Artigo de método

In situ Isolamento e Cultura de Bactérias Recalcitrantes do Solo usando um Chip de Isolamento (iChip)

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DOI:

10.3791/67692

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6 de agosto de 2025

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o projeto e o uso de um chip de isolamento (iChip) para o cultivo in situ de micróbios recalcitrantes do solo em seu ambiente natural. Também descreve o cultivo in situ de bactérias do solo produtoras de antimicrobianos. O protocolo pode ser adaptado para recuperar bactérias de diversos nichos com outras propriedades desejáveis.

Resumo

Os ecossistemas abrigam milhões de micróbios ambientais, alguns deles capazes de produzir produtos biotecnologicamente relevantes, como enzimas, vitaminas, aminoácidos, ácidos orgânicos, agentes antiparasitários e agentes antimicrobianos. A maioria dessas bactérias ambientais é considerada "incultivável", pois os métodos de cultivo de laboratório não atendem às suas necessidades nutricionais / ambientais. Além disso, como coexistem na natureza, também podem ser dependentes de um nutriente/metabólito produzido por outro membro da comunidade microbiana. Trazer a diversidade microbiana "não cultivada" para a cultura apresentará uma oportunidade de explorar a vasta gama de produtos bioativos que eles podem codificar. Este artigo descreve a implementação da tecnologia iChip, uma câmara de difusão multicanal desenvolvida para uma cultura in situ de alto rendimento das bactérias "não cultiváveis". Dada a ameaça global da resistência antimicrobiana, o artigo fornece um protocolo detalhado para cultivo in situ e recuperação de isolados da 'matéria escura' microbiana capaz de produzir agentes antimicrobianos, por exemplo. Este protocolo descreve as etapas envolvidas, desde a etapa de coleta de amostras de solo até a recuperação dos isolados, e destaca os fatores plausíveis que podem influenciar o sucesso do isolamento. O uso dessa tecnologia não apenas facilita o isolamento de bactérias "não cultiváveis" para a descoberta de antibióticos, mas também permite que os pesquisadores se aprofundem na complexa ecologia do solo, que pode ser aproveitada para uma infinidade de outras aplicações.

Introdução

Repositórios ricos de micróbios anteriormente inexplorados existem em ambientes naturais, como solo, corpos d'água e ambientes extremos. No entanto, é um desafio explorar essa enorme biodiversidade de micróbios, pois a maioria deles não pode ser facilmente cultivada usando meios e métodos tradicionais de laboratório. A grande anomalia da contagem de placas descreve esse fenômeno, destacando o número discordante de microrganismos que podem ser observados visualmente versus aqueles que crescem em meios de cultura1. Contornar essa barreira e permitir o acesso à diversidade incultivável de micróbios e seus produtos poderia atender a várias necessidades biotecnológicas.

Por exemplo, o desenvolvimento de resistência antimicrobiana tornou-se uma ameaça à saúde pública global. As principais empresas farmacêuticas têm relutado em buscar a descoberta de novos antimicrobianos, fazendo com que a taxa de descoberta diminua em comparação com a taxa de surgimento de resistência aos antibióticos existentes 2,3. Assim, há uma necessidade crítica para a descoberta de novos antimicrobianos4. Como as comunidades microbianas evoluíram juntas concomitantemente ou em competição5, elas desenvolveram o potencial de produzir novos compostos químicos que aumentam suas chances de sobrevivência. A enorme diversidade de micróbios ambientais e seus produtos não foi totalmente explorada, pois os métodos tradicionais baseados em cultura de laboratório geralmente levam ao isolamento de micróbios semelhantes e conhecidos. Isso ocorre porque os meios e métodos de cultura convencionais são tendenciosos para o cultivo de micróbios relevantes para o homem e não conseguem imitar os ambientes naturais. Projetar meios de cultura para cultivar micróbios ambientais é um desafio, pois o crescimento de algumas espécies pode exigir vários nutrientes, muitas vezes produzidos por outros micróbios nas proximidades, e condições ambientais específicas.

Para resolver esse problema e cultivar micróbios ambientais in situ, as câmaras de difusão foram desenvolvidas pela primeira vez6. A câmara de difusão é um O-ring de aço inoxidável. O espaço dentro do anel é preenchido com ágar semeado com uma diluição de amostra apropriada. A parte superior e inferior do anel são então seladas com membranas de policarbonato, que permitem a difusão de nutrientes e metabólitos derivados do solo, evitando a infiltração de outros micróbios na câmara6. Após a semeadura, a placa é colocada no ambiente de onde a amostra é coletada para permitir o cultivo in situ. A câmara de difusão foi altamente eficiente e resultou no cultivo de numerosos micróbios anteriormente incultiváveis. No entanto, o projeto do O-ring com ágar tornou-se trabalhoso e de baixo rendimento, deixando em aberto um espaço problemático para novas inovações6. Logo depois, um chip de isolamento (iChip), capaz de cultura in situ e recuperação simultânea de culturas puras de alto rendimento, foi projetado7. Este projeto é conceitualmente o mesmo que uma câmara de difusão, mas consiste em vários canais onde cada canal atua como uma câmara de difusão independente, permitindo a recuperação potencial de uma única microcolônia de cada câmara8. A reimaginação do projeto da câmara de difusão aumentou muito o rendimento da tecnologia e permitiu o isolamento e o cultivo de uma maior biodiversidade de táxons do solo, água marinha9, fontes termais10, etc. A teixobactina, um antibiótico recentemente descrito, foi descoberta seguindo a tecnologia descrita acima11. Ele exibiu um novo mecanismo de ação antimicrobiana e foi considerado letal contra patógenos que causam infecções invasivas, demonstrando que o isolamento de alto rendimento de micróbios da "matéria escura" microbiana pode ser eficientemente simplificado para a descoberta de produtos naturais biotecnologicamente relevantes usando essa tecnologia12.

Este artigo serve como um guia de procedimento para a implementação efetiva desta tecnologia de alto rendimento para cultivo in situ e recuperação de bactérias recalcitrantes produtoras de antimicrobianos da "matéria escura" microbiana do solo. O protocolo descreve o projeto de um chip de isolamento, a coleta de amostras, a preparação de amostras, a semeadura, a incubação e a recuperação. Embora o protocolo apresentado demonstre a cultura in situ de micróbios do solo, o mesmo pode ser facilmente adaptado para o cultivo in situ de micróbios de qualquer ambiente. Os recursos de alto rendimento dessa tecnologia podem aumentar a probabilidade de descobrir novos micróbios e utilizar seu potencial biossintético para várias aplicações de biotecnologia.

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Protocolo

1. Design e impressão 3D

  1. Escolha o design e o tamanho com base no tipo de amostra, volume por câmara de difusão, dimensões da membrana a ser usada e o rendimento necessário (número de câmaras de difusão).
    NOTA: A espessura da placa do meio e o diâmetro de cada canal determinam o volume de cada câmara de difusão cilíndrica. O tamanho depende do número de câmaras de difusão individuais a serem acomodadas, e as dimensões da membrana dependem diretamente do número de câmaras de difusão cobertas (Figura 1).
  2. Use a opção de inserir formas em qualquer programa de software de apresentação para inserir círculos com as dimensões necessárias para servir como iChip. Insira círculos menores para representar os canais. Organize os círculos menores no padrão desejado para preparar um projeto preliminar para a placa superior/inferior e intermediária. Selecione o experimento e use o menu do botão direito do mouse para salvar o experimento preliminar como uma imagem.
  3. Usando o projeto preliminar como modelo, comece a criar um projeto bidimensional (2D) usando o software de projeto auxiliado por computador (CAD).
    1. No menu de esboço, insira formas predefinidas, predominantemente círculos, para criar o design básico para as placas e a matriz de canais.
    2. Use a opção de dimensão para definir as dimensões reais das placas e canais. Clique em OK para finalizar o projeto e, em seguida, use a função de extrusão para converter o projeto 2D em um modelo 3D da espessura desejada.
    3. Por fim, use o menu de arquivo Salvar para salvar uma cópia do modelo 3D no formato de arquivo de estereolitografia (STL), compatível com impressão 3D.
  4. Escolha o material para impressão com base na aplicação desejada, considerando fatores como o método preferido de esterilização e o local de plantio. Por exemplo, escolha um material resistente à temperatura se a autoclavagem for usada para esterilização ou se for plantada em um local onde a temperatura seja alta.
    NOTA: A impressão 3D para este experimento foi realizada usando um material semelhante à cerâmica que pode suportar altas temperaturas de até 268 °C e, portanto, era autoclavável.
  5. Escolha um método de impressão 3D apropriado, dependendo das dimensões (detalhe e resolução) e do material utilizado.
    NOTA: A impressão 3D usando estereolitografia, um método de manufatura aditiva, pode criar estruturas intrincadas curando uma resina termofixa com um laser ultravioleta (UV). A estereolitografia pode ser usada com vários materiais e permite excelentes acabamentos superficiais e alta resolução de detalhes.

2. Coleta de amostras de solo

  1. Baixe e instale um aplicativo móvel de geocodificação que permite a identificação de locais de 3 m x 3 m em todo o mundo, fornecendo um endereço exclusivo de 3 palavras para o site de qualquer loja de aplicativos móveis. Identifique um local para coleta de amostras de solo. Em seguida, abra o aplicativo móvel de geocodificação para identificar o site de interesse e seu endereço exclusivo de três palavras.
  2. Registre o endereço exclusivo de três palavras, data, hora, profundidade em que a amostra deve ser coletada, as condições climáticas, a vida vegetal e animal próxima, a exposição do local e a temperatura do local (superfície e subsuperfície na profundidade desejada).
    NOTA: O solo pode conter bactérias patogênicas. Portanto, use equipamentos de proteção individual adequados (luvas, jalecos, etc.) e siga os protocolos adequados para o nível de biossegurança 2. Minimize o contato para evitar a contaminação e exposição da amostra. Desinfete a superfície de trabalho antes e depois de manusear amostras de solo.
  3. Descontamine a pá borrifando-a com etanol 70% e limpando-a. Descontamine a caixa de poliestireno, na qual o solo será coletado, borrifando-a com etanol 70% e limpando-a. Deixe qualquer etanol residual secar completamente antes de prosseguir.
    NOTA: Embora este protocolo utilize uma caixa de poliestireno para coletar a amostra e realizar a incubação, alternativas como recipientes de vidro e metal também podem ser usadas, se desejado.
  4. Remova qualquer material vegetal, serapilheira e/ou pedras da superfície para expor a camada superficial do solo. Descontamine a pá novamente como antes, limpe a camada superficial do solo e avalie o solo a uma profundidade de 3-6 polegadas abaixo da superfície. Use uma régua para medir a profundidade da superfície. Usando a pá esterilizada na superfície, colete 4-5 kg de solo da profundidade desejada na caixa de poliestireno.
  5. Feche a caixa com uma tampa. Se for necessário coletar mais de uma amostra, descontaminar a pá entre dois locais de amostragem para evitar contaminação cruzada. Depois que todas as amostras forem coletadas, transporte-as de volta ao laboratório imediatamente.

3. Preparação da amostra para semeadura

  1. A partir da amostra de solo coletada, pesar 1 g de solo livre de detritos, pedras e serapilheira em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL contendo 10 mL de solução salina estéril.
    NOTA: Preserve parte da amostra de solo, pois os estoques de glicerol13,14 a -80 ° C para conservar a população microbiana nativa para necessidades futuras.
  2. Misture o solo com a solução salina por vórtice por cerca de 10 s para criar uma pasta de solo. Deixe o tubo da centrífuga intacto por 5 minutos para permitir que as grandes partículas de sujeira no tubo se assentem. Em seguida, transfira cuidadosamente a suspensão de solo sobrenadante para um novo tubo de ensaio rotulado como "S".
  3. Usando a suspensão de solo como amostra não diluída, execute a diluição em série transferindo 1 mL da amostra para 9 mL de solução salina estéril em um tubo novo. Prepare diluições de 10-1 a 10-5.
    NOTA: A contagem de placas das suspensões de solo diluídas em meios não seletivos pode fornecer algumas informações sobre a densidade de bactérias na amostra, que podem ser usadas para escolher a diluição apropriada para a semeadura. No entanto, observe que esta é apenas uma estimativa das bactérias cultiváveis presentes na amostra.

4. Semeadura e montagem

  1. Dentro de um gabinete de biossegurança, a superfície descontamina a placa superior, a placa inferior e a placa intermediária por imersão em etanol a 70% por 10 min. Enxágue o excesso de etanol lavando as placas com água deionizada estéril e deixe-as secar ao ar em uma placa de Petri estéril.
  2. Coloque a placa do meio em uma placa de Petri estéril, pronta para a semeadura. Em seguida, derreta o meio de ágar SMS no micro-ondas, deixe-o esfriar e transfira 22,5 mL de ágar SMS a 45 ° C para um tubo de centrífuga de 50 mL.
  3. Para isso, adicione 2,5 mL de uma diluição apropriada da amostra de solo e misture bem por inversão suave, evitando a introdução de bolhas de ar.
    NOTA: Escolha uma diluição apropriada para a semeadura. Para obter uma densidade de semeadura final como na diluição 10-4 , escolha a suspensão 10-3 , pois a amostra será diluída 10 vezes no meio usado para a semeadura.
    1. Escolha a diluição de semeadura para imobilizar 1 célula por câmara, que pode então se transformar em uma colônia in situ.
      NOTA: A água destilada também pode ser usada no lugar do meio SMS para imitar o ambiente do solo e permitir o crescimento de microrganismos que crescem apenas nessas condições. Opcionalmente, agentes antifúngicos como a cicloheximida também podem ser adicionados ao meio de semeadura para evitar o crescimento de fungos.
  4. Despeje lentamente 3-4 mL do meio de ágar SMS semeado sobre a placa do meio, cobrindo toda a superfície. Em seguida, deixe o meio de ágar SMS endurecer por cerca de 5 a 10 minutos. Verifique se o meio de ágar SMS está definido. Em seguida, com uma lâmina de barbear estéril, raspe o excesso de ágar SMS da superfície da placa, deixando para trás os tampões de ágar nas câmaras de difusão individuais.
  5. Depois de remover a folha protetora de um dos filtros de membrana de policarbonato de 0,03 μm, coloque-a cuidadosamente no interior da placa superior usando uma pinça estéril. Em seguida, coloque outro filtro de membrana de policarbonato de 0,03 μm no lado exposto da placa intermediária semeada usando uma pinça estéril.
  6. Coloque as placas superior e inferior, imprensando a placa intermediária e as membranas de policarbonato, tendo o cuidado de alinhar os orifícios dos parafusos em todas as placas, para completar a montagem (Figura 1B). Aperte as porcas e parafusos para prender o conjunto.
    NOTA: É uma boa prática montar um iChip de controle apenas com ágar SMS estéril, sem semeadura, em paralelo e plantá-lo no solo junto com o semeado para verificar a vedação. Isso descartaria a possível entrada de micróbios do meio ambiente e atuaria como um controle negativo.

5. Cultivo e recuperação in situ

  1. Crie uma depressão maior que o tamanho do iChip no solo coletado na caixa de poliestireno usando uma pá estéril. Plante o conjunto verticalmente dentro da depressão e embale com terra firmemente, garantindo que todas as superfícies estejam completamente cobertas. Em seguida, permita a cultura in situ pela duração desejada de 2 a 4 semanas. Durante a incubação, use água destilada estéril para umedecer o solo periodicamente para evitar que os tampões de ágar SMS semeados nas câmaras de difusão sequem.
    NOTA: Colocar o conjunto na posição vertical evita a infiltração contínua de água através das câmaras de difusão durante o umedecimento regular do solo, como pode ocorrer se for plantado horizontalmente.
  2. Após a incubação desejada, desaloje suavemente o solo ao redor do iChip plantado para recuperá-lo. Em seguida, lave-o com solução salina estéril para remover as partículas de sujeira aderentes e transfira-o para um gabinete de biossegurança para processamento posterior.
  3. Desaperte as porcas e parafusos do conjunto. Em seguida, desmonte-o com cuidado. Usando uma pinça estéril, remova as membranas de policarbonato e transfira a placa do meio para a placa de Petri preparada.
  4. Use aplicadores de madeira estéreis para recuperar os tampões de ágar individuais dentro de cada câmara de difusão. Inocule os plugues de ágar em meios apropriados, como ágar SMS ou ágar caldo de soja tríptico 0,1x, para tentar o cultivo em laboratório.
    NOTA: Os isolados cultivados podem então ser rastreados para a produção de antimicrobianos por métodos de rotina, como a sobreposição de ágar15.
  5. Alternativamente, core e visualize os plugues de ágar recuperados contendo bactérias do solo recalcitrantes cultivadas in situ para confirmar o crescimento de microcolônias em condições in situ .
    NOTA: Para aumentar a sensibilidade de detecção, o tampão de ágar esmagado também pode ser corado usando corantes fluorescentes que podem corar bactérias, seguidos de microscopia de fluorescência.

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Resultados

O iChip usado neste protocolo foi projetado, impresso em 3D e montado conforme mostrado na Figura 1. A visão geral do protocolo descrito é mostrada na Figura 2. A amostra de solo usada para o experimento foi coletada no campus do IIT Jodhpur em Rajasthan, Índia. O endereço exclusivo de três palavras do local era 'comunicar.supervisionar.recorrência'. O local escolhido foi uma zona semiárida com temperatura de 40 °C no dia da amostragem. A amostra de solo foi col...

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Discussão

Os numerosos habitats únicos na Terra hospedam comunidades microbianas distintas que representam uma enorme diversidade. Isso permanece inexplorado devido a limitações no fornecimento de condições de crescimento adequadas necessárias para seu cultivo. Algumas bactérias dependem dos metabólitos liberados por outras para sua sobrevivência e, portanto, são incapazes de sobreviver de forma independente em condições de laboratório. Além disso, as bactérias também desempenham um papel crucial ...

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Divulgações

Os autores não divulgam conflito de interesses.

Agradecimentos

AV foi apoiado pelo programa de Bolsas de Pesquisa do Primeiro Ministro (PMRF), Govt. da Índia. V.V. foi apoiado pelo programa Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship (INSPIRE) do Departamento de Ciência e Tecnologia, Governo da Índia. A visita de I.B. foi parcialmente financiada por uma bolsa Fulbright APE da USIEF. Os autores agradecem ao Departamento de Biociência e Bioengenharia e ao Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur pelo apoio logístico e pelo fornecimento de infraestrutura para este trabalho. A assistência técnica do Dr. Sudarshna Negi, Sra. Aastha Kapoor, Sr. Tamal Dey, Sr. Bharat Pareek, Sr. Ajeet Singh e outros membros do Laboratório de Fisiologia Microbiana, IIT Jodhpur é gratamente reconhecida.

Coorte de participantes do ADSB-2024

A coorte de participantes do curso de curta duração sobre Descoberta de Antibióticos em Bactérias do Solo (ADSB) 2024, organizado no Departamento de Biociência e Bioengenharia, Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur (Nomes listados em ordem alfabética):

Abinash Kumar Jena, Banishree Jali, Bharat Gurnani, Bharat Pareek, Dipro Mukherjee, Garima Kanwar Shekhawat, GT Vishnu, Jayita Sarkar, Krishna Saharan, Kriti Singhal, Lekh Raj, Mitta Bindusree, Phulen Sarma, Priyanka Kumari, Rachana Dinesh, Satyendra Singh e Swathi Sujith

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Impressora 3DProtolabs, EUA1631-833 Provedor deserviços de impressão 3D
Agarose Himedia, ÍndiaMB002Componente de mídia
Casamino AcidsSisco, Índia68806Componente de mídia
Casein Digest ASES, ÍndiaC5890Componente de mídia
Membrana de policarbonatoSterlitech, EUAPCT00347100Amido
de batataHimedia, ÍndiaGM403Componente de mídia
PowerPointMicrosoft, EUAN / AUsado para a criação de componentes iChip projeto preliminar
PTC CreoPTC, EUAN / AUsado para 3D auxiliado por computador modelagem de componentes iChip
Caldo de soja trípticoHimedia, ÍndiaM011Meio de laboratório
What3WordsWhat3Words, Reino Unido N/AUsado para registrar coordenadas do local de amostragem
consumível

Referências

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