Este método descreve a exploração do sinal endógeno em um modelo de camundongo transgênico ARL13B-CENTRIN-2 para obter imagens de cílios primários in situ, em três dimensões em grandes áreas de tecido mineralizado, desde a coleta de tecido até a análise da organização dos cílios. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos.
Artigo de método
Imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo ARL13B-CENTRIN-2
Neste artigo
Resumo
Resumo
O cílio primário é uma organela solitária e imóvel montada pela maioria dos tipos de células. É essencial para o desenvolvimento e homeostase do esqueleto e na coordenação das respostas celulares a pistas bioquímicas e mecânicas do ambiente circundante. Devido ao seu tamanho em escala micrométrica, o cílio primário é difícil de ser imageado in situ para caracterização em tecidos, de maneira de alto rendimento e sem vieses ópticos. Uma compreensão de sua organização em seu ambiente 3D in vivo será a chave para entender os papéis ciliares na fisiologia e na doença. A linha de camundongos ARL13B-CENTRIN-2 apresenta uma marca mCherry na proteína axonema ciliar ARL13B e uma marca de proteína fluorescente verde (GFP) na proteína centríolo CENTRIN-2, localizada na base do cílio. Essa linha de camundongos permite a aquisição de imagens do cílio primário sem a necessidade de coloração, o que reduz o número de etapas na coleta de imagens e contorna problemas com sinal-ruído. Esta publicação descreve um protocolo passo a passo para obter imagens de cílios primários em tecidos musculoesqueléticos, preservando o sinal fluorescente. Ele também descreve um pipeline de análise de imagem universalmente aplicável, permitindo a quantificação imparcial das características dos cílios, como comprimento e orientação 3D.
Introdução
O cílio primário é uma organela essencial no desenvolvimento e homeostase de muitos tecidos e órgãos, incluindo o esqueleto. Durante o crescimento pós-natal, regula a mineralização da cartilagem durante a ossificação endocondral1. Em humanos, mutações genéticas que afetam proteínas relacionadas aos cílios causam uma série de doenças e distúrbios do desenvolvimento, conhecidos como ciliopatias. Uma compreensão da organização dos cílios primários dentro dos tecidos é importante para entender como eles regulam o comportamento celular no nível do órgão. A incidência, o comprimento e a orientação dos cílios primários demonstraram variar dentro e entre os tecidos, sugerindo um papel da organização do tecido para sua função2 , 3 , 4 . A placa de crescimento, a camada de cartilagem no final dos ossos longos onde ocorre a maior parte do crescimento ósseo pós-natal desde o início da vida até a adolescência, é um tecido altamente organizado com células de condrócitos dispostas em colunas. Na placa de crescimento, os condrócitos passam por estágios de diferenciação, desde o repouso até a proliferação e hipertrófico.
Essa organização celular é perdida em algumas ciliopatias, o que sugere que os cílios primários podem desempenhar um papel na coordenação dessa organização celular e/ou, no mínimo, estar associados à polarização celular. Além disso, a orientação dos cílios primários parece desempenhar um papel em sua função mecanosensorial, com diferenças observadas entre as regiões de suporte de carga e não de suporte de carga na cartilagem articular4. Nossos próprios estudos recentes implicaram papéis diferenciais em diferentes regiões da cartilagem articular e da placa de crescimento 5,6. Estudos anteriores que visualizaram cílios primários na placa de crescimento foram limitados a 2D, que perde informações relacionadas à organização dos cílios no tecido ou são limitados a um pequeno número de células em 3D, o que reduz a escala e o poder da análise 7,8.
Entre os desafios para a imagem do cílio primário estão seu tamanho em escala micrométrica e a inespecificidade dos anticorpos imuno-histoquímicos. O uso de um sinal fluorescente nativo garante forte localização e especificidade. Os sinais fluorescentes nativos podem, no entanto, ser difíceis de visualizar em tecidos mineralizados, pois o longo processo de descalcificação para incorporar tecidos em parafina pode resultar em perda de sinal. O crioseccionamento de amostras congeladas no estado nativo evita essa perda, acelerando o processo de incorporação e seccionamento.
Para obter imagens dos cílios primários in situ, uma linhagem dupla de camundongos transgênicos foi gerada por Bangs et al., que expressa a proteína semelhante ao fator de ribosilação ADP (ARL13B) fundida a mCherry e CENTRIN-2 fundida a GFP9. ARL13B é uma pequena GTPase localizada na membrana primária do cílio, e CENTRIN-2 é uma proteína centríolar localizada nos dois centrossomas na base do cílio10,11. Esta linha de camundongos, portanto, permite que os cílios primários marcados com fluorescência sejam visualizados sem a necessidade de imuno-histoquímica.
O protocolo descrito aqui faz uso desta linhagem transgênica para obter imagens de cílios primários em 3D em placas de crescimento pós-natal murinas com microscopia confocal, exigindo apenas coloração adicional de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Centenas de cílios primários em centenas de células podem ser visualizados e analisados coletivamente em um contexto de tecido. Um pipeline de análise de imagem mede subsequentemente a incidência, comprimento e orientação dos cílios primários nas diferentes regiões da placa de crescimento. O pipeline também é capaz de quantificar essas características para centríolos. Um esboço das etapas do protocolo é apresentado na Figura 1.
Protocolo
A criação de animais e os experimentos foram conduzidos de acordo com as estruturas éticas da Universidade de Oxford e sob uma licença de projeto concedida pelo Ministério do Interior do Reino Unido. Este protocolo foi realizado em camundongos com idades entre 2 e 10 semanas, mas funcionaria na cartilagem de camundongos além dessa idade.
1. Coleta de tecidos
- Eutanasiar camundongos enchendo uma caixa contendo os camundongos com dióxido de carbono até 80% em volume e mantendo sua concentração por 5 min. Realize a luxação cervical.
- Disseque o tecido de interesse.
NOTA: Abaixo está um protocolo para dissecar os joelhos da perna traseira, incluindo as placas de crescimento tibial e femoral e a cartilagem articular.- Incise a pele do pé e corte até o topo da coxa. Remova a pele da linha de incisão com uma pinça.
- Apare o músculo e o tecido adiposo das pernas.
- Para separar a perna do corpo, corte o fêmur na parte superior do quadril. Corte o pé na parte inferior da tíbia.
- Remova qualquer músculo excessivo e tecido adiposo deixado na perna.
2. Fixação e incorporação de tecidos
NOTA: Durante todo o protocolo, tome cuidado para manter o tecido no escuro para evitar a perda de sinal fluorescente.
- Fixe o tecido em formalina a 10% em temperatura ambiente por 4 h.
- Transfira os tecidos para formalina a 2,5% a 4 ° C durante a noite.
- Transfira os tecidos para sacarose a 30% em água destilada (dH2O) e gire suavemente em temperatura ambiente durante a noite ou por 3 dias a 4 ° C. Encha os tubos até o topo para garantir a imersão completa do tecido durante a rotação. Após essa incubação, o tecido afundará no fundo do tubo.
- Coloque uma pequena quantidade de gelo seco em uma caixa separada e posicione o criomold em cima. Trace uma linha de meio super crioincorporador (SCEM) e coloque o membro ao longo dela, com a rótula voltada para baixo e abrindo a tíbia e o fêmur para que a perna fique o mais plana possível. Segure no lugar com uma pinça até que o SCEM comece a solidificar e o membro não se mova mais quando não for pressionado.
- Cubra completamente com SCEM, enchendo o molde até o topo. Coloque a amostra na caixa de gelo seco, mantendo a amostra plana para evitar o movimento do tecido, até que o SCEM solidifique completamente.
- Transferir para -20 °C.
3. Seccionamento
- Remova o bloco do molde e apare para um tamanho que caiba no mandril de um criostato. Prenda o bloco ao mandril aplicando SCEM no mandril e colocando o bloco por cima.
- Deixar solidificar durante pelo menos 5 min a -20 °C no criostato.
- Fixe o mandril ao porta-amostras e uma lâmina ao porta-lâminas.
- Apare o bloco até que a placa de crescimento tibial seja alcançada. Idealmente, corte com a tíbia apontando para cima.
- Corte a fita de filme criogênico em um tamanho que caiba na amostra com espaço suficiente ao redor. Monte o filme criogênico na superfície de corte, garantindo uma adesão firme do filme criogênico com uma ferramenta de encaixe. Corte seções de 40-60 μm de espessura para obter seções de espessura de duas células. Colete a fita usando uma pinça e coloque em uma lâmina, com a amostra voltada para cima, e a placa de crescimento tibial alinhada com a lâmina curta da lâmina.
- Armazene as lâminas de amostra a -20 °C.
4. Preparação e montagem da corrediça
- Descongele o slide horizontalmente à temperatura ambiente.
- Lave a lâmina com uma gota de PBS por 3 x 5 min para remover o SCEM.
- Coloração com 10 μM DAPI por 1 min.
- Lave a lâmina com uma gota de PBS por 2 x 5 min.
- Monte, cubra com uma lamínula e deixe em temperatura ambiente durante a noite. Sele as bordas da lamínula com selante de lamínula.
- Imagem no dia seguinte.
5. Imagem por microscopia confocal
NOTA: A resolução da objetiva de 40x/1.4 no microscópio confocal usado é de 240 nm.
- Configure o microscópio.
- Ligue o microscópio e abra o software. Clique no botão Sistema .
- Na guia Aquisição , clique em Configuração inteligente para configurar os canais. Selecione e adicione os canais GFP, mCherry e DAPI. Selecione a opção Airyscan e a função SR8Y no triângulo Airyscan (entre resolução e multiplex de velocidade 8Y). Clique em Melhor Sinal | OK (Figura Suplementar S1A).
- Na guia Localizar , em Controle do microscópio, selecione a objetiva 40x/1,4 com imersão em óleo.
- Localize a região de interesse.
- Coloque a corrediça no suporte da corrediça e levante a objetiva até que o óleo toque na lamínula.
- Posicione a placa de crescimento ou outra região de interesse abaixo do caminho da luz.
- Na guia Localizar , clique em Fluorescência, selecione DAPI e, usando a ocular, mova o suporte deslizante com o joystick para posicionar a placa de crescimento ou região de interesse sob o campo de visão.
- Na guia Aquisição , comece selecionando apenas o canal DAPI .
- Clique em Contínuo para view a imagem desse canal na tela e certifique-se de que a placa de crescimento esteja em view.
- Abra o visualizador de blocos clicando em Mostrar visualizador na guia Blocos . Adicione o número de peças necessárias (geralmente 1 peça na direção x e 3-5 na direção y) e clique em Visualizar e Iniciar (Figura Suplementar S1B).
- Verifique se os ladrilhos cobrem as três zonas da placa de crescimento - repouso, proliferação e hipertrófica. Ajuste a posição e o número do ladrilho conforme necessário.
- Configure os parâmetros de imagem.
- Clique em Contínuo na guia Aquisição . Na guia Canais , ajuste o Ganho (Mestre) e a potência do Laser para visualizar os núcleos claramente na tela. Permita que o detector Airyscan se alinhe. Abra a janela Airyscan Detector Adjustment clicando no símbolo da roseta lado a lado na parte inferior da janela; uma vez alinhado, todos os ladrilhos ficarão verdes (Figura Suplementar S1C).
- Selecione os canais GFP e mCherry individualmente e repita estas etapas - definindo o Ganho (Mestre), a potência do laser e alinhe o Detector Airyscan.
- Selecione todos os três canais e clique em Contínuo. Permita que o detector Airyscan se alinhe.
- Na guia Modo de aquisição, defina os valores de Tamanho da imagem, Pixel, Tamanho, Tamanho do quadro, Velocidade e Média. Consulte a Figura Suplementar S1D,E para obter os valores das configurações do Modo de Aquisição, Ganho (Mestre) e Potência do Laser para os canais usados.
- Adquira imagens.
- Na guia Aquisição , clique na caixa de seleção Z-Stack .
- Com apenas o canal DAPI selecionado, clique em Contínuo para visualizar a imagem na tela. Mova a objetiva para o plano mais próximo a ser fotografado. Na guia Z-Stack , clique em Definir primeiro plano, concentre-se no último plano a ser visualizado e clique em Definir último plano. Imagem: 30-40 μm z-stacks.
- Defina o intervalo para 0,15 μm.
- Mova para o centro da pilha z. Na guia Blocos , em Regiões de bloco, clique em Verificar e clique em Definir Z e vá para o próximo.
- Na guia Estratégia de foco , verifique se a estratégia de foco está definida como Usar valores Z/superfície de foco definida na configuração de blocos.
- Clique em Iniciar experimento para iniciar a aquisição da imagem.
- Processamento de imagem
- Na guia Processamento, selecione o modo Único ou Lote . Selecione Processamento Airyscan. Marque o processamento 3D e selecione Filtro automático padrão. Selecione a imagem bruta adquirida e inicie o processamento (Figura Suplementar S2A).
- Uma vez concluído o Processamento do Airyscan, seleccione Costura nos métodos de processamento. Selecione Nova saída, Blocos de fusíveis, Sombreamento correto e Tudo por referência, com a referência como DAPI. Selecione a imagem processada pelo Airyscan e inicie o processamento (Figura Suplementar S2B).
- Salve as imagens brutas e duplamente processadas. Este último é salvo automaticamente no modo Lote .
6. Análise de imagem
NOTA: O pipeline de análise usado aqui foi personalizado para os propósitos deste estudo. Os detalhes das operações de pipeline são mostrados na Figura Suplementar S3.
- Importe o arquivo de imagem czi para o software. Abra o painel de análise; no menu suspenso, selecione Novo pipeline...
- Para criar um pipeline de detecção de células, importe o Cellpose Python Segmenter para o pipeline12. Defina Model_Name para cito2, Input_channel para 2, Second_channel para 3, Diameter_in_μm para 10, Flow_threshold para 0,4 e Cellprob_threshold para 0. Adicione um operador Importar Objetos de Documento (renomeado para Importar Rótulos Manuais) antes e um operador Filtro de Feição de Objeto (renomeado para Filtro de Tamanho) após o pipeline clicando em + Adicionar Operação. Consulte a Figura Suplementar S3A para obter os valores das configurações do pipeline.
- Mover o visualizador para o primeiro plano de interesse
- Clique no ícone da ferramenta Desenhar objetos
- Clique no ícone do modo Polígono
- Desenhe a área a ser analisada
- Mover o visualizador para o último plano de interesse
- Área de desenho a ser analisada
- Clique na marca verde Aplicar alterações
- Clique no ícone Mostrar tabela de objetos
- Clique com o botão direito do mouse no objeto criado e selecione Renomear objeto para renomear o objeto para um nome apropriado. Clique com o botão direito do mouse no objeto criado e clique em Adicionar tag. Adicione uma tag chamada Região de análise.
- Execute esse pipeline clicando na seta azul para frente na parte superior do painel Análise .
- Para criar um pipeline de detecção de cílios primários e centríolos, abra o painel de análise, no menu suspenso, selecione Novo pipeline.... Adicione os seguintes operadores ao pipeline: Importar Objetos de Documento (renomeado para Importar Rótulos Manuais), dois operadores de Segmentador de Limite de Intensidade (renomeado para Limite de Cílios e Limite de Centríolo), Divisão (renomeado para Divisão de Centríolo), Filtro de Recurso de Objeto (renomeado para filtro de tamanho de Divisão de Centríolo) e Compartimento (renomeado para Compartimento - Célula). Consulte a Figura Suplementar S3B para obter os valores das configurações do pipeline.
- Execute esse pipeline clicando na seta azul para frente na parte superior do painel Análise.
- Abra a janela Objetos. Clique em Im/Export..., selecione Excel Export.... Selecione os seguintes recursos para salvar: # Filhos, Nome, Nomes dos pais, Limites orientados em 3D Lado curto, Lado médio, Lado longo, Ângulo XY, Ângulo XZ, Ângulo YZ, Caixa delimitadora X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, SizeX, SizeY, SizeZ, Centro da geometria X, Y, Z, Plano primeiro, Último, Contagem, Esfericidade (malha), Volume (Malha), Área de superfície (Malha).
Resultados
A placa de crescimento de camundongos de 6 semanas de idade foi fotografada usando o protocolo descrito e a organização dos cílios primários mapeados no tecido. Uma imagem de todas as três regiões da placa de crescimento - em repouso, proliferativa e hipertrófica - foi capturada e executada no pipeline de análise (Figura 2A). As células individuais podem ser identificadas com a coloração DAPI, com seu axonema ciliar em vermelho e seus centríolos em verde. A resolução usando este método é alta o suficiente para discriminar centríolos individuais (Figura 2B). Nessa resolução, os cílios podem ser visualizados em seu ambiente 3D, apontando em diferentes direções (Vídeo 1).
Imagens de resolução mais baixa, com objetivas de maior ampliação, também podem ser capturadas para visualizar cílios primários em uma região maior de tecido; no entanto, eles não são adequados para análise da orientação dos cílios em 3D. Por exemplo, os cílios primários na cartilagem articular foram fotografados com a objetiva de 20x, demonstrando que o método também funciona em outros tecidos (Figura 2C). Nessa resolução, os axonemas ciliares em vermelho podem ser identificados, mas os centríolos são mais difíceis de discriminar. O osso subcondral tende a apresentar muito sinal de fundo de GFP, dificultando a identificação do centríolo neste tecido.
O pipeline pode detectar células individuais, cílios primários e centríolos, e funciona para placas de crescimento jovens altamente organizadas e placas de crescimento mais velhas, onde as colunas são menos bem definidas, como em camundongos de 10 semanas de idade (Figura 3). Células e cílios são detectados em 3D, como pode ser visto na pilha z.
Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. Fluxograma das diferentes etapas do protocolo, desde a coleta de tecidos até a análise de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cílios primários em tecidos murinos do camundongo ARL13B-CENTRIN-2. (A) Uma placa de crescimento de 6 semanas, com DAPI em branco, CENTRIN-2 em verde e ARL13B em vermelho, fotografada com a objetiva de 40x. (B) Amplie um cílio primário individual e seus dois centríolos. (C) Cartilagem articular e osso subcondral de um camundongo de 4 semanas de idade, fotografado com a objetiva de 20x. (D) Rim de um camundongo de 6 semanas fotografado usando a mesma tubulação do tecido musculoesquelético. (E) Ampliação da caixa branca em D mostrando cílios primários individuais e seus centríolos no rim. Barras de escala = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pipeline de detecção de células e cílios. Exemplo de aplicação do pipeline de análise de imagem em uma placa de crescimento de 10 semanas. (A) Imagem aberta no software. (B) Resultado do pipeline de detecção de células. (C) Resultado da tubulação de detecção de cílios e centríolos. Os cílios são em rosa e os centríolos em verde. A vista lateral exemplifica que a resolução é alta o suficiente para discriminar cílios orientados em diferentes direções em 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Reconstrução tridimensional de uma placa de crescimento de 6 semanas do camundongo ARL13B-CENTRIN-2. A reconstrução tridimensional foi realizada no software Imaris e gravada como um vídeo de animação. Clique aqui para baixar este vídeo.
Figura suplementar S1: Configurações de aquisição de imagem no sistema de microscópio. (A) Janela Smart Setup para adicionar os canais e escolher o modo Airyscan . (B) Visualizador de blocos para selecionar e visualizar os blocos a serem visualizados. (C) Janela de ajuste do detector Airyscan , onde o alinhamento dos detectores Airyscan é confirmado quando todos os ladrilhos ficam verdes. (D) Configurações de laser para os três canais. (E) Modo de aquisição e configurações Z-Stack. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Configurações de processamento de imagem no sistema de microscópio. (A) Configurações de processamento do Airyscan. (B) Configurações de costura. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S3 suplementar: pipelines de análise de imagem personalizados. (A) Pipeline de detecção de células usando os canais GFP e DAPI. (B) Pipeline de detecção de cílios primários e centríolos usando os canais mCherry e GFP, respectivamente. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Nesse protocolo, é essencial prosseguir com as etapas de processamento e incorporação do tecido imediatamente após a coleta. Os blocos e lâminas de tecido, no entanto, podem ser mantidos por pelo menos 3 meses a -20 °C. Várias etapas neste protocolo podem ser modificadas para atender a diferentes aplicações, em particular, espessura da seção, ampliação e parâmetros da pilha z. Isso afetará a profundidade da imagem e a resolução obtida. Mudanças na abertura numérica e no modo de resolução podem ser usadas para obter uma resolução ainda maior e o tamanho do intervalo das pilhas z diminuiu. No entanto, isso aumentaria o tempo de imagem ou reduziria o tamanho do campo de visão que pode ser visualizado. Os parâmetros de imagem descritos são os requisitos mínimos identificados para a análise 3D da orientação dos cílios primários.
A escolha do meio de montagem é importante para obter alta resolução. O índice de refração do meio de montagem deve ser semelhante ao do meio de imersão para minimizar a degradação da imagem na pilha z. O índice de refração do mountant e o óleo de imersão aqui utilizados têm índices de refração de 1,52 e 1,518, respectivamente. A função Airyscan no microscópio confocal usado aqui oferece imagens de super-resolução. Outros microscópios de super-resolução podem ser usados; No entanto, descobrimos que o modo confocal apenas não era suficiente para obter a resolução necessária para o tamanho das áreas fotografadas. A resolução máxima do modo Multiplex SR-8Y Airyscan é de 120/160 nm em x/y e 450 nm em z, e um número máximo de quadros/s de 47,5. Descobrimos que o modo Multiplex SR-4Y Airyscan, que apresenta uma resolução máxima de 140 nm em x/y e 450 nm em z, mas imagens na metade da velocidade com um número máximo de quadros/s de 25, não apresenta uma diferença significativa para a imagem de cílios primários em 3D. Da mesma forma, o modo de super-resolução (SR) Airyscan, que oferece a resolução mais alta neste microscópio - 120 nm em x / y e 350 nm em z - levaria mais tempo para obter a imagem, pois seu número máximo de quadros / s é 4,713.
O sinal de GFP de fundo pode ser observado em outros tecidos, como o músculo. Para minimizar isso, o alcance dos lasers pode ser reduzido para reduzir a sobreposição com outros comprimentos de onda. Essa linha já foi usada para obter imagens de cílios primários no embrião, culturas de células primárias, fibras musculares e epitélio pigmentar da retina 9,14,15. Fizemos imagens com sucesso de cílios primários em rins, cartilagens e tecido ósseo. Alguma otimização das configurações de imagem provavelmente será necessária para diferentes tecidos; no entanto, este protocolo de criossecção deve garantir a preservação do sinal.
Seções grossas de duas células (40-60 μm) são suficientes para obter informações de orientação 3D na placa de crescimento, pois permitem imagens de células inteiras e seus cílios primários. Para outros tecidos onde as células são maiores que os condrócitos, como os adipócitos, seções mais espessas podem ser necessárias para coletar dados da população celular. Dependendo da resolução de profundidade do microscópio usado, pode não ser possível obter imagens profundas em seções mais espessas. As técnicas de limpeza de tecidos provavelmente levariam à perda do sinal endógeno de mCherry e GFP devido ao tempo necessário. Isso foi explorado, pois métodos de limpeza foram usados para outras imagens no membro, mas não foi considerado necessário neste contexto. Nossa experiência com CD31-RFP endógeno sugeriu que as técnicas de limpeza precisariam de uma otimização cuidadosa e personalizada para a amostra.
Esta linha ARL13B-CENTRIN-2 pode ser cruzada com outras linhagens de camundongos para estudar melhor a organização dos cílios primários nos tecidos. Por exemplo, nós o cruzamos com um AGRECAN-Cre IFT88fl / fl para nocautear condicionalmente o IFT88, uma proteína primária dos cílios cuja deleção impede a ciliação, em células que expressam agrecan (condrócitos pós-natais) 5 , 6 . Esses sinais fluorescentes ARL13B e CENTRIN-2 podem então ser usados para medir a eficiência de perturbações genéticas no nível da estrutura ciliar nos tecidos e quaisquer alterações associadas na organização ciliar. O trabalho em andamento está fazendo exatamente isso. Nosso primeiro objetivo será quantificar, com essa metodologia mais robusta, o efeito da deleção de IFT88 na prevalência de cílios. Anteriormente, avaliamos isso usando imunofluorescência e estimamos uma redução de 20%6. Este método também pode ser combinado com imuno-histoquímica para obter imagens de cílios primários em combinação com outras proteínas, por exemplo, uma proteína da membrana celular.
O transgene em ARL13B pode ter um efeito na expressão de ARL13B e no comprimento dos cílios primários. Estudos anteriores mediram diferentes comprimentos de cílios primários com a linha ARL13B-CENTRIN-2 em comparação com ARL13B não transgênico em certas regiões do cérebro de camundongos, sem diferença em outras16. Outro estudo observou diferenças no comprimento dos cílios primários em uma linha de camundongos ARL13B marcada com GFP em comparação com ARL13B não marcado em fibroblastos embrionários de camundongos10. O trabalho em andamento está verificando quaisquer alterações no comprimento dos cílios primários na placa de crescimento e em outros tecidos, comparando os resultados usando a linha de camundongos ARL13B-CENTRIN-2 com coloração de anticorpos contra ARL13B não transgênico.
O pipeline de análise de imagem neste protocolo foi projetado para medir posteriormente a porcentagem de ciliação, comprimento e orientação 3D dos cílios primários, bem como o número de centríolos e a posição na placa de crescimento. O software de análise de imagem permite que pipelines personalizados sejam feitos alterando as etapas envolvidas. A saída deste pipeline é uma planilha com as medidas das características escolhidas para as células, cílios e centríolos detectados. A pós-análise pode então ser realizada em R ou outro software de acordo com os objetivos do estudo. Tal como acontece com as configurações de imagem, as etapas do pipeline e as configurações específicas podem ser alteradas para trabalhar em diferentes imagens e de acordo com os objetivos do estudo. No geral, este método permite uma análise de alto rendimento dos cílios primários do que foi publicado anteriormente na placa de crescimento. O número de células e cílios associados que podem ser estudados permite medições maiores e mais confiáveis.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros da equipe da BSU no Instituto Kennedy de Reumatologia, particularmente Albertino Bonifacio, pela criação de animais. Agradecemos ao Centro de Excelência em Imagens Biomédicas da Oxford-ZEISS pela assistência no uso do microscópio, em particular, ao Dr. Jacky (Ka Long) Ko pela ajuda no desenvolvimento do pipeline de análise de imagens. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de estudos Kennedy Trust of Rheumatology Research (Johnson) e pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC, BB / X007049 / 1).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 22 x 50 mm de lamínulas | fisherscientific | ||
| software arivis Vision4D | Zeiss | N/A | Software de análise de imagem |
| Microscópio confocal de varredura a laser | Zeiss | Zeiss 980 Airyscan 2 | |
| CoverGrip Selante de lamínula | Biotium | 23005 | |
| Cryofilm tipo 3C(16UF) (tipo folha) 2.0 cm de largura | Section-lab | C-FUF303 | Para ser adquirido diretamente da Section-lab |
| Cryostat | Leica CM1900 UV | ||
| DAPI | invitrogen | D1306 | |
| Base Descartável Moldes | epredia | 58952 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | gibco | 14190 | |
| Formalina | Sigma | 20260630 | |
| software Imaris | Oxford Instruments | N/A | Software de análise de imagem para reconstrução 3D |
| Óleo de Imersão 518F | Zeiss | ISO 8036 | |
| Lâminas de micrótomo | Feather | 02.075.00.006 | |
| SlowFade Glass Antifade Mountant | invitrogen | S36917 | |
| Sacarose | Sigma | S9378 | |
| Super Cryoembedding Medium (SCEM) | Section-lab | C-EM001 | Para ser adquirido diretamente da Section-lab |
| Superfrost Plus Microscópio slides | avantor | 631-0108 | |
| Zen software | Zeiss | N/A | Freeware para microscopia de varredura a laser confocal |
Referências
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Reimpressões e permissões
