Metodologia aprimorada para administração de líquido ao pulmão de camundongo: intubação usando um otoscópio de consumidor

Resumo

Este protocolo apresenta como o posicionamento ideal de um mouse e a inserção de um otoscópio baseado em câmera por via transoral permitem a visualização da glote, intubação rápida com trauma tecidual mínimo e entrega consistente de líquido aos pulmões.

Resumo

A entrega consistente de líquidos, incluindo terapias potenciais, aos pulmões é fundamental para modelar a doença pulmonar e o desenvolvimento terapêutico pré-clínico. No entanto, os métodos atuais usados em camundongos - como a aspiração orofaríngea pelo método de puxar a língua - podem resultar em entrega variável. Aqui, descrevemos o uso de um otoscópio iluminado, acessível e conectado a um telefone celular para visualizar a glote e permitir a inoculação direta nas vias aéreas. Detalhamos uma técnica de encenação otimizada com iluminação adequada e auxiliares de posicionamento. Como a intubação pode ser conduzida de forma confiável usando um cateter flexível de 20 G com ou sem luz de fibra óptica também é descrito. Essa técnica reduz muito a variação na entrega intrapulmonar e aumenta o volume de líquido liberado que chega aos pulmões. Devido à variância reduzida, tamanhos menores de coorte de animais podem ser usados ao empregar esse método em vez da instilação orofaríngea pelo método de puxar a língua. O que se segue é um método para intubação eficaz, rápida e consistente de camundongos e entrega aos pulmões, incluindo confirmação robusta da colocação do tubo endotraqueal. Com essa metodologia aprimorada, a intubação consistente e segura e a entrega replicável e eficiente aos pulmões estão ao seu alcance.

Introdução

Globalmente, as doenças respiratórias são a principal causa de morte de crianças menores de 5 anos e são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em adultos¹. Em 2021, a infecção por SARS-CoV2 foi a terceira principal causa de morte nos EUA². Os modelos murinos são frequentemente usados para estudar doenças pulmonares, incluindo asma, pneumonia, doença pulmonar crônica intrusiva e fibrose pulmonar. Quase todos esses modelos requerem a entrega de agentes líquidos aos pulmões. Isso pode ser feito por canulação direta da traqueia (normalmente sob visualização direta usando uma técnica cirúrgica de corte), administração intranasal ou aspiração orofaríngea pelo método bem estabelecido de puxar a língua ^3,4,5. No entanto, todas essas técnicas têm desvantagens. A formação de tecido cicatricial após a técnica cirúrgica de corte torna-a inadequada para estudos que requerem administração repetida de agentes no pulmão, e as duas últimas técnicas podem levar a uma entrega pulmonar variável. Além disso, ao usar o método de puxar a língua, o trauma tecidual na língua pode ser pronunciado e a eficiência da entrega depende do pesquisador que realiza o procedimento, veja a Figura 1.

Figura 1: A intubação guiada e a instilação de TI resultam em melhor entrega ao pulmão e menor variabilidade quando comparadas à tração da língua. (A) Três investigadores diferentes administraram 50 μL de tinta nanquim diluída por tração da língua, o método estabelecido para administração orofaríngea (OP). Dois pesquisadores também entregaram tinta ao pulmão usando intubação, conforme descrito. (B) Os pulmões foram removidos 1-4 h após o parto e fotografados com aumento de 2x. As fotografias foram avaliadas quanto à área corada, usando o ImageJ. (n=6 (intubação) ou 9 (administração de PO), resultados de 2 ou 3 repetições independentes por 2 -3 pesquisadores diferentes, p<0,0001 Teste T de Welch) (C) A variabilidade na administração pulmonar também foi calculada como um desvio percentual da média. A administração do OP era muito mais variável. (p = 0,0317, Teste T de Welsh, GraphPad Prism 10.2.3 todas as estatísticas e gráficos) (Camundongos machos e fêmeas C57BL / 6J foram usados, eles tinham ~ 10 semanas de idade.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A anatomia murina torna a intubação difícil e demorada. A boca é pequena e o tecido bucal pode obstruir a visão do pesquisador sobre a rima glottidis⁶. Além disso, as pregas vocais são muito pequenas e pode ser um desafio visualizá-las, pois estão próximas à base da língua. Finalmente, a confirmação do posicionamento adequado do tubo endotraqueal é difícil, pois o pequeno volume corrente muitas vezes não embaça um espelho⁷. Essas dificuldades incentivaram uma série de técnicas inovadoras para intubar camundongos. Esses métodos aprimorados incluem o uso de um laringoscópio neonatal e fio para avançar um cateter na traqueia ^8,9, o uso de uma fonte de luz de fibra óptica para guiar e endurecer o cateter^10,11 e o uso de uma transmissão de vídeo ao vivo⁶. Mais recentemente, o uso de um otoscópio clínico tem auxiliado na intubação orotraqueal¹². Outros empregaram transiluminação para visualizar a glote e intubar camundongos ^7,13,14. No entanto, existem muitas desvantagens nesses métodos. O uso de agentes depilatórios no pescoço do camundongo e a proximidade do animal a uma fonte de luz quente tornam a transiluminação uma abordagem menos do que ideal. O uso da agulha dentro do cateter ou a inserção de instrumentos pontiagudos na boca significa que alguns métodos para endurecer o cateter colocam os animais em risco indevido. Finalmente, fazer uma incisão sobre a traqueia para confirmar a colocação apresenta desvantagens significativas, incluindo a necessidade de esterilidade e o acúmulo de tecido cicatricial. Até este ponto, a instilação intratraqueal por intubação provou ser muito difícil para adoção generalizada¹⁵ e os avanços no desenvolvimento metodológico permaneceram isolados e não utilizados por muitos laboratórios¹⁵. Outros estudos têm se concentrado na escolha anestésica durante o parto, descobrindo que a cetamina pode ter vantagens sobre o isoflurano⁵. No entanto, o isoflurano, por não ser uma substância controlada e desaparecer rapidamente após o término do procedimento, apresentou benefícios atraentes, por isso usamos essa forma de anestesia otimizando outros aspectos dessa metodologia^16,17.

O método que descrevemos supera os desafios de visualização que outros tentaram enfrentar, mitiga os riscos para os animais experimentais, diminui o tempo necessário para instilar pequenos volumes intratraquealmente por meio de um tubo endotraqueal, aumenta o volume de líquido que chega ao pulmão e oferece um método aprimorado para a confirmação da colocação do tubo endotraqueal. O uso de um suporte de suspensão, mãos amigas magnéticas (garras jacaré em braços flexíveis presos a uma base) e iluminação mais brilhante permitem que um pesquisador individual realize uma entrega intratraqueal eficiente. A visualização é facilitada usando um otoscópio 'em casa' com conectividade WIFI. Este dispositivo é mais acessível do que os instrumentos de intubação comerciais. Além disso, a conectividade WIFI permite uma transmissão de vídeo simultânea em um dispositivo portátil (como um telefone celular), tornando-o adequado para treinamento. A intubação pode utilizar uma fonte de luz de fibra óptica enfiada em um cateter flexível (PTFE) de 20 g x 1" (agulha removida) ou o cateter sem luz. A profundidade é controlada por dois métodos - a adição de uma cunha de segurança de intubação (uma proteção cônica no cateter) e a observação da profundidade na transmissão de vídeo. A colocação do tubo endotraqueal é confirmada usando o "método da bolha" para visualizar o volume corrente com mais clareza do que o método tradicional de névoa espelhada¹⁸. Isso é menos estressante para o animal do que confiar na obstrução traqueal para modificar a urgência respiratória¹⁰ para confirmar a colocação. O uso combinado de tubo de extensão acoplado ao cateter para confirmar o sucesso da intubação (doravante denominado método da bolha), simplificado a partir de Watanabe et. al⁷, e um videootoscópio de consumo em um único procedimento torna a intubação um método prático para entrega terapêutica ao pulmão e uma clara melhora no método de puxar a língua (ver Figura 1). Se estiver procurando um método confiável, consistente e acessível para administração não cirúrgica de líquido nos pulmões de camundongos, especialmente sem o uso de substâncias controladas (como cetamina) ou equipamentos caros, o método a seguir pode ser o ideal.

Protocolo

É imperativo que esses procedimentos sejam revisados e aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC), listado no protocolo, e a equipe veterinária seja consultada antes de prosseguir. O IACUC em nossa instituição aprovou o protocolo antes de iniciar o experimento e revisou o conteúdo do vídeo antes do envio. Apoio e treinamento foram recebidos por meio do Departamento de Medicina Comparada de Tulane para garantir o mais alto padrão de atendimento a todos os nossos animais de laboratório.

1. Configuração

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter a configuração.

Figura 2: A estação usada para intubação guiada é preparada conforme mostrado. Da esquerda: pipetas para entrega, tubo de bolha para confirmação da colocação adequada do tubo endotraqueal, fórceps, espátula, espéculo nasal pediátrico (discutido, mas não necessário para este procedimento), mãos amigas, luz de aumento, suporte de mouse com cone nasal, sonda de fibra óptica, câmara de indução de anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Limpe a cunha de segurança fornecida com o kit de intubação com uma almofada de preparação de isopropanol. Deslize a cunha de segurança limpa (verde no vídeo) na cânula flexível de 20 G e descarte a agulha fornecida com segurança.
   NOTA: O kit de intubação de roedores (Tabela de Materiais) usado inclui cunhas de segurança para intubação. Estas são mangas pequenas e cônicas que se encaixam em um cateter flexível de 20 G x 1 polegada. Eles evitam que o cateter danifique a carina.
2. Reúna as outras ferramentas necessárias, incluindo um telefone celular, otoscópio comercial, suporte de mouse com cone de nariz, pinça dobrada finamente serrilhada, o tubo endotraqueal preparado (de 1.1) e a luz de fibra óptica, se estiver usando. Limpe tudo isso com almofadas de preparação de isopropanol antes de usar.
3. Pegue aproximadamente 20 cm de tubo flexível. Dobre-o em forma de U, adicione uma conexão de trava Luer em uma extremidade e prenda-o com um laço de torção. Adicione 200-300 μL de água filtrada estéril ou tinta nanquim ao tubo. Doravante, este conjunto é referido como um "tubo de bolha".
4. Faça um laço de sutura amarrando ~ 13 cm de sutura de seda trançada tamanho 0 em um círculo. Coloque este laço na parte superior do suporte e certifique-se de que ambos os lados da sutura estejam presos e que o suporte esteja limpo. Coloque o suporte do mouse em cima da base da luz de aumento de metal. Posicione as mãos amigas ao redor de onde estará a boca do mouse.
   NOTA: Muitos fornecedores fazem suportes intercambiáveis (consulte a Tabela de Materiais), e um pode ser feito dentro do laboratório de forma barata ^4,7,14. Sutura de seda trançada tamanho 0 foi utilizada para suspender o animal. No entanto, o uso de outros materiais para o mesmo fim tem sido descrito ^4,13.
5. Coloque um mouse na câmara de indução de anestesia. Use vazão constante de Ø₂ a 0,8 L/min e isoflurano a 2%. Anestesiar o animal o suficiente (ver nota) para que não desperte durante a colocação do cone do nariz. Não suprima significativamente a frequência respiratória do camundongo. Respirações regulares auxiliam na apreciação das pregas vocais.
   NOTA: A frequência respiratória do camundongo deve ser normal. Este critério é usado para estabelecer a profundidade apropriada da anestesia. Isso pode variar entre os animais e pode exceder 200 respirações / min. Como tal, não é prático ou necessário contar as respirações ou usar uma pinça no dedo do pé.
   CUIDADO: Este procedimento pode ser abortado quando necessário. No entanto, os animais não devem permanecer na câmara de indução mais tempo do que o estritamente necessário.
6. Conecte o otoscópio a um telefone celular e certifique-se de que a transmissão de vídeo esteja estável.
   CUIDADO: Para minimizar a exposição dos pesquisadores ao isoflurano durante este procedimento, use um respirador químico se estiver realizando várias intubações ou treinamento neste método. Em alternativa, execute o procedimento numa hotte.

2. Encenação animal

1. Assim que o primeiro animal estiver dormindo, remova-o da câmara de indução, esfregue-o e coloque os dentes superiores no comprimento da sutura. Aplique uma leve tensão no animal para manter o posicionamento da sutura enquanto coloca o mouse de volta no suporte.
   NOTA: Em média, os animais são anestesiados por um total de 2 min, incluindo indução. Isso diminui muito o risco para o animal, elimina a necessidade de lubrificação oftálmica e evita o acúmulo de saliva. Trabalhe para manter os animais sedados pelo menor tempo possível.
2. Ajuste o ângulo do pescoço ligeiramente para trás (colocando o pescoço em extensão menor, 5°-15°). Empurre suavemente o cone do nariz sobre as narinas. Não empurre o cone para baixo com firmeza, pois pode interferir na sutura, suspendendo o mouse.
3. Segure firmemente a língua o mais próximo possível do lábio inferior, usando uma pinça dobrada grande e finamente serrilhada. Puxe-o para baixo e para longe dos dentes superiores para um lado dos dentes inferiores.
   CUIDADO: Tração prolongada, tensão excessiva ou esmagamento da língua podem comprometer a saúde animal. Monitore a língua em busca de sinais de trauma (hematomas, sangramento, inchaço ou dessecação) e, se observado, aborte o procedimento e alerte a equipe veterinária.
4. Se estiver usando mãos amigas, apoie a pinça nesta posição. Dependendo da experiência e acuidade visual do pesquisador, uma lupa iluminada pode ajudar a posicionar o animal adequadamente.
5. Alimente a luz de fibra óptica (se estiver usando) através do cateter flexível com a cunha de segurança de intubação (verde no vídeo) no lugar.
   NOTA: Não prenda o cabo de fibra óptica à fonte de luz com muita força. Empurrar com muita força dificulta a remoção da luz, deixando o tubo endotraqueal no lugar.

3. Apreciação visual das cordas vocais e intubação

1. Com o otoscópio na mão não dominante, pressione-o levemente na língua. Em seguida, incline a câmera e sua fonte de luz para visualizar as cordas vocais perto da base da língua.
   NOTA: Pequenas variações na anatomia e na cor do tecido podem dificultar a orientação. Use o movimento associado à respiração para confirmar a identificação estrutural.
2. Com a luz de fibra óptica acesa (se estiver usando), passe a cânula ao longo da parte superior do otoscópio, fazendo um leve contato com a base da língua ou a parte labial do otoscópio para referência. Avance-o para a boca do mouse entre o palete macio e a borda do otoscópio.
   NOTA: Se a luz de fibra óptica não estiver sendo usada, o "tubo de bolha" descrito na etapa 4 pode ser conectado ao cateter neste stage. Uma iluminação brilhante e focada na boca do mouse é necessária para essa modificação no procedimento.
3. Ajuste o ângulo de abordagem para que o cateter fique bem raso. Imediatamente após a inserção do cateter (menos de 1 mm além das pregas vocais), levante a ponta do cateter, de modo que fique quase paralela à bancada. Isso evita que a epiglote force o cateter dorsalmente para dentro do esôfago. Especialmente durante o treinamento, quando há dificuldade, ou no início da experiência, o uso da transmissão de vídeo é inestimável para colocar o tubo endotraqueal entre as pregas vocais.
   NOTA: A produção de saliva não obstrui a visualização das pregas vocais durante a conclusão deste procedimento. No entanto, o uso de um aplicador de algodão com ponta de lança para remover a saliva obstrutiva é descrito, em publicações anteriores, na intubação de ratos¹⁹. Este método pode ser útil se a saliva se tornar um problema.
   1. Se houver resistência, remova imediatamente o cateter e permita que as respirações voltem ao normal. Se for observada sangramento, consulte a equipe veterinária.
      NOTA: Quase não deve haver resistência ao avançar o cateter.

4. Confirmação da colocação do tubo endotraqueal

1. Confirme visualmente se o tubo endotraqueal está no local correto usando o otoscópio. Além disso, garanta a colocação correta do tubo, considerando que a traqueia oferece menos resistência durante a colocação do que o esôfago. Observe que, na posição adequada, o tubo endotraqueal está ~5 mm além das pregas vocais. Procure a luz da fonte de fibra óptica brilhando através da pele do pescoço para validar novamente se o posicionamento está correto.
   NOTA: A cunha de segurança de intubação deve evitar a inserção do tubo endotraqueal muito longe. A cunha de segurança evita traumas na carina; no entanto, não precisa estar impedindo o avanço. Deve ser usado como um recurso de segurança e a profundidade ideal geralmente é menor do que a permitida pela cunha.
2. Em seguida, enquanto segura o tubo endotraqueal no lugar, remova a luz da fibra óptica. Garanta a colocação adequada do cateter usando o "método da bolha" (detalhado abaixo) em vez de embaçamento com espelho.
3. Recupere o tubo de bolha preparado na Etapa 1.3. Prepare-o antes do procedimento e reutilize-o para todos os animais.
   CUIDADO: Os 200-300 μL de água ou tinta no tubo de bolha nunca devem ser aspirados. Para evitar isso, certifique-se de que o líquido esteja longe da trava Luer.
4. Com o tubo endotraqueal no lugar, prenda o tubo de bolha no lugar usando a trava Luer. O volume corrente deve ser imediatamente aparente. Caso contrário, o tubo endotraqueal está mal colocado. Remova-o rapidamente e permita que a frequência respiratória normal do camundongo retorne.
   CUIDADO: O posicionamento incorreto do cateter no esôfago comprimirá a traqueia, impedindo a respiração suficiente. O mau posicionamento geralmente será acompanhado por respiração difícil (incluindo contribuição apreciável dos músculos intercostais) e / ou uma frequência respiratória drasticamente diminuída. Além disso, a canulação do esôfago pode levar a um espasmo muscular, dificultando a intubação subsequente; Aconselhamos o uso de vários animais durante o treinamento por esse motivo.

5. Parto intratraqueal

CUIDADO: Muito parecido com o método de puxar a língua para parto orofaríngeo, o parto por intubação corre o risco de afogar o animal. Em camundongos adolescentes e adultos, 50 μL é um volume geralmente seguro de fluido para fornecer e é suficiente para se espalhar pelos pulmões.

1. Se estiver usando uma seringa para administração: Retire o tubo de bolha e a trava Luer do cateter, coloque uma seringa Luer slip carregada e pressione o êmbolo para fornecer o volume desejado (máximo de 50 μL).
2. Se estiver usando uma pipeta para administração: Pipete o volume desejado (máximo de 50 μL) diretamente no cateter e deixe o camundongo inalar a solução.
   NOTA: Se estiver treinando, considere usar um indicador como tinta nanquim diluída e filtrada ou azul de metileno.
3. Para garantir a entrega difusa aos pulmões, lave o líquido fornecido nos pulmões com até 500 μL de ar²⁰. Isso pode ser feito usando uma seringa Luer lock pré-carregada de 0,5 mL ou um pipetador P1000 equipado com uma ponta de filtro, ambas comprovadamente confiáveis. Se desejado, várias depressões do pipetador podem ser conduzidas sem risco de aspiração negativa do líquido fornecido.
   CUIDADO: Se inocular o animal usando este método, considere diminuir a concentração de inóculo devido ao aumento da eficiência de entrega em relação à aspiração orofaríngea ou administração intranasal.
   NOTA: O uso de mais do que o volume corrente (~ 200 μL) pode ser necessário ao lavar o inóculo com ar. No entanto, o uso de 500 μL não corre o risco de barotrauma, pois é apenas cerca de metade da capacidade vital²¹. Camundongos adultos têm uma capacidade de reserva inspiratória de cerca de ~ 800 μL, portanto, mesmo que o camundongo tenha inspirado imediatamente antes da lavagem, o barotrauma não ocorre²¹. Considere se volumes de lavagem de ar mais baixos podem atender às suas necessidades de distribuição do inóculo (100-200 μL foram sugeridos).

6. Avaliação da entrega

NOTA: Isso é feito apenas se alguém estiver treinando ou praticando o procedimento.

1. Eutanasiar o animal humanamente de acordo com o protocolo IACUC aprovado. A asfixia por CO₂ como método primário de eutanásia e a luxação cervical como método confirmatório de eutanásia foram empregadas aqui.
2. Abra a parede torácica e remova os pulmões. Faça isso abrindo o peritônio, acessando o diafragma pelo lado caudal e puncionando-o com uma pequena tesoura onde o coração possa ser visto. Isso fará com que os pulmões se retraiam e dê mais espaço para abrir a cavidade torácica cortando as costelas.
   NOTA: Se for necessária perfusão para reduzir o sangue nos pulmões, execute o procedimento através do ventrículo direito do coração nesta fase.
3. Enxágue os pulmões brevemente com 1 mL de PBS estéril após a remoção. Coloque-os sobre uma superfície branca (como uma esponja cirúrgica) para expor a área máxima, mantendo o posicionamento relativo do lóbulo.
4. Fotografe os pulmões ex vivo (usamos um telefone celular), abra as imagens no ImageJ e quantifique as áreas manchadas e não coradas traçando o contorno da frente do corante. Quantifique a área corada usando um pesquisador cego independente para evitar viés.
   NOTA: Se estiver usando luminescência e o IVIS, conforme mostrado na Figura 3, imagens ao vivo in vivo devem ser realizadas no lugar da Etapa 6.

Resultados

Como visto na Figura 1 e na Figura 3, a inoculação intrapulmonar usando o método tradicional de tração da língua (administração orofaríngea) resultou em distribuição irregular e inconsistente da tinta e maior variabilidade entre os pesquisadores. Em contraste, a instilação de IT após a intubação levou a uma entrega mais consistente nos pulmões direito e esquerdo e foi menos variável (Figuras 1C e Figura 3D). Nos pulmões de animais que receberam tinta por aspiração orofaríngea usando puxão de língua, a tinta é sutil e presente apenas perto das grandes vias aéreas dos animais (Figura 1A). Em contraste, quando a intubação guiada foi usada para fornecer tinta, ela se espalhou muito mais para o tecido, marcando uma área muito maior dos pulmões. Quando a área de superfície pulmonar corada por tinta foi comparada entre os métodos, o método de intubação mostrou-se muito superior ao puxão da língua (Figura 1B). A variabilidade na quantidade de tinta também foi drasticamente menor na condição de intubação (Figura 1C). O aumento da área pulmonar corada e a menor variabilidade na quantidade de líquido que chega aos pulmões sugerem fortemente que a entrega de TI é superior à tração da língua.

Como visto no Vídeo 1, os endoscópios tradicionais (como publicado anteriormente) têm uma distância focal muito longa, para apreciar as pregas vocais e guiar a colocação do tubo endotraqueal ^6,19. Em contraste, as imagens de vídeo tiradas usando um otoscópio de consumidor (Figura S1 e carimbos de data/hora: 6:34 e 7:05 no vídeo) tiveram uma resolução muito melhor, levando a uma melhor visualização da glote.

Este método de intubação inclui várias verificações da colocação do tubo na traqueia. O volume corrente do camundongo foi prontamente aparente ao usar o método da bolha (Figura S2 e carimbo de data/hora: 8:25) e atua como uma garantia final de que qualquer fluido fornecido entrará nos pulmões.

Para avaliar ainda mais a variância dos dois métodos de entrega, avaliamos a expressão do transgene no tecido pulmonar depois que os camundongos foram inoculados com 1 x 10¹¹ vg de AAV6.2-Luciferase usando os dois métodos diferentes (instilação orofaríngea pelo método de puxar a língua ou administração intratraqueal após intubação guiada). Sete dias após a administração do vetor, as medições de luminescência foram feitas usando um sistema de imagem in vivo (IVIS) (Figura 3A). Em seguida, calculamos a radiância média em ambos os pulmões. 10 min antes da imagem (30 s de exposição), eles foram injetados (por via subcutânea) com 200 μL de luciferina (15 mg/mL). Como mostrado na Figura 3B, os animais que receberam o vetor por instilação orofaríngea apresentaram sinal luminescente amplamente distribuído tanto no tórax quanto na região nasal. Em contraste, os animais que receberam o vetor por via intratraqueal usando intubação guiada mostraram luminescência concentrada nos pulmões. A radiância média nos animais intubados foi substancialmente maior em comparação com o parto orofaríngeo, indicando melhor eficiência do parto do vetor aos pulmões e diminuição da variabilidade no parto, calculada usando a diferença da média (Figura 3C e Figura 3D).

Os resultados positivos do método de intubação foram instilação replicável de até 50μL nos pulmões de camundongos (conduzida na Figura 1 e Figura 3), com distribuição difusa por todo o pulmão (como evidenciado na Figura 1) e não em outras áreas (como via aérea superior/nariz como visto na Figura 3).

Qualquer dano causado ao animal, estresse indevido, redução do volume de líquido que chega aos pulmões, má distribuição do inóculo nos pulmões ou necessidade prolongada de treinamento teriam constituído um resultado negativo, mas não ocorreram.

Vídeo 1: Uma visão endoscópica tradicional da orofaringe e das pregas vocais do camundongo está fora de foco e difícil de usar de forma eficaz. A distância focal de 3 cm deste endoscópio significa que as pregas vocais e a orientação são difíceis de apreciar. Língua no canto inferior esquerdo. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura 3: A intubação produz maior entrega ao pulmão com menos variabilidade em relação à aspiração de O.P. (A) camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 10 semanas de idade foram dosados com 1x10¹¹ vg de AAV6.2-Luciferase, (Penn Vector Core), e então avaliados com imagem bioluminescente in vivo (IVIS) 7 dias depois. 10 min antes da imagem (30 s de exposição), eles foram injetados (por via subcutânea) com 200 μL de luciferina (GoldBio, 15mg/mL). (Criado com biorender.com) (B) Imagens representativas do IVIS de camundongos recebendo AAV6.2-Luciferase por aspiração OP (puxão da língua, esquerda) ou entrega de IT (intubação, direita). As regiões de interesse são do mesmo tamanho e a radiância média dentro da região é mostrada na imagem. (C) Quantificação do sinal de luciferase em camundongos aspiração OP (n = 7) versus intubação (n = 5). p<0,0001 pelo teste t de Welsh não pareado com após a transformação logarítmica de dados brutos de luciferase. (D) Desvio da média como uma porcentagem da radiância média média. (p=0,0381, teste T de Welsh) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1: Exemplos de imagens do otoscópio de consumo utilizado no protocolo descrito para intubação guiada (esquerda) e um endoscópio de custo e disponibilidade semelhantes (direita) são mostrados. Observe as claras diferenças de foco entre as imagens. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S2: Um exemplo de imagem mostrando o tubo de bolha em uso. O volume corrente move rapidamente a gota no tubo da bolha vários centímetros. A gota se move muito pouco se o tubo estiver no esôfago. A frequência respiratória e o volume corrente podem ser estimados por este método. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S3: Um conjunto básico de iluminação que elimina a necessidade de comprar um kit de iluminação de fibra óptica caro. Uma agulha de 20 G foi empurrada através de um cabo de fibra óptica cônico de 50 mL de 0,75 mm foi comprado barato (e a granel) e cortado no comprimento (~ 1m) com uma lâmina de barbear e colado no lugar. Prender o cateter no lugar era desnecessário devido ao ajuste confortável no cabo de fibra óptica. Prender a tampa cônica sobre uma lanterna de celular resulta em transdução de luz suficiente para realizar a intubação em uma sala escura. Esta montagem diminui ainda mais os custos assumidos por um laboratório que incorpora esta técnica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A intubação e a instilação intratraqueal são os melhores métodos para a entrega de líquido ao pulmão, mas os abundantes desafios apresentados pela anatomia murina impediram a adoção generalizada em laboratórios de pesquisa pulmonar¹⁵. Embora garanta a entrega eficiente de um inóculo ao pulmão, uma desvantagem potencial da entrega de TI por esta e outras técnicas de intubação é o desvio das vias aéreas superiores. A administração intranasal é um método comprovado que não contorna as vias aéreas superiores. Embora a administração intranasal seja frequentemente usada em laboratórios de virologia pulmonar e possa ser mais eficaz em alguns casos²², ela não reflete a via de exposição natural²³ para alguns agentes aspirados, resulta em quantidades mais variáveis de inóculo no pulmão²⁴ e é menos eficaz quando se usa isoflurano como anestésico⁵. Como tal, um extenso trabalho foi feito em aparelhos de aerossolização e comparando-os com outras técnicas de entrega pulmonar²⁵, mas esses métodos apresentam riscos associados a aerossóis e tendem a ser caros. Todas essas dificuldades levaram à instilação orofaríngea por tração da língua²⁶, sendo o método preferido para a administração de líquido pulmonar em muitos laboratórios. Como mostramos, esse método é muito mais variável do que a instilação intratraqueal após a intubação. Além disso, a entrega pelo método de puxar a língua não pode ser avaliada durante a administração, e traumas indevidos podem ser causados à língua do camundongo devido à tensão necessária para evitar a deglutição. A língua também é mantida na técnica de intubação guiada e instilação de TI. No entanto, como o feed de vídeo mostra glote, um pesquisador que usa nosso método não precisa forçar o posicionamento laríngeo colocando uma tensão significativa na língua. Essa diminuição da tração causa menos trauma tecidual. No entanto, apesar das vantagens consideráveis apresentadas pela intubação e instilação de TI, os desafios impediram seu uso em alguns laboratórios. Por exemplo: a compressão da traqueia devido à canulação errônea do esôfago pode obstruir a respiração e aumentar a mortalidade; a inserção do tubo endotraqueal muito profundamente pode causar danos à carina ou aos brônquios principais; e, finalmente, a intubação murina por métodos tradicionais leva muito tempo, tornando-a impraticável para a maioria dos pesquisadores que buscam uma administração intrapulmonar confiável. Nosso método aborda as dificuldades associadas à intubação de camundongos, superando até mesmo as barreiras anatômicas para intubar camundongos.

Vários métodos têm sido propostos para superar os desafios anatômicos da intubação murina por meio da implementação de recursos visuais. Por exemplo, o uso de um endoscópio tradicional tem sido proposto⁶. No entanto, a longa profundidade focal do instrumento é pouco adequada para ser usada para intubação murina (Figura S1). Isso também é facilmente aparente no vídeo 1, onde as pregas vocais podem ser vistas, mas estão embaçadas. Otoscópios clínicos também têm sido utilizados para laringoscopia direta¹². No entanto, o custo dos otoscópios clínicos e a falta de um feed de vídeo os tornam inacessíveis para a maioria dos laboratórios e inadequados para o treinamento. O uso de um otoscópio de consumo amplamente disponível melhorou muito a praticidade da intubação guiada. A distância focal mais curta, o corpo menor e o lábio depressor estendido permitem uma alimentação de vídeo mais clara, melhor manobrabilidade e posicionamento, e o lábio do otoscópio pode ser usado para aplicar pressão na base da língua, o que melhora o acesso à rima glótica. Além desses recursos visuais, a transiluminação também tem sido usada para visualizar com sucesso a glote e intubar camundongos ^7,13,14. No entanto, as abordagens baseadas em transiluminação podem exigir agentes depilatórios na área que cobre o pescoço do camundongo, proximidade de uma fonte de luz quente, uso da agulha dentro do cateter, inserção de instrumentos pontiagudos na boca do camundongo e/ou uma pequena incisão a ser feita sobre a traqueia para confirmar a colocação. O método descrito aqui evita esses riscos e se baseia nos melhores aspectos desses métodos publicados. Além de superar as barreiras anatômicas à intubação, considerações de custo foram levadas em consideração em nosso método.

Juntos, o uso de mãos amigas, um suporte de mouse, o otoscópio e uma luz de fibra óptica tornam a intubação mais fácil de aprender e muito mais rápida de executar, com um custo reduzido para os laboratórios. O custo do suporte de intubação disponível comercialmente pode ser evitado usando um feito à mão²⁷. O custo do conjunto da luz de fibra óptica pode ser custeado comprando o cabo de fibra óptica separadamente (a um custo muito menor, ~ $ 9 vs $ 218-kent científico - no momento da redação). Para completar a fonte de luz de fibra óptica, uma tampa cônica de 50 mL com um orifício e fita adesiva pode ser usada para coletar a luz de uma lanterna de telefone celular (consulte a Figura S3 e a Tabela de Materiais). Das et. al descrever um dispositivo semelhante¹¹. Para alguns laboratórios, o custo reduzido dessa solução pode tornar nosso método um procedimento muito mais acessível. Além dos custos, a dificuldade em confirmar a colocação do tubo endotraqueal tornou a intubação de camundongos assustadora.

No passado, para confirmar que o tubo endotraqueal está posicionado adequadamente, os pesquisadores confiaram no embaçamento do espelho, segurando um espelho dental acima do tubo endotraqueal¹⁸. No entanto, o pequeno volume corrente e as variações na temperatura ambiente geralmente evitam o embaçamento do espelho e levam a erros de julgamento. No caso de intubação murina, isso representa um sério risco de lesão. Outros recorreram à indução de desconforto respiratório obstruindo o tubo endotraqueal¹⁰. Isso causa estresse extenso ao animal e fornece menos informações do que o "método da bolha". Além disso, a introdução de terapêutica pulmonar e ar no estômago devido à confirmação inadequada da colocação do tubo endotraqueal pode causar sofrimento, além de prejudicar a eficácia do agente administrado. O uso do "método da bolha" fornece uma confirmação visual mais rápida e confiável da colocação do tubo endotraqueal e é uma ligeira melhoria em relação a um método semelhante descrito anteriormente²⁸. O "método da bolha" também permite que um pesquisador estime aproximadamente a frequência respiratória e o volume corrente do animal.

O posicionamento animal e a visualização das pregas vocais são fundamentais para essa técnica. Descobrimos que os espéculos nasais pediátricos eram muito grandes e pesados para manter a boca aberta e as bochechas fora do caminho durante a intubação, mas foram muito úteis durante o treinamento, pois permitiram que um pesquisador demonstrasse a colocação do otoscópio. Orientar um estagiário a reconhecer a anatomia relevante é difícil, e a visibilidade aprimorada na boca do camundongo foi fundamental, o que foi significativamente auxiliado pelo uso do otoscópio comercial. O estadiamento usando uma lupa iluminada e mãos amigas são essenciais para ajudar operadores inexperientes na intubação, embora possam não ser tão críticos para operadores experientes.

Durante o treinamento neste método, a solução de problemas pode ser necessária. Se o tubo endotraqueal estiver entrando no esôfago repetidamente, a glote pode ter espasmo, o palato mole pode estar inflamado e a colocação adequada pode ser mais difícil. Nessa circunstância, permita que o animal se recupere por vários minutos antes de tentar a intubação novamente. O número de novas tentativas deve ser especificado no protocolo IACUC e sempre respeitado. Se você estiver tendo problemas para ver as pregas vocais, a frequência respiratória pode ser suprimida devido ao excesso de anestesia ou o posicionamento do mouse pode ser inadequado (mais comumente a cabeça inclinada para trás demais). Nesse caso, reposicione o animal e permita que ele se recupere da anestesia antes de tentar novamente. O tubo de bolha deve demonstrar claramente o volume corrente do animal. Se a bolha estiver se movendo apenas ligeiramente, suspiros devido à pressão exercida na traqueia por um tubo endotraqueal mal posicionado podem estar causando esse movimento. Neste caso, consulte Timestamp: 8:25 e Figura S3 para ver o quão prontamente aparente é o volume corrente ao usar o "tubo de bolha" em um tubo endotraqueal colocado corretamente. Se o seu tubo endotraqueal estiver mal colocado, remova-o imediatamente e permita que o animal se recupere antes de tentar o procedimento novamente.

Embora a intubação e a instilação intratraqueal sejam muito superiores a outros métodos, elas têm sido tecnicamente difíceis demais para serem amplamente adotadas. Os métodos descritos aqui tornam a instilação intratraqueal e a intubação murina acessíveis e práticas. Embora as aplicações futuras dessa técnica sejam altamente dependentes do que está sendo entregue aos pulmões e em que contexto eles recebem, um método fácil e confiável abre caminho para muitos avanços na biologia pulmonar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Luz de Fibra ÓpticaKit de Iluminação de Fibra Óptica, Mouse	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	Um componente do conjunto de fibra óptica, compatível com outras luzes e o cabo de fibra óptica de substituição abaixo
Conjunto de Fibra Óptica Alternativa	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	uma alternativa, não discutida (mas não vemos razão para que não funcione)
Montagem Alternativa de Fibra Óptica	Aparelho Harvard	72-9075	uma alternativa, não discutida (mas não vemos razão para que não funcione)
Conjunto Alternativo de Fibra Óptica	Feito à Mão pelo laboratório	N/A	Instruções encontradas aqui usando uma rolha de borracha: DOI 10.3791/50318
Conjunto Alternativo de Fibra Óptica	Feito à Mão pelo laboratório	N/A (materiais listados abaixo)	Feito de uma tampa cônica de 50mL, fita e suporte de intubação de fibra óptica de 0,75mm
, Mouse	Kent Scientific	ETI-MSE-01	Suporte ajustável para intubação, muitas versões self-made disponíveis, racks de ponta e plataformas de madeira usadas, algumas alternativas listaram muitas alternativas adequadas disponíveis.
Suportes de intubação alternativos	Braintree Scientifuc	RIS 100	uma alternativa, não discutida (mas não vemos razão para que não funcione)
Suportes de intubação alternativos	Natsume Seisakusho	KN-1014	uma alternativa, não discutida (mas não vemos razão para que não funcione)
Suportes de intubação alternativos	Vetland	000A3467	uma alternativa, não discutida (mas não vemos razão para que não funcione)
Suportes de Intubação Alternativos	Feitos à mão pelo laboratório	N/A	Feito de um fichário de 3 argolas aqui: DOI 10.3791/60844 (vários métodos alternativos publicados)
Sutura de Seda Trançada Não Absorvível, Tamanho 0	Ferramentas de Ciência Fina	18020-00	qualquer vez mais de 1 polegada danificará a carina
Cateter IV Safelet 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	Ou similar
RS-5358 Micro Dissecante	Fisher	RS-5358	Ou similar, inclui mãos amigas
Lupa com luz e suporte, EOOKU Mão Amiga Magnética Flexível, 5X & 10X 12V 108pcs LED Beads Lâmpada de Ampliação, 3 Modos Giratório Ajustável Gooseneck Braços & Placa de base para serviço pesado	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Pescoço de ganso ajustável flexível /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9.com.br gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= SE& palavras-chave=lupa+vidro+com +luz+EOOKU+3+em+1& qid=1709661 709& sprefix=lupa+vidro+com+ luz+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5	Ou similar, qualquer pinça serrilhada finamente dobrada funcionará
Remoção de cera de ouvido - Ferramenta de remoção de cera de ouvido com conjunto de orelha de 8 peças - Limpador de ouvido com câmera - Kit de remoção de cera com luz - Câmera de ouvido com 6 colheres de ouvido - Limpador de ouvido para iOS e Android (Preto)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Remoção-Removedor-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC=1	ou similar, várias marcas disponíveis
Cabo de fibra óptica AZIMOM PMMA Plastic End Glow 0,75 mm (0,02 pol) 100 m (328 pés) / rolo para teto Star Sky All Kind Led Light Engine Driver Source	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastic-Cuttable-Ceiling-1pcs0-00 98in 328 pés / dp / B07WC9JV5N / ref = sr _1_9?dib = eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.br AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag = se & palavras-chave=fibra%2Boptic%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th = 1	ou similar, a fibra é usada para construir o dispositivo na linha 7
tubo cônico de 50mL	Cell Treat	229421	qualquer tampa cônica de plástico opaco de 50mL deve funcionar. Não entra em contato ou proximidade com o animal, portanto, não há necessidade de esterilidade
Isoflurano	VetOne	Consult Veternary Staff
Innoculum	N/A	Específico para o seu Experimento
Ponteiras de Pipeta (filtro)	N/A	Filtro Estéril p100 e p1000 ponteiras usadas	Marca/Fornecedor não relevante
Câmara de Indução	N/A	Conforme disponível em sua instituição	Marca/Fornecedor não relevante
Almofadas de preparação de isopropanol	N/A	Para limpeza de instrumentos	Marca/Fornecedor não relevante
Tubulação	N/A	funcionará	Para a construção de "tubo de bolha"  (o nosso tem ~ 3 mm de diâmetro e foi retirado de uma linha IV)
Luer lock	N/A	para caber na sua tubagem acima	Para a construção de "tubo de bolha"
Respirador de meia máscara 3M	3M	17-986-9B	para limitar a exposição ao gás
Twist Tie	N/A	N/A	para manter a forma em U do tubo de bolha