Separação e Fracionamento de Proteínas da Parede Celular e da Membrana Celular de Mycobacterium tuberculosis para Análise de Proteínas a Jusante

Resumo

Este protocolo separa proteínas insolúveis da parede celular e da membrana em frações simples (1-5 proteínas) usando focalização isoelétrica preparativa (IEF) com base no ponto isoelétrico, seguido de separação por peso molecular. As frações resultantes podem ser usadas diretamente para análises imunológicas e proteômicas sem purificação adicional.

Resumo

As proteínas da parede celular e da membrana da micobactéria, que desempenham um papel central na patogênese da tuberculose, foram separadas com sucesso usando focalização isoelétrica preparativa (IEF) e eletroforese preparativa em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Seguido de eluição em gel, superando limitações nos métodos convencionais de separação de proteínas hidrofóbicas. Neste procedimento, as colônias de M. tuberculosis foram transferidas das inclinações de Lowenstein-Jensen para 2 mL de caldo 7H9, dispersas com esferas de vidro e incubadas a 37 °C por 2 semanas. Em seguida, a cultura foi ampliada para 200 mL e cultivada em uma coqueteleira por 4 semanas. Foi ainda aumentado para 1 L com 500 mL de caldo 7H9 e cultivado por mais 4 semanas. As micobactérias cultivadas foram peletizadas por centrifugação a 1741 × g por 30 min. Para cada pellet de 2 g, 1 mL de tampão de ruptura foi adicionado e a amostra foi sonicada. O lisado foi centrifugado a 3436 × g por 15 min para remover as células intactas, e o sobrenadante foi concentrado. Este sobrenadante (lisado de células inteiras) foi centrifugado a 13751 × g por 30 min para granular proteínas da parede celular. O sobrenadante restante foi ultracentrifugado a 100.000 × g por 4 h para separar a membrana celular e o citosol. As proteínas isoladas da parede celular e da membrana foram carregadas em um sistema IEF preparativo líquido a 4 °C e separadas a 12 W até que a voltagem se estabilizasse em 1400 V, o que separa 20 frações. Essas frações de IEF foram separadas por SDS-PAGE preparativo, e as proteínas foram eluídas usando um eluidor de gel inteiro a 250 mA, resultando em 30 frações. Por meio desse protocolo, conseguimos identificar novas paredes celulares de M. tuberculosis e biomarcadores específicos de membrana, e também mostra potencial para caracterizar proteínas semelhantes em outros patógenos.

Introdução

Estudos imunológicos têm demonstrado que, além das proteínas solúveis, que são fáceis de purificar, a resposta imune humana a patógenos como o M. tuberculosis também é direcionada à proteína hidrofóbica presente na parede celular¹ e às proteínas da membrana celular² do Mycobacterium tuberculosis. Essas proteínas da parede celular e da membrana desempenham um papel crucial no controle imunológico contra muitos patógenos, incluindo a tuberculose. Algumas dessas proteínas são relatadas como antígenos imunodominantes que montam a resposta das células T e B. Em contraste, outras proteínas são identificadas como assinaturas moleculares de patógenos que são reconhecidos por iniciar uma resposta imune inata, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) por células imunes, iniciando assim uma resposta imune. Por exemplo, lipoproteínas micobacterianas como LprG, LpqH, LprA e PhoS1 são reconhecidas pelo receptor Toll-like 2³.

A natureza hidrofóbica das proteínas da parede celular e da membrana apresenta desafios técnicos significativos em termos de solubilização e separação. Estudos têm demonstrado que as proteínas de membrana constituem aproximadamente 20% a 30% das regiões codificantes de todos os organismos, incluindo micobactérias ^4,5. Devido à sua natureza intrínseca e desafios técnicos, as proteínas da parede celular e da membrana são mais difíceis de solubilizar e isolar em comparação com as proteínas solúveis. Como resultado, apenas 2% das estruturas proteicas da membrana foram relatadas⁶. Vários fatores contribuem para a dificuldade de isolamento dessas proteínas. O principal desafio é sua baixa abundância dentro da célula, o que complica o isolamento de proteínas individuais para caracterização posterior⁷. Além disso, essas proteínas tendem a se agregar, complicando ainda mais sua solubilidade. Esse problema pode ser resolvido adicionando detergentes para auxiliar na solubilização. No entanto, algumas proteínas ainda podem formar agregados mesmo na presença de detergentes, caso em que agentes caotrópicos e agentes redutores podem ser usados para melhorar a solubilidade.

O uso de detergentes para solubilização pode interferir nos métodos de separação subsequentes. Por exemplo, detergentes carregados não podem ser usados com cromatografia de troca iônica e todos os detergentes podem interromper a cromatografia de interação hidrofóbica⁸. Portanto, selecionar um detergente compatível com o método de separação escolhido é fundamental. Outro passo importante no isolamento de proteínas da parede celular e da membrana é a remoção de detergentes usados para solubilização, pois estes podem interferir nas análises funcionais subsequentes das proteínas.

Desenvolvemos uma metodologia robusta que supera muitos dos desafios associados à análise de proteínas de membrana, particularmente as proteínas hidrofóbicas da parede celular e da membrana celular. Um dos principais desafios no estudo dessas proteínas é sua solubilização, pois sua natureza hidrofóbica as torna difíceis de extrair e analisar. A metodologia descrita aqui emprega um tampão de foco isoelétrico (IEF) especialmente formulado, que solubiliza eficientemente as proteínas da parede celular e da membrana celular. Essa etapa de solubilização é crítica, pois permite a análise subsequente dessas proteínas hidrofóbicas.

Uma vantagem adicional deste método é sua capacidade de reduzir a complexidade da mistura de proteínas. Ao empregar duas técnicas de separação complementares - baseadas no ponto isoelétrico (pI) e no peso molecular das proteínas - esta metodologia separa eficientemente as proteínas da parede celular e da membrana celular em frações simplificadas. Cada fração normalmente contém apenas uma a três proteínas, aumentando significativamente a resolução e facilitando a caracterização a jusante.

Esta metodologia, desenvolvida usando proteínas da parede celular e da membrana celular do Mycobacterium tuberculosis como sistema modelo, aborda efetivamente os desafios associados ao isolamento e análise de proteínas hidrofóbicas. Ele fornece uma abordagem confiável para o isolamento, separação e caracterização dessas frações complexas de proteínas, avançando a capacidade de estudá-las em detalhes.

Protocolo

Este estudo cumpriu as diretrizes governamentais relevantes e foi aprovado pelo Comitê Consultivo Científico Institucional e pelo Comitê de Ética. O consentimento informado foi obtido da população do estudo antes da coleta das amostras.

1. Cultura de M. tuberculosis

1. Transfira aproximadamente 10 colônias de M. tuberculosis das inclinações de Lowenstein-Jensen para 2 mL de meio de caldo 7H9 (suspenda 2,35 g de base de caldo Middlebrook 7H9 em 400 mL de água destilada, 50 mL de suplemento de albumina dextrose catalase oleica [OADC], 0,5 g de Tween 80 e perfaça até 500 mL)
   NOTA: M. tuberculosis é um patógeno do Grupo de Risco 3; deve ser manuseado em um gabinete de segurança biológica (BSC) na instalação BSL3. Equipamento de proteção individual (EPI) apropriado deve ser usado.
2. Disperse as células usando esferas de vidro em condições estéreis em um agitador de garrafas a 15 rpm por 1 min.
3. Transferir a suspensão bacteriana para 10 ml de meio de caldo 7H9 num frasco McCartney e incubar a 37 °C durante 2 semanas numa incubadora agitadora a 30 rpm.
4. Aumente a cultura da fase logarítmica para 200 mL de meio de caldo 7H9 e cultive em uma cultura shaker por 4 semanas a 30 rpm.
5. Além disso, aumente a cultura em um frasco de 1 L contendo 500 mL de meio de caldo 7H9 e cresça como uma cultura agitadora a 30 rpm por 4 semanas a 37 ° C.
6. Colha as micobactérias centrifugando a 1741 g por 30 min.

2. Preparação de proteínas lisadas de células inteiras

1. Submeter o sedimento bacteriano isolado à sonicação seguindo um protocolo padrão.
2. Prepare o tampão de ruptura com a seguinte composição: 20 mM Tris com 8,5% (8,5 g por 100 mL) de NaCl.
3. Ajuste o pH final para 7,4 com HCl concentrado.
4. Adicione inibidores de protease recém-preparados ao tampão de ruptura com as seguintes concentrações (os detalhes dos inibidores de protease a serem adicionados estão listados na Tabela Suplementar 1)
5. Trate os bacilos de M. tuberculosis (100 mL de volume embalado e pesado) para cada 2 g do pellet de células bacterianas, adicione 1 mL de tampão de ruptura com lisozima (1 mg / 5 mL de suspensão celular) e incube por 15 min a 37 ° C com agitação suave.
6. Suspenda os bacilos em duas vezes seu volume de tampão de ruptura.
7. Adicione 0,04% (peso / vol) de azida sódica e 0,05% de Tween 80 ao tampão.
8. Interrompa as células bacterianas no tampão de ruptura usando um sonicador com um ciclo de 9 s ligado e 9 s desligado por 30 min a 40% de amplitude, mantendo a suspensão no gelo para evitar a desnaturação da proteína.
9. Centrifugar o lisado preparado a 3438 g durante 15 min a 4 °C para remover as células intactas.
10. Concentrar o sobrenadante com concentradores centrífugos (corte de 3 kDa - 5 ml).
11. Determine a concentração de proteína no sobrenadante usando o ensaio de quantificação de proteína do ácido bicinconínico (BCA) usando a proteína BSA como padrão.
    NOTA: Na análise SDS-PAGE, carregue 50 μg de proteína para análise.

3. Isolamento de proteínas da parede celular e da membrana celular por ultracentrifugação

1. Isole a parede celular, a membrana celular e as proteínas citosólicas de todo o lisado celular seguindo o protocolo de Raja et ^al.9. conforme descrito abaixo.
2. Centrifugar todo o lisado celular a 13751 × g a 4 °C durante 30 min, separando as proteínas da parede celular sob a forma de um sedimento.
3. Submeter o sobrenadante a ultracentrifugação a 100.000 × g a 4 °C durante 4 h utilizando uma ultracentrífuga, separando as proteínas da membrana celular como um pellet e deixando as proteínas citosólicas no sobrenadante.
4. Estime as concentrações de proteínas na parede celular e nas frações da membrana celular usando o ensaio de proteína BCA.
   NOTA: Na análise SDS-PAGE, carregue 50 μg de proteína para análise. A parede celular e a membrana celular separadas são armazenadas em um freezer a -80 °C até uma análise posterior.

4. Focalização isoelétrica preparativa em fase líquida (Rotofor [aparelho IEF])

1. Solubilizar as proteínas da parede celular e da membrana celular isoladas por ultracentrifugação em um tampão IEF contendo 8 M de ureia, 1 mM de DTT, 5% de glicerol e 2% de digitonina.
2. Adicione 2% de anfólitos (pH 3,0 a 10,0 e pH 4,0 a 6,0 na proporção de 1:4)
3. Fracionar as proteínas solubilizadas usando um sistema IEF líquido mantido a 4 °C com banho-maria de resfriamento.
4. Realize a separação IEF de acordo com as instruções do fabricante, aplicando uma potência constante de 12 W até que a tensão se estabilize (entre 1300 V e 1600 V).
5. Continue a execução do IEF por mais 30 minutos após a estabilização de tensão, com um tempo total de execução de aproximadamente 5-6 h.
6. Colete as frações individuais do IEF usando uma bomba de vácuo e determine seus valores de pH.
7. Submeta as frações separadas (50 μg) a SDS-PAGE e visualize as proteínas usando Coomassie Brilliant Blue (CBB) ou coloração de prata. Conservar as fracções separadas do IEF num congelador a -80 °C até uma análise mais aprofundada.

5. SDS-PAGE preparativo e eluição de gel inteiro

1. Misture a parede celular separada por IEF e as frações da membrana celular com 6x tampão de amostra SDS-PAGE e aqueça a 95 ° C por 5 min antes da análise SDS-PAGE.
2. Separe as frações de proteína na segunda dimensão usando géis de poliacrilamida de 16 cm e 20 cm, consistindo em um gel de resolução de 12,5% e um gel de empilhamento de 4%.
3. Use um único poço de amostra de 13 cm de comprimento para carregar a amostra.
4. Conduza eletroforese a uma corrente constante de 50 mA/gel até que a frente do corante atinja o fundo do gel.
5. Equilibre o gel em tampão de eluição (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM de ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanossulfônico [CAPS]) por 10 min após a execução da eletroforese.
6. Transfira o gel para um aparelho de eluição de gel inteiro, conforme descrito pelo fabricante do instrumento.
7. Eluir as proteínas do gel executando o eluidor a uma corrente constante de 250 mA por 1 h.
8. Colete aproximadamente 30 frações de proteína, cada uma com um volume de 3 mL, de cada gel usando uma bomba de vácuo.
9. Quantificar a concentração de proteínas nas fracções eluídas utilizando o ensaio de proteínas BCA.
10. Submeta 10 μg das frações eluídas à análise SDS-PAGE e visualize pela coloração azul brilhante de Coomassie (CBB).
    NOTA: As frações eluídas de gel inteiras separadas foram armazenadas no freezer a -80 ° C até uma análise posterior.

Resultados

Isolamento de proteínas da parede celular e da membrana celular por ultracentrifugação de alta velocidade
As proteínas da parede celular e da membrana foram isoladas de lisados de células inteiras por meio de ultracentrifugação, conforme descrito no protocolo. A análise SDS-PAGE das frações subcelulares separadas - parede celular, membrana celular e perfis de proteína do citosol de M. tuberculosis é mostrada na Figura 1.

Separa...

Discussão

A natureza hidrofóbica das proteínas da parede celular e da membrana apresenta desafios experimentais significativos em sua solubilização e separação. No protocolo acima mencionado, descrevemos um novo método de separação baseado em eletroforese bidimensional para isolar efetivamente essas proteínas hidrofóbicas. Neste protocolo, inicialmente separamos as proteínas da membrana e da parede celular com base em seus pontos isoelétricos usando o sistema IEF líquido. Para resolver o problema ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo 7H9	Himídia	M198
40% Bio-Lyte 3/10 Anfólito	BIO-RAD	1631113
Ensaio de proteína BCA	MERCK	BCA1
Bio-Lyte 5/7 Anfólito	BIO-RAD	1631152
concentradores centrífugos 3 kDa	MERCK	Z629456
Digitonina.	MERCK	D141
Dnase	MERCK	11284932001
TDT	MERCK	D9779
EDTA	MERCK	E9884
EGTA	MERCK	E3889
Glicerol	MERCK	G5516
Leupeptina	MERCK	E18
Pestatina A	MERCK	Pág. 5318
PMSF	MERCK	78830
Rnase	MERCK	10109134001
Rotofor	BIO-RAD	170-2986	aparelho de focalização isoelétrica (IEF)
Soniador	Vibra-Cell, Sônica	VC 750
TLCK	MERCK	T7254
TPCK	MERCK	4376
ureia	MERCK	U5378
Aparelho de Gel Eluter Inteiro	BIO-RAD	1651250