Este protocolo descreve a cultura, colheita e concentração de proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis. As proteínas filtradas de cultura (CFPs) são quantificadas, separadas em 20 frações por focalização isoelétrica e posteriormente resolvidas em 30 frações usando um SDS-PAGE preparativo e um sistema de eletroeluição.
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Artigo de método
Separação e Fracionamento de Proteínas de Filtrado de Cultura (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas secretadas do Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) desempenham um papel crucial na patogênese da tuberculose, modulação imunológica e progressão da doença. Compreender sua composição e função é essencial para identificar novos biomarcadores que possam auxiliar no diagnóstico da tuberculose, no desenvolvimento de vacinas e nas intervenções terapêuticas. Este estudo se concentra no isolamento sistemático, fracionamento e caracterização de proteínas filtradas de cultura (CFPs) para permitir análises imunológicas e proteômicas abrangentes. As CFPs foram obtidas de culturas de M. tuberculosis H37Rv cultivadas em condições quimicamente definidas para garantir a expressão proteica controlada. O sobrenadante da cultura foi purificado por filtração e concentrado usando um sistema de fibra oca para reter proteínas acima de 10 kDa. O fracionamento foi obtido por meio de foco isoelétrico em fase líquida, separando proteínas com base em seus pontos isoelétricos em 20 frações distintas. Uma resolução adicional foi realizada usando eletroforese preparativa em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), seguida de eletroeluição, resultando em 30 frações proteicas. As proteínas fracionadas obtidas por meio dessa abordagem fornecem um recurso valioso para perfis imunológicos e análises proteômicas baseadas em espectrometria de massa. Ao isolar e caracterizar sistematicamente as proteínas secretadas, este estudo contribui para a identificação de biomarcadores proteicos específicos da tuberculose, o que pode melhorar a precisão diagnóstica e avançar nossa compreensão da patogênese do M. tuberculosis .
Introdução
Extensas pesquisas destacaram o papel significativo das proteínas secretadas no crescimento e nas interações imunológicas do Mycobacterium tuberculosis1. O filtrado de cultura de M. tuberculosis contém uma complexa variedade de componentes proteicos e não proteicos, tornando-o um recurso valioso para a compreensão de sua biologia e propriedades imunogênicas. Os primeiros estudos proteômicos identificaram quase 450 proteínas no filtradode cultura 2, muitas das quais desempenham um papel crítico na indução de respostas imunes contra a tuberculose. A identificação desses antígenos imunologicamente relevantes é essencial para o desenvolvimento de diagnósticos e vacinas inovadores para a tuberculose. No entanto, o progresso nessa área é desafiado pela complexidade da resposta imune à infecção por M. tuberculosis e pelas limitações técnicas dos métodos de purificação bioquímica usados para isolar proteínas micobacterianas.
Várias técnicas de separação têm sido empregadas para resolver proteínas de M. tuberculosis, facilitando a detecção de proteínas menores, mas funcionalmente significativas, e expandindo o escopo dos estudos proteômicos. Um método de separação ideal resolve efetivamente misturas complexas de proteínas em um número limitado de frações distintas. Duas abordagens amplamente utilizadas para a separação de proteínas micobacterianas são os métodos baseados em cromatografia e eletroforese 1,2.
As técnicas cromatográficas, incluindo afinidade, troca iônica e cromatografia de fase reversa, têm sido a base do fracionamento de proteínas por mais de uma década. Esses métodos têm sido amplamente utilizados para separar as proteínas de M. tuberculosis 3. No entanto, eles são limitados por fatores como baixos rendimentos de proteína e interferência de componentes não proteicos, o que pode complicar as análises imunológicas subsequentes. Essas desvantagens restringem a utilidade da cromatografia para identificar antígenos imunologicamente relevantes.
Para resolver essas limitações, foi adotado um método de separação baseado em eletroforese bidimensional. Na primeira dimensão, as proteínas são separadas com base em seu foco isoelétrico (IEF) usando um sistema IEF preparativo, que segrega as proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos. Na segunda dimensão, as proteínas são resolvidas por peso molecular usando SDS-PAGE preparativo, seguido de eluição com um instrumento de eluição de gel inteiro.
Essa abordagem bidimensional oferece várias vantagens. Reduz significativamente a complexidade das proteínas filtradas de cultura (CFP), fracionando-as em 600 frações distintas. Além disso, as frações são adequadas para análise imunológica direta, pois o processo de eluição não introduz componentes que interfiram nos ensaios imunológicos celulares 4,5,6.
Este protocolo detalha a preparação e separação de proteínas filtradas de cultura para análise imunológica6.
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Protocolo
Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Crescimento de Mycobacterium tuberculosis e preparação de proteínas filtradas de cultura (CFPs)
- Preparação do meio líquido de Sauton
- Combine os seguintes componentes em 950 mL de água destilada: Glicerol, 30,0 mL; Dihidrogenoortofosfato de potássio (KH2PO4), 0,5 g; Sulfato de magnésio, 0,5 g; Ácido cítrico, 2,0 g; Hidrolisado de caseína, 0,5 g; Sulfato de amônio férrico, 0,05 g; Glutamato de sódio, 4,0 g.
- Ajuste o pH para 7,2 usando hidróxido de potássio a 40% (aproximadamente 5 mL / L).
- Completar o volume para 1 L e autoclave a 15 psi por 20 min.
- Preparação da suspensão micobacteriana
- Transfira colônias de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) cultivadas em encostas de Lowenstein-Jensen (LJ) para 2 mL de meio líquido de Sauton.
- Quebre os aglomerados de micobactérias agitando vigorosamente com contas de vidro em condições estéreis.
- Iniciando o crescimento micobacteriano
- Transfira a suspensão bacteriana para um frasco McCartney contendo 10 mL de meio líquido de Sauton.
- Incubar o frasco a 37 °C durante 2 semanas.
- Ampliando a cultura
- Transfira a cultura cultivada para 200 mL de meio Sauton em um frasco de 1 L.
- Incubar num shaker a 37 °C durante 4 semanas.
- Transferir a cultura em fase logarítmica para um balão de 4 L contendo 2 L de meio de Sauton.
- Cultive a cultura a 37 °C em condições estacionárias por mais 4 semanas até que uma película superficial se forme.
- Colheita das proteínas filtradas de cultura (CFPs)
- Colha a cultura por centrifugação a 1.000-1.500 x g por 30 min em temperatura ambiente.
- Filtrar o sobrenadante através de um sistema de filtragem a vácuo de 0,45 μm.
- Concentrar o filtrado contendo CFP utilizando um sistema de filtragem de fluxo tangencial com um corte de 10 kDa.
- Armazenando o CFP coletado
- Estime o teor de proteína usando o kit de ensaio BCA disponível comercialmente.
- Alicotar as proteínas, adicionar azida sódica até uma concentração final de 0,2% e armazenar a -80 °C.
2. Focalização isoelétrica em fase líquida preparativa (IEF)
- Preparação da amostra de proteína
- Solubilizar Mycobacterium tuberculosis CFP em 60 mL de tampão de separação IEF contendo 8 M de ureia, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 5% de glicerol, 2% de digitonina, 2% de anfólitos (pH 3,0-10,0 e pH 4,0-6,0 na proporção de 1:4).
- Configurando o sistema IEF
- Encher a câmara do ânodo com ácido fosfórico 0,1 M e a câmara catódica com hidróxido de sódio 0,1 M.
- Monte a célula preparativa IEF de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Realizando IEF
- Carregue até 350 mg de proteína no sistema IEF.
- Concentre as proteínas a 4 °C com um sistema de água circulatória de resfriamento.
- Aplique uma potência constante de 12 W até que a tensão se estabilize em aproximadamente 1400 V e, em seguida, continue por mais 30 minutos.
- Coleta e análise das frações
- Colher frações IEF e determinar seu pH.
- Analise cada alíquota por SDS-PAGE e visualize proteínas usando coloração de prata.
3. SDS-PAGE preparativo e eluição de gel inteiro
- Preparação de amostras para SDS-PAGE
- Misture frações IEF com tampão de amostra 6x SDS-PAGE disponível comercialmente.
- Aqueça a mistura a 95 °C por 5 min.
- Executando SDS-PAGE preparativo
- Coloque até 10 mg de proteína em um gel de poliacrilamida de 16 cm × 20 cm com um gel de empilhamento de 4% e um gel de resolução de 12,5%.
- Execute a eletroforese a uma corrente constante de 50 mA até que a frente do corante esteja a 2 cm do fundo.
- Proteínas eluidoras do gel
- Equilibre o gel em tampão de eluição (60 mM de Tris, 40 mM de CAPS, pH 9,4) por 10 min.
- Transfira o gel para o instrumento de eluição de gel inteiro.
- Eluir proteínas aplicando uma corrente constante de 250 mA por 1 h.
- Coleta e análise das frações
- Eluir as proteínas separadas em 30 frações individuais, cada uma com um volume de 2,5 ml.
- Determine a concentração de proteína usando o método de estimativa de proteína BCA seguindo as instruções do fabricante.
- Analise 10 μg de proteína de cada fração por SDS-PAGE e visualize usando coloração de prata.
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Resultados
A Figura 1 ilustra a complexidade das proteínas filtradas de cultura (CFP) preparadas. Inicialmente, 100 μg de CFP foram submetidos à análise 2D-SDS PAGE para avaliar sua complexidade. Essa análise revelou a presença de quase 100 manchas proteicas distintas na CFP (Figura 1).
As 20 frações coletadas de cada corrida foram analisadas por SDS-PAGE. Destes, três frações representativas de três ensaios diferentes são mostradas na
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Discussão
As proteínas filtradas em cultura (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis representam uma mistura complexa de diversos componentes proteicos presentes em concentrações variadas. Estudos proteômicos identificaram até 1.314 proteínas dentro da PFC 4,5. Numerosas investigações destacaram o papel crucial dos CFPs na modulação das respostas imunes. Especificamente, os CFPs desempenham um papel indispensável tanto na imunidade me...
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ä Sistema de filtragem de fluxo tangencial de fluxo KTA | CYTIVA | 29038437 | |
| Anfólitos (pH 3,0 a 10,0) | BIO-RAD | 1632094 | |
| Anfólitos (pH 4,0 a 6,0) | BIO-RAD | 1631143 | |
| Ensaio de proteína BCA | MERCK | 71285-M | |
| CAPS | MERCK | C2632 | |
| Hidrolisado de caseína | MERCK | 65072-00-6 | |
| Ácido cítrico | MERCK | C0759 | |
| Digitonina | MERCK | 300410 | |
| TDT | MERCK | D9779 | |
| Sulfato de amônio férrico | HIMÍDIA | GRM10944 | |
| Glicerol | MERCK | G5516 | |
| Glicerol | MERCK | 252859 | |
| Inclinações de Lowenstein-Jensen | HIMÍDIA | SL001 | |
| Sulfato de magnésio | MERCK | M7506 | |
| Sistema de Filtração a Vácuo de Liberação Rápida Millipore Stericup | MERCK | S2HVU11RE | |
| Ácido fosfórico | MERCK | 695017 | |
| Di-hidrogenoortofosfato de potássio | MERCK | Pág. 0662 | |
| Hidróxido de potássio | MERCK | 484016 | |
| Célula IEF Preparativa (Rotofor) | BIO-RAD | 170-2986 | |
| Azida de sódio | MERCK | S2002 | |
| Glutamato de sódio | MERCK | 49621 | |
| Hidróxido de sódio | HIMÍDIA | MB095 | |
| Tris | MERCK | 252859 | |
| Ureia | MERCK | U5128 | |
| Aparelho de Gel Eluter Inteiro | BIO-RAD | 1651250 |
Referências
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
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- Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
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- Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
- Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
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- Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).
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Reimpressões e permissões
