Artigo de método

Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase da mucosa gástrica para detecção de Helicobacter pylori e resistência a antibióticos

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DOI:

10.3791/67704

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7 de março de 2025

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um método rápido e preciso para detecção de H. pylori e teste de resistência a medicamentos é muito significativo para erradicar eficientemente o H. pylori na prática clínica. Este protocolo tem como objetivo apresentar uma metodologia específica envolvendo a reação em cadeia da polimerase quantitativa da mucosa gástrica (qPCR) para a detecção rápida de H. pylori e resistência a antibióticos.

Resumo

O Helicobacter pylori é um dos principais patógenos que infecta quase metade da população global e está ameaçando a saúde pública devido à sua crescente resistência a antibióticos. Além disso, o Helicobacter pylori também é responsável por gastrite crônica, úlceras gástricas e duodenais, carcinoma gástrico e linfoma de tecido linfóide associado à mucosa gástrica (MALT). Portanto, é essencial realizar um diagnóstico oportuno e preciso do H. pylori e a determinação de sua resistência aos antibióticos. Atualmente, os métodos existentes de diagnóstico de H. pylori incluem principalmente o teste rápido da urease (RUT), o teste respiratório da uréia (UBT), o teste de anticorpos séricos, o teste de antígeno, a gastroscopia e a cultura bacteriana. No entanto, as bactérias não puderam ser cultivadas por meio dos cinco primeiros métodos de detecção, sem mencionar a detecção de resistência a medicamentos. A cultura bacteriana é demorada e os testes de sensibilidade a antibióticos não podem ser realizados de forma rápida e rotineira. Em ambientes clínicos, a identificação rápida e precisa do H. pylori e sua suscetibilidade aos antibióticos é crucial para sua eliminação eficaz. O objetivo deste protocolo é delinear uma abordagem direcionada utilizando reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) em amostras de mucosa gástrica para agilizar o diagnóstico de H. pylori e avaliar sua resistência a agentes antimicrobianos. qPCR foi explorado para detectar o gene ureA para infecção por H. pylori e mutações nos genes 23S rRNA e gyrA associados à resistência à claritromicina e quinolonas, respectivamente. Atualmente, ainda existem desafios na qPCR da mucosa gástrica devido à falta de procedimentos operacionais padrão. Portanto, é essencial compartilhar metodologias com detalhes experimentais para garantir uma comunicação precisa dos procedimentos experimentais, contribuindo para protocolos padrão-ouro que possibilitem maior transparência. No geral, este protocolo oferece uma alternativa econômica e rápida aos métodos convencionais para avaliar a infecção por H. pylori e sua resistência a antibióticos por meio da aplicação da tecnologia quantitativa de reação em cadeia da polimerase (qPCR).

Introdução

H. pylori é uma bactéria gram-negativa que pode sobreviver na presença de um baixo nível de oxigênio. O organismo pertence a várias populações genéticas distintas e apresenta alta diversidade genética. Embora o organismo seja geralmente em forma de espiral, ele pode ser alterado para uma haste1. É um patógeno principal que infecta cerca de 50% da população mundial2. Principalmente, a infecção ocorre quando os pacientes permanecem portadores saudáveis durante a infância, e os sintomas se manifestam mais tarde na idade adulta. Foi relatado que é relativo a gastrite crônica, úlceras gástricas e duodenais, carcinoma gástrico e linfoma de tecido linfóide associado à mucosa gástrica (MALT)3. As diferenças nas manifestações da infecção por H. pylori podem resultar dos elementos de patogenicidade de cepas bacterianas distintas, bem como dos atributos do hospedeiro e seus padrões alimentares4. A pesquisa indica que homens que fumam e consomem álcool correm maior risco de contrairinfecções por H. pylori. A eficácia da eliminação do H. pylori na prevenção do câncer de estômago e lesões pré-cancerosas tem sido verificada em vários estudos 6,7. Portanto, a erradicação do H. pylori foi aconselhada como medida preventiva pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer da Organização Mundial da Saúde (OMS)8.

O diagnóstico rápido e preciso da infecção por H. pylori é uma parte crítica do tratamento para a maioria dos indivíduos que sofrem de dispepsia assintomática. O diagnóstico de H. pylori envolve uma combinação de abordagens invasivas e não invasivas. As técnicas invasivas geralmente abrangem endoscopia para visualização direta, análise histológica de amostras de tecido, teste rápido de urease (RUT) para detectar atividade bacteriana e cultura da bactéria. Por outro lado, as estratégias não invasivas compreendem o teste respiratório da ureia (UBT), que mede o metabolismo bacteriano; o teste de antígeno fecal (SAT), que detecta proteínas bacterianas nas fezes; testes sorológicos que procuram anticorpos no sangue; e diagnósticos moleculares que usam material genético para detecção. Embora cada um desses métodos diagnósticos venha com seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens, no campo da prática clínica, não existe um método único que seja universalmente reconhecido como a referência definitiva9.

Atualmente, o tratamento primário para infecções por H. pylori são os antibióticos. No entanto, as taxas de sucesso das terapias antimicrobianas destinadas a erradicar o H. pylori têm diminuído, atribuível a vários fatores. Suspeita-se que as causas predominantes de ineficácia do tratamento sejam a resistência da bactéria aos agentes antimicrobianos e a adesão dos pacientes ao esquema prescrito10. Especificamente, cepas de H. pylori resistentes à claritromicina têm sido objeto de extensa pesquisa11. A incidência de tal resistência está aumentando em várias nações. A resistência ao H. pylori se deve principalmente a mutações no gene da região variável do rRNA 23S, que causa alterações conformacionais no ribossomo. Consequentemente, o sítio de ligação da claritromicina muda, levando a uma afinidade enfraquecida entre H. pylori e claritromicina, impedindo a inibição da síntese proteica bacteriana12. Mutações nas posições A2143G, A2142G e A2142C dentro do segmento de 2,9 kb do gene 23S rRNA são conhecidas por conferir resistência à claritromicina. A disseminação da resistência às fluoroquinolonas também tem sido foco de inúmeras investigações. Estudos documentaram taxas de resistência à levofloxacina em 34,5% na China e 22,1% na Itália13. As drogas quinolonas atuam principalmente na topoisomerase II de H. pylori inibindo a atividade enzimática, afetando a síntese e replicação do DNA e a estrutura secundária, alcançando assim fins antibacterianos. Se ocorrerem mutações nos genes que codificam as subunidades da topoisomerase, gyrA e gyrB, isso impedirá a ligação de antibióticos como a levofloxacina e a enzima, resultando na incapacidade de inibir a replicação do genoma do H. pylori , causando resistência. Dentre estes, os hotspots de mutações no gene gyrA concentram-se nos aminoácidos 87 e 91, enquanto as mutações no gene gyrB ocorrem com menor frequência e são frequentemente acompanhadas por mutações no gyrA14. Os loci de mutação do gene de resistência à levofloxacina incluem principalmente os seis locais de mutação (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) localizados no gene girA. A identificação de mecanismos de resistência decorrentes de alterações genéticas levou a uma transição progressiva na detecção de H. pylori, afastando-se dos métodos baseados em cultura para técnicas de diagnóstico molecular.

UBT e SAT são os testes não invasivos mais comumente escolhidos, mas não podem fornecer informações sobre suscetibilidade a medicamentos. Consequentemente, o desenvolvimento de uma técnica rápida e abrangente para detectar o H. pylori e avaliar sua resistência aos medicamentos é crucial para sua eliminação efetiva em ambientes clínicos15. Entre as técnicas de detecção molecular, a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) teve avanços significativos. Ao contrário da PCR padrão, a qPCR elimina a necessidade de eletroforese em gel e permite a quantificação precisa de DNA ou RNA, incorporando primers e sondas específicos durante a fase de recozimento. Os kits de qPCR disponíveis comercialmente agora oferecem a capacidade de identificar infecções por H. pylori e resistência a medicamentos16.

Basicamente, há uma necessidade clínica imediata de uma abordagem diagnóstica que seja potente e abrangente, capaz de detectar infecções por H. pylori e avaliar a resistência aos medicamentos concomitantemente. Adotamos a análise de qPCR da mucosa gástrica para detecção de H. pylori e resistência a antibióticos usando diferentes sondas de primer.

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Protocolo

O estudo existente foi conduzido em conformidade com as considerações éticas estabelecidas pelo comitê de ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Universidade Médica do Sul, Guangzhou, China (Número de aprovação: KY2024-1115-01). Pacientes com idade entre 18 e 60 anos foram incluídos neste estudo. Para este estudo, os participantes foram excluídos se tivessem tomado recentemente antibióticos, remédios fitoterápicos antibacterianos, inibidores da bomba de prótons (IBPs) ou antagonistas do receptor H2 nas 2 semanas anteriores ao teste. Além disso, indivíduos que foram submetidos à terapia anti-H. pylori nos últimos 3 meses, ou aqueles com problemas cardíacos, hepáticos ou renais significativos, neuropatia grave ou distúrbios psiquiátricos não foram elegíveis para participação. Foram excluídos aqueles com contraindicações para o exame gastroscópico, como perfuração gastrointestinal, idade avançada, sinais vitais instáveis, etc. O estudo também não incluiu mulheres grávidas ou amamentando. O termo de consentimento livre e esclarecido dos sujeitos inclui principalmente os seguintes conteúdos: (1) antecedentes e objetivos da pesquisa; (2) Quem não está apto a participar neste projeto de investigação? (3) Quais são os requisitos para participar da pesquisa? (4) Possíveis benefícios da participação em pesquisas; (5) Possíveis reações adversas, riscos e desconforto; (6) Proteção da privacidade; (7) Direitos do sujeito; (8) Declaração do sujeito; (9) Declaração do pesquisador, etc.

1. Amostragem da mucosa gástrica

  1. Preparação dos consumíveis de amostragem
    1. Preparar o tubo de recolha contendo a solução de armazenagem.
    2. Prepare uma pinça de biópsia de gastroscópio.
  2. Preparação dos objectos de amostragem
    1. Colete amostras de pacientes com gastrite crônica, úlcera gástrica, úlcera duodenal, câncer gástrico ou pacientes suspeitos. Coletar amostras mantendo os procedimentos assépticos.
      NOTA: As amostras coletadas incluíram tecido da mucosa gástrica de pacientes ou pacientes suspeitos.
    2. Confirme o histórico de medicamentos.
      1. Certifique-se de que nenhum antibiótico e bismuto para H. pylori seja tomado pelo paciente dentro de 4 semanas e que nenhum inibidor de ácido seja tomado dentro de 2 semanas.
      2. Solicite aos pacientes que tomam medicamentos anticoagulantes (varfarina, aspirina, clopidogrel, etc.) que parem de tomar medicamentos por 5-7 dias.
  3. Coleta de espécimes
    1. Local de amostragem
      1. De acordo com os requisitos do novo sistema de Sydney, colete amostras de biópsia do antro gástrico, da curva grande e pequena do corpo gástrico e do canto gástrico (um total de 5 pontos). Os locais específicos são mostrados na Figura 1. Uma pequena curva do seio pilórico a 2-3 cm do anel pilórico (A1) e uma grande curva (A2); 4 cm do estômago (B1) e uma grande curva a 8 cm da cárdia (B2); canto gástrico (AI).
      2. De acordo com o Consenso de Especialistas sobre a Padronização da Biópsia Endoscópica Digestiva e Exame Patológico na China (Rascunho), colete amostras de biópsia do lado pequeno do seio gástrico a 5 cm do piloro (adjacente ao canto gástrico) ou do lado grande do canto gástrico (biópsia 1-2 peças).
    2. Descrição do local de colheita de amostras especiais
      1. Para pacientes em qualquer tratamento, após uma retirada por 4 semanas, colete amostras do antro gástrico e do corpo gástrico simultaneamente.
      2. Para pacientes com câncer gástrico, colete tecido da grande curvatura do estômago, mas não do tecido tumoral.
      3. Para pacientes com úlceras gástricas, colete o antro gástrico e o tecido da borda da úlcera gástrica. Não recolha o fundo da úlcera.
      4. Para pacientes com gastrite atrófica, colete o antro gástrico e o corpo gástrico. Não colete amostras de áreas de atrofia da mucosa gástrica e metaplasia intestinal.
    3. Etapas de amostragem
      1. Abra a válvula de pinça de biópsia e mova-a lentamente para a mão dominante. Quando a cabeça da pinça estiver no campo de visão, abra a aba da pinça e manipule o endoscópio na mucosa gástrica do local de amostragem.
      2. Aplique uma leve pressão, feche a pinça de biópsia e clampeie o tecido da mucosa gástrica (diâmetro: 0,5-1 mm, cerca de 5-10 mg / bloco). Extrair as amostras de tecido com o alicate no tubo de recolha (incluindo o líquido de preservação) para completar o local.
      3. Continuar a completar a amostragem de outros locais e colocá-los no mesmo tubo de recolha (incluindo a solução de preservação).
      4. Complete a amostragem de todos os locais, aperte a tampa do tubo de amostragem e sele para evitar a secagem. Rotule os tubos com um número de identificação exclusivo na parte externa.
      5. Envie as amostras coletadas para teste o mais rápido possível. Não coloque as amostras à temperatura ambiente (RT) por mais de 24 h. Evite o congelamento e descongelamento repetidos de amostras clínicas durante o transporte de longa distância. Se não for possível garantir uma temperatura de -20 ± 5 °C, transporte-os a 0-8 °C. Armazenar as amostras durante um período de cinco meses a -20 ± 5 °C e, para armazenamento a longo prazo, mantê-las abaixo de -70 °C.
    4. Precauções
      1. Ao amostrar, pressione a pinça de biópsia o mais fundo possível para alcançar toda a camada da mucosa.
      2. Ao remover a pinça de biópsia e abrir a biópsia, seja gentil para evitar rupturas da mucosa.

2. Extração de ácido nucleico

  1. Ajuste a temperatura do banho de metal para 100 °C com antecedência; se a amostra estiver congelada, remova-a e restre-a à RT.
  2. Misture bem o lisado para suspender a resina de ácido iminodiacético. Leve 100 μL de lisado para o tubo centrífugo com o elemento filtrante ou adicione diretamente o tecido da mucosa gástrica ao tubo centrífugo com 200 μL de lisado e misture com a oscilação do vórtice.
  3. Coloque o tubo de centrífuga em um banho de metal a 100 ° C por 10 min, remova e resfrie até RT.
  4. Centrifugue a 9500 g por 5-10 min. Puxe cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo de centrífuga esterilizado e marque-o.
  5. Realize imediatamente o seguinte experimento ou armazene-o temporariamente a 4 ° C para inspeção.

3. Detecção por qPCR de H. pylori e genes de resistência a medicamentos (claritromicina e quinolonas)

  1. Remova a sonda de primer, a solução enzimática misturada e o tampão de detecção do kit. Derreta todos os componentes no gelo ou 2-8 °C e misture-os com leve agitação e centrifugação instantânea em baixa velocidade.
  2. Misture 12,5 μL de tampão de detecção + 7,0 μL de sonda de primer + 0,5 μL de solução enzimática. Calcule a quantidade de cada reagente primeiro, adicione ao tubo de centrífuga de volume apropriado, misture bem e centrifugue brevemente.
    NOTA: A quantidade total da solução de reação PCR deve ser calculada incluindo o número de amostras de teste, um controle positivo forte, um controle positivo fraco, um controle negativo e um controle negativo de PCR.
  3. Depois que a solução de reação de PCR estiver configurada, adicione 20,0 μL da solução de reação de PCR a cada poço de reação de PCR. Em seguida, adicione 5,0 μL de ácido nucleico à reação de PCR com a solução de reação de PCR. Não adicionar nenhuma amostra ou ácido nucleico ao poço de controle negativo da PCR.
  4. Coloque o tubo de reação no termociclador PCR fluorescente e defina os parâmetros do ciclo da seguinte forma: primeiro, aqueça a mistura de reação a 42 °C e 95 °C por 2 min; segundo, desnaturar por 10 s a 95 °C, recozer e estender por 45 s a 58 °C, repetir por 40 ciclos.
  5. Colete os sinais de fluorescência como FAM (mutação do gene 23S rRNA), HEX/VIC (mutação do gene gyrA ), ROX (H. pylori) e CY5 (padrão interno) e dados a 58 °C.
  6. Após a reação, salve os dados e analise-os usando um software específico de qPCR.

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Resultados

Avaliação da infecção por H. pylori e resistência a antibióticos no tecido gástrico via qPCR
Os ensaios de qPCR para identificar H. pylori foram conduzidos visando o gene ureA , e a resistência a antibióticos foi verificada examinando mutações específicas nos genes 23S rRNA e gyrA (Tabela 1). Os dados de garantia de qualidade, representados pelos valores de CT nos três grupos, ficaram dentro dos limites aceitáveis, ...

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Discussão

Testes tradicionais, como RUT, UBT, histologia, cultura e sorologia, são explorados para a detecção de H. pylori. Cada abordagem diagnóstica oferece vantagens distintas e enfrenta desafios específicos dependendo do contexto clínico17. O cultivo de H. pylori a partir de biópsias da mucosa gástrica é frequentemente considerado a referência para o diagnóstico. No entanto, esse método é trabalhoso e sua precisão é limitada por desafios técnicos, as c...

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Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do Programa de Incubação NSFC do GDPH (8220080645) e do Projeto do Fundo de Pesquisa em Ciência e Tecnologia Médica da Província de Guangdong (A2024108).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora de BanhoALLSHENGMK2000-2Fornecer um ambiente de temperatura constante
Gabinete de biossegurançaHaierHR1500-figure-materials-1B2
CentrífugaThermo Fisher ScientificTHERMO ST16RCentrifugue o líquido residual da parede do tubo.
Chelex-100 Pinça de biópsia deresinaC7901
Boston Scientific CorporationAmostragem da mucosa gástrica
Helicobacter pylori 23S rRNA gene e gyrA kit de detecção de mutação do geneJiangsu Mole BioscienceCFDA 20223400137kit de detecção de qPCR para H. pylori e genes de resistência a medicamentos (claritromicina e quinolonas)
Reagente de extração de ácido nucleicoJiangsu Mole BioscienceSEDA 20150076Para extração
de DNA Software SDSApplied Biosystems7300/7500Análise de dados
ThermocylcerThermo Fisher ScientificABI 7500Para detecção de qPCR de H. pylori e genes de resistência a medicamentos (claritromicina e quinolonas)
Misturador de vórticeJOANLABVM-5005Para reagente de mistura
gastroscópio de sigma

Referências

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