Um método rápido e preciso para detecção de H. pylori e teste de resistência a medicamentos é muito significativo para erradicar eficientemente o H. pylori na prática clínica. Este protocolo tem como objetivo apresentar uma metodologia específica envolvendo a reação em cadeia da polimerase quantitativa da mucosa gástrica (qPCR) para a detecção rápida de H. pylori e resistência a antibióticos.
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Artigo de método
Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase da mucosa gástrica para detecção de Helicobacter pylori e resistência a antibióticos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O Helicobacter pylori é um dos principais patógenos que infecta quase metade da população global e está ameaçando a saúde pública devido à sua crescente resistência a antibióticos. Além disso, o Helicobacter pylori também é responsável por gastrite crônica, úlceras gástricas e duodenais, carcinoma gástrico e linfoma de tecido linfóide associado à mucosa gástrica (MALT). Portanto, é essencial realizar um diagnóstico oportuno e preciso do H. pylori e a determinação de sua resistência aos antibióticos. Atualmente, os métodos existentes de diagnóstico de H. pylori incluem principalmente o teste rápido da urease (RUT), o teste respiratório da uréia (UBT), o teste de anticorpos séricos, o teste de antígeno, a gastroscopia e a cultura bacteriana. No entanto, as bactérias não puderam ser cultivadas por meio dos cinco primeiros métodos de detecção, sem mencionar a detecção de resistência a medicamentos. A cultura bacteriana é demorada e os testes de sensibilidade a antibióticos não podem ser realizados de forma rápida e rotineira. Em ambientes clínicos, a identificação rápida e precisa do H. pylori e sua suscetibilidade aos antibióticos é crucial para sua eliminação eficaz. O objetivo deste protocolo é delinear uma abordagem direcionada utilizando reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) em amostras de mucosa gástrica para agilizar o diagnóstico de H. pylori e avaliar sua resistência a agentes antimicrobianos. qPCR foi explorado para detectar o gene ureA para infecção por H. pylori e mutações nos genes 23S rRNA e gyrA associados à resistência à claritromicina e quinolonas, respectivamente. Atualmente, ainda existem desafios na qPCR da mucosa gástrica devido à falta de procedimentos operacionais padrão. Portanto, é essencial compartilhar metodologias com detalhes experimentais para garantir uma comunicação precisa dos procedimentos experimentais, contribuindo para protocolos padrão-ouro que possibilitem maior transparência. No geral, este protocolo oferece uma alternativa econômica e rápida aos métodos convencionais para avaliar a infecção por H. pylori e sua resistência a antibióticos por meio da aplicação da tecnologia quantitativa de reação em cadeia da polimerase (qPCR).
Introdução
H. pylori é uma bactéria gram-negativa que pode sobreviver na presença de um baixo nível de oxigênio. O organismo pertence a várias populações genéticas distintas e apresenta alta diversidade genética. Embora o organismo seja geralmente em forma de espiral, ele pode ser alterado para uma haste1. É um patógeno principal que infecta cerca de 50% da população mundial2. Principalmente, a infecção ocorre quando os pacientes permanecem portadores saudáveis durante a infância, e os sintomas se manifestam mais tarde na idade adulta. Foi relatado que é relativo a gastrite crônica, úlcera....
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Protocolo
O estudo existente foi conduzido em conformidade com as considerações éticas estabelecidas pelo comitê de ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Universidade Médica do Sul, Guangzhou, China (Número de aprovação: KY2024-1115-01). Pacientes com idade entre 18 e 60 anos foram incluídos neste estudo. Para este estudo, os participantes foram excluídos se tivessem tomado recentemente antibióticos, remédios fitoterápicos antibacterianos, inibidores da bomba de prótons (IBPs) ou antagonistas do receptor H2 nas 2 semanas anteriores ao teste. Além disso, indivíduos que foram submetidos à terapia anti-H. pylori ....
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Resultados
Avaliação da infecção por H. pylori e resistência a antibióticos no tecido gástrico via qPCR
Os ensaios de qPCR para identificar H. pylori foram conduzidos visando o gene ureA , e a resistência a antibióticos foi verificada examinando mutações específicas nos genes 23S rRNA e gyrA (Tabela 1). Os dados de garantia de qualidade, representados pelos valores de CT nos três grupos, ficaram dentro dos limites aceitáveis, .......
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Discussão
Testes tradicionais, como RUT, UBT, histologia, cultura e sorologia, são explorados para a detecção de H. pylori. Cada abordagem diagnóstica oferece vantagens distintas e enfrenta desafios específicos dependendo do contexto clínico17. O cultivo de H. pylori a partir de biópsias da mucosa gástrica é frequentemente considerado a referência para o diagnóstico. No entanto, esse método é trabalhoso e sua precisão é limitada por desafios técnicos, as c.......
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Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por doações do Programa de Incubação NSFC do GDPH (8220080645) e do Projeto do Fundo de Pesquisa em Ciência e Tecnologia Médica da Província de Guangdong (A2024108).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Incubadora de Banho | ALLSHENG | MK2000-2 | Fornecer um ambiente de temperatura constante |
| Gabinete de biossegurança | Haier | HR1500- B2 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | THERMO ST16R | Centrifugue o líquido residual da parede do tubo. |
| Chelex-100 | Pinça de biópsia de | resina | C7901 |
| Boston Scientific Corporation | Amostragem da mucosa gástrica | ||
| Helicobacter pylori 23S rRNA gene e gyrA kit de detecção de mutação do gene | Jiangsu Mole Bioscience | CFDA 20223400137 | kit de detecção de qPCR para H. pylori e genes de resistência a medicamentos (claritromicina e quinolonas) |
| Reagente de extração de ácido nucleico | Jiangsu Mole Bioscience | SEDA 20150076 | Para extração |
| de DNA Software SDS | Applied Biosystems | 7300/7500 | Análise de dados |
| Thermocylcer | Thermo Fisher Scientific | ABI 7500 | Para detecção de qPCR de H. pylori e genes de resistência a medicamentos (claritromicina e quinolonas) |
| Misturador de vórtice | JOANLAB | VM-5005 | Para reagente de mistura |
Referências
- Sharndama, H. C., Mba, I. E. Helicobacter pylori: an up-to-date overview on the virulence and pathogenesis mechanisms. Braz J Microbiol. 53 (1), 33-50 (2022).
- Ravikumara, M. Helicobacter pylori in children: think before you kill the bug. T....
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Reimpressões e permissões
