões. Infecções crônicas por aerossol e sistêmicas podem ser tratadas com medicamentos antimicobacterianos, que também podem refletir uma exposição anterior, mas esses procedimentos são demorados e menos representativos das exposições naturais. O objetivo deste protocolo é desenvolver um modelo de camundongo menos invasivo de condições semelhantes à exposição a MNT que sejam mais translacionais. Aqui, descrevemos um método para desafiar intradérmicos camundongos pré-clínicos através do tecido da orelha usando Mycobacterium avium (M. avium) para imitar uma exposição e permitir respostas imunes à bactéria sem doença óbvia. Neste artigo, descrevemos o método de injeção intradérmica no ouvido e confirmamos a presença de infecção micobacteriana sustentada e contida, o que oferece mais oportunidades para interrogar as respostas imunes neste modelo in vivo .

Introdução

As micobactérias não tuberculosas (MNT) são uma lista crescente de espécies que incluem um subconjunto de bactérias patogênicas que muitas vezes são difíceis de tratar 1,2. O MNT pode ser encontrado em fontes ambientais, como solo, água e aerossóis de água 3,4,5. Apesar das tendências relatadas sugerindo aumento de infecções por MNT, como um grupo, elas são rotineiramente relatadas em menos de 20 estados nos EUA.6,7. Indivíduos com comorbidades específicas, incluindo pessoas com fibrose cística ou indivíduos em uso de drogas imunossupressoras, apresentam risco aumentado de infecção produtiva por espécies patogênicas de MNT2. Presume-se que indivíduos saudáveis, no entanto, tenham exposições repetidas e contínuas a MNT por meio de fontes ambientais sem levar a infecções robustas ou crônicas. Há algumas evidências de que a exposição a MNT pode "pré-condicionar" a resposta imune geral a antígenos micobacterianos em vacinações8, resultados após exposição a outras micobactérias e testes diagnósticos9, mas até o momento, a modelagem pré-clínica desse tipo de exposição tem sido difícil.

Infecções pulmonares crônicas10 e tratamentos que são aproveitados para estudos de eficácia de vacinas específicas para patógenos não representam exposições ambientais relativamente inócuas e as respostas imunes resultantes, presumivelmente diferentes. Infecções crônicas, por exemplo, podem induzir tecido gravemente danificado e doença disseminada10. Houve um impulso recente para abordar essa lacuna de pesquisa, incluindo um modelo de camundongo que fornece exposição a NTM por meio de água potável, do laboratório Henao-Tamayo11, onde a resposta imune a essa exposição foi posteriormente interrogada. A tuberculose latente (TB) é outro estado de doença da infecção micobacteriana que tem sido difícil de modelar em animais pré-clínicos. O laboratório Kaufmann foi pioneiro em infecções intradérmicas de ouvido com M. tuberculosis em camundongos C57BL/612 e NOS2-/-13 para mimetizar a infecção latente por TB, reativação e caracterizar os mecanismos de granulomas hipóxicos. Nemeth et al. aproveitaram o modelo de orelha intradérmica contida para imitar a exposição prévia a M. tuberculosis, caracterizando respostas imunes distintas, a fim de determinar como isso afetou os resultados do desafio subsequente14. O modelo de orelha intradérmica foi relatado com sucesso usando 104 unidades formadoras de colônias (UFC) de M. tuberculosis cepas H37Rv e Erdman, mas até o momento, não foi testado usando isolados NTM.

O objetivo geral deste método é estabelecer um modelo de desafio auricular NTM reprodutível que limite a doença causada por outras vias de desafio, que pode ser mais estudado no que diz respeito à resposta imune à exposição. A exposição de camundongos C57BL/6 suscetíveis a altas doses de M. avium na água potável resulta em mais condições semelhantes a infecções do que exposições11. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento dessa técnica inclui o sucesso prévio do uso de M. tuberculosis como um organismo de desafio para a derme da orelha com uma dose de desafio relativamente maior 12,13,14. Aqui, nosso objetivo foi avaliar se o modelo pode ser adaptado com sucesso para um isolado de M. avium na metade da concentração bacteriana relatada anteriormente 12,13,14 (102 UFC). Esperamos que o avanço de novos modelos de exposição a MNT, e não à infecção, ajude a abordar questões biológicas pendentes sobre essa influência na saúde e na dinâmica futura de infecção / vacinação.

Protocolo

As fêmeas C57BL / 6 foram compradas de um laboratório de suprimentos de modelos de pesquisa com 6-7 semanas de idade. Os camundongos foram alojados na instalação de animais de nível 2 de biossegurança (BSL-2) do Seattle Children's Research Institute (SCRI) em condições livres de patógenos e foram manuseados de acordo com protocolos experimentais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do SCRI (IACUC). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes com relação ao bem-estar animal. O instituto opera sob o Certificado #91-R-0061 do USDA e o PHS Assurance #A4337-01. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de estoques bacterianos para inoculação

  1. Em um gabinete de biossegurança propício para o trabalho bacteriano, remova um frasco de estoque de Mycobacterium avium (ATCC 25291) do armazenamento a -80 ° C e descongele à temperatura ambiente.
    NOTA: As concentrações de estoque de M. avium são determinadas antecipadamente, como prática recomendada com todos os materiais de estoque, por meio de diluições seriadas em placas de ágar 7H10 e contagem de unidades formadoras de colônias (UFC).
  2. Usando uma agulha de ponta romba de tamanho 26 G, ressuspenda a amostra de estoque passando o líquido para cima e para baixo na seringa de 1,0 mL 10 vezes ou mais para criar uma suspensão uniforme.
  3. Verificar a concentração de M. avium por plaqueamento de 100 μL de diluições seriais 1:10 da suspensão em placas de ágar 7H10. Incubar as placas durante 3 semanas a 37 °C e contar as colónias para garantir que as concentrações de inóculo são precisas.
  4. Ajustar a concentração de M. avium à dose preferida, diluindo a amostra com PBS estéril. Mantenha em temperatura ambiente até a hora de usar.
    NOTA: Neste experimento, foram utilizadas 102 UFC por dose de 10 μL.

2. Preparação e anestesia dos animais

  1. Antes de administrar anestesia, prepare uma superfície quente, como uma almofada de aquecimento, na qual as gaiolas de camundongos inoculados possam ser mantidas em um esforço para regular a temperatura corporal durante a recuperação.
  2. Injete o coquetel de cetamina (100 mg / mL) e xilazina (20 mg / mL) em camundongos por via intraperitoneal.
  3. Uma vez anestesiado, faça uma pinça no dedo do pé para confirmar que os camundongos estão suficientemente anestesiados para manipulações de procedimentos.
  4. Aplique lubrificante para os olhos bilateralmente.

3. Plataforma de inoculação e preparação de materiais

  1. Use uma placa de espuma para criar uma saliência sobre a qual o mouse possa se estabilizar enquanto está sendo manipulado.
    NOTA: A fita dupla-face ajudará a segurar a orelha na plataforma em uma orientação plana. O adesivo não deve ser muito forte para preservar a saúde do tecido auditivo.
  2. Organize uma lupa iluminada para ver a plataforma.
  3. Reúna uma seringa Hamilton estéril e uma preparação de M. avium nas proximidades.

4. Inoculação da derme da orelha

  1. Coloque o mouse em decúbito dorsal no topo da borda de forma que a orelha possa ser posicionada em fita dupla-face.
  2. Use uma leve pressão para achatar a orelha na fita e garantir que a orelha não se mova.
    NOTA: Lenços umedecidos com álcool podem ser usados nos ouvidos antes da injeção para ajudar a limitar a contaminação cruzada e a infecção com a pele comensal após a infecção. No entanto, tais infecções não foram observadas em estudos piloto sem o uso de lenços umedecidos com álcool.
  3. Retirar 10 μL de preparação de M. avium contendo 100 UFC na seringa estéril de Hamilton.
    NOTA: Agite a suspensão de M. avium antes de extrair o volume de 10 μL para garantir que seja homogêneo.
  4. Segure a plataforma em uma mão e a seringa Hamilton na outra, certificando-se de que o lado chanfrado da agulha esteja apontado para cima (Figura 1).
  5. Posicione a seringa Hamilton sob a derme da orelha usando uma pressão muito leve. Certifique-se de que a agulha não atravesse completamente o tecido fino da orelha.
  6. Assim que a agulha estiver no lugar, pressione o êmbolo da seringa em um ritmo gradual e lento.
  7. Observe a cor da orelha durante a administração.
    NOTA: A administração bem-sucedida aparecerá como uma elevação opaca no local da injeção, como uma bolha.
  8. Assim que a dosagem estiver totalmente administrada, verifique se há sinais de vazamento na orelha e na fita adesiva do mouse.
    NOTA: Se ocorrer vazamento, uma dose perdida estimada pode ser administrada no ouvido oposto. No mínimo, o animal deve ser marcado e registado como possivelmente tendo recebido uma dose abaixo da meta.
  9. Quando a dosagem for bem-sucedida, certifique-se de que o camundongo seja colocado de volta em sua gaiola doméstica para ser exposto à superfície quente enquanto é monitorado até que tenha acordado com sucesso da anestesia.

5. Avaliação da carga bacteriana

  1. Eutanasiar animais de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
    1. Aqui, a eutanásia é concluída com um mínimo de dois métodos por sacrifício. Para este procedimento, os dois métodos escolhidos são o uso de asfixia por CO2 e luxação cervical.
    2. Primeiro, estenda um tubo para dispensar o gás CO2 na gaiola doméstica dos camundongos e administre o gás até que não haja mais sinais de movimento dos camundongos. Tenha cuidado para usar uma gaiola que não permita que o gás vaze.
    3. Em seguida, desloque as vértebras cervicais por meio de manipulação manual.
  2. Dissecar as orelhas de animais desafiados com M. avium quatro semanas após a exposição (28 dias, correspondendo a estudos anteriores12). Disseque as orelhas de 2 camundongos usando ferramentas estéreis. Insira as orelhas em tubos cônicos contendo tampão UFC (PBS + 0,05% Tween80) e use um homogeneizador de tecidos para homogeneizar até formar uma suspensão uniforme. Orelhas incontestadas também são processadas e servidas como controles.
    NOTA: Quaisquer pontos de tempo pós-exposição e órgãos de interesse podem ser usados. Para este experimento, o pulmão, o baço, o linfonodo drenante e os órgãos cerebrais também foram coletados.
  3. Adicione 100 μL de homogenato a 700 μL de tampão UFC em um bloco de poço profundo como uma diluição de 1/8 de vezes. Repita em todo o bloco para que um mínimo de 5 diluições seriais sejam geradas. Adicione 50-100 μL de homogeneizado puro ou diluições seriais (diluições de 0 a 5 usadas aqui) a três placas de ágar 7H10, espalhe uniformemente usando espalhadores T e incube a 37 ° C com 5% de CO2 por 2-3 semanas.
  4. Conte as unidades formadoras de colônias (UFC) e transforme-as em log10 para fins de análise em software de planilha.

Resultados

Usamos o protocolo detalhado acima para determinar se um modelo de desafio NTM reprodutível usando a derme da orelha como via de infecção ou exposição poderia ser estabelecido. As orelhas foram coletadas de dois animais no ponto de tempo 28 dias pós-desafio, homogeneizadas e plaqueadas conforme descrito no meio 7H10 seletivo para micobactérias. Observamos que o M. avium persistiu por 28 dias nas orelhas que foram desafiadas por via intradérmica e ausência de M. avium na orelha não desafiada (Figura 2).

Embora não tenhamos observado disseminação para a orelha não desafiada até 28 dias após a infecção, outros que usaram esse modelo de derme da orelha para modelagem latente de TB observaram disseminação para outros locais de órgãos distais14. Nossa hipótese é que uma dose mais baixa de desafio e o uso de isolado de M. avium podem reduzir a disseminação para pontos de tempo posteriores que podem refletir melhor a exposição versus infecção crônica. Portanto, a eutanásia foi realizada em coortes de camundongos desafiados com n = 5 M. avium 28, 56, 90 e 132 dias após a infecção. Os seguintes órgãos foram homogeneizados com o mesmo protocolo descrito para os tecidos auditivos: pulmão, baço, linfonodo drenante (DLN) e cérebro. Essa via de desafio resultou em uma disseminação esporádica ao longo do tempo, onde menos da metade dos animais demonstrou UFC contável em órgãos testados até 56 ou 90 dias após a infecção (Tabela 1). Aos 132 dias após o desafio, todos os camundongos tinham M. avium detectável em seus baços (n = 5/5 animais avaliados), mas pareciam abrigar bactérias mínimas (n = 1/5 em DLN) ou nenhuma (n = 0/5 em pulmões ou cérebro) em outros órgãos neste momento (Tabela 1).

figure-results-1
Figura 1: Orientação de uma agulha com o lado chanfrado para cima. Antes da inserção da agulha, o lado chanfrado deve estar voltado para cima para administrar adequadamente o inóculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Colonização do tecido da orelha por M. avium 28 dias após o desafio. Camundongos C57BL/6 fêmeas foram desafiados na orelha com 102 UFC de Mycobacterium avium. A orelha desafiada (+) foi comparada com a orelha não desafiada (-) aos 28 dias, n = 2 animais individuais de um único experimento mostrado, com cada animal em uma cor e símbolo diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Hora (dia)Log de Órgãos10 UFC
PulmãoBaçoDLNCérebro
283,08, ND, ND, ND, ND2,81, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,78, 0,90, ND, ND, ND
562.30, ND, ND, ND, ND1,53, 3,43, ND, ND, ND2,78, ND, ND, ND, ND1,20, ND, ND, ND, ND
90ND, ND, ND, ND, ND0,60, 3,35, 3,26, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0,60, ND, ND, ND, ND
132ND, ND, ND, ND, ND4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.692.41, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND
DLN = linfonodo drenante, ND = não detectado

Tabela 1: Disseminação de M. avium da orelha ao longo do tempo após o desafio. Pulmões, baço, linfonodo de drenagem (DLN) e cérebro foram colhidos de n = 5 camundongos por ponto de tempo após o desafio. Os tecidos homogeneizados foram plaqueados e avaliados quanto ao crescimento bacteriano. A UFC do órgão apresentou como log10 valores transformados onde as bactérias foram contadas e não detectadas (ND) onde nenhuma UFC foi observada em qualquer concentração plaqueada. Dados de curso de tempo representativos de um experimento.

Discussão

Aqui, demonstramos como desafiar camundongos com micobactérias de forma reprodutível em um modelo de orelha intradérmica contida. É vital, ao realizar este procedimento, seguir as precauções de esterilidade e evitar ferimentos por picada de agulha. Com este método de inoculação, é fundamental ter uma estação de configuração adequada e boa iluminação para garantir que o espaço da derme seja direcionado e não perfurado totalmente na orelha. Caso isso aconteça, dependendo do estudo, uma segunda tentativa pode ser feita na outra orelha. Orelhas não tratadas dentro do mesmo mouse também podem ser usadas como controle por mouse. Este método deve ser acessível a pesquisadores com necessidades mínimas de equipamento ou tempo. Dedicar camundongos e tempo para treinamento ajuda na taxa de sucesso da inoculação do protocolo. Os erros mais comuns nessa técnica são não entrar no espaço intradérmico com a seringa (e perfurar a orelha) ou pressionar a seringa muito rapidamente, causando uma entrega inconsistente ou deslizamento da agulha do espaço intradérmico. Uma boa iluminação e ampliação podem ajudar no posicionamento adequado da agulha para inoculação.

Estamos aproveitando a metodologia para condições de 'exposição' do NTM. A grande maioria do M. avium está contida no ouvido ou no DLN. No entanto, uma limitação dessa metodologia é que foi observada disseminação para órgãos sistêmicos, ou seja, o baço, em todos os animais avaliados até 132 dias pós-desafio. Pode haver um limiar de inoculação bacteriana que pode reduzir a quantidade ou frequência de disseminação, o que pode ser realizado com um estudo de titulação. Este procedimento é passível de modificar tanto o organismo, por exemplo, outras espécies de MNT, quanto a dose administrada, dependendo da questão de pesquisa.

O comportamento humano (falta de tratamento adequado de água potável, poluição, tabagismo), aumento do número de pessoas com deterioração da saúde devido aos15 anos e outras comorbidades, falta de testes diagnósticos apropriados e mudanças climáticas16 podem desempenhar um papel no aumento das taxas de infecções por MNT, e essa tendência provavelmente aumentará em um futuro próximo. Propomos que modelos como a entrega da mucosa por meio da água potável11 ou infecções de ouvido intradérmicas com MNT em camundongos fornecem uma oportunidade para determinar a influência que essa exposição crescente terá na vacinação subsequente e na eficácia da vacina. Embora tenhamos adaptado esta metodologia de um modelo de orelha contida para M. avium, propomos que ela possa ser usada com sucesso para outras espécies de MNT como uma técnica de exposição.

Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores expressam sua gratidão ao pessoal comprometido do biotério por seu cuidado excepcional com os animais ao longo deste estudo. Os autores também gostariam de agradecer ao Laboratório Henao-Tamayo da Universidade Estadual do Colorado por compartilhar a cepa de M. avium usada neste estudo. Os autores gostariam de agradecer aos membros dos laboratórios Aderem e Urdahl do Seattle Children's Research Institute pelo treinamento na metodologia original. Este projeto foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Institutos Nacionais de Saúde, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, sob o Contrato nº 75N93021C00029 (para RNC) e Subsídios R01AI125160 e R01AI183642 (para RNC e SLB).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tween80SigmaP6224
Seringa de 1mLFisher15-823-434
7H10 triplacas de ágarMoltox21-40S234
26G agulha rombaFisherNC0981254
Armário de biossegurançaNuaireNU-543-400
CO2 incubadoraFisher Scientific15-103-0513
Fita dupla faceScotch3136
Seringa de microlitro Hamilton 701NFisher14-824-16
Pontas omni de tecido duroFisher15-340-102
Almofada de aquecimentoKent ScientificHTP-1500
Agulha de insulinaFisherNC1551333
CetaminaPatterson Veterinary07-890-8598
Lupa iluminadaBrightechB07MMZ27QK
PBSThermoFisher10010072
Homogeneizador de tecidosOmniTH115
Suporte homogeneizador de tecidosOmniS1000
XylazinePatterson Veterinary07-808-1947

Referências

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