Quantificação do comportamento de aliciamento de Drosophila melanogaster para avaliação de fenótipos de aliciamento excessivo

Summary

O método aqui apresentado envolve a anotação manual de imagens adquiridas de Drosophila melanogaster para comportamentos específicos de higiene. Ele permite a quantificação do número de sessões de aliciamento e do tempo total gasto no aliciamento para avaliar fenótipos atípicos de autoaliciamento.

Abstract

Mudanças observáveis na preparação estereotipada são aplicadas translacionalmente em organismos modelo. Essas mudanças são representativas de patologias que provocam desvios semelhantes no comportamento humano; por exemplo, o aliciamento excessivo atua como um proxy para comportamentos obsessivos e compulsivos presentes em condições como a Síndrome de Tourette ou transtorno obsessivo-compulsivo. O ensaio de aliciamento apresentado permite a avaliação de fenótipos anormais de autoaliciamento em Drosophila melanogaster. As moscas são registradas por um período de 10 min, e essas gravações são observadas e anotadas às cegas para comportamentos de higiene previamente definidos. Medidas quantitativas da frequência da luta de aliciamento e do tempo gasto em auto-aliciamento podem ser obtidas anotando manualmente a filmagem. O ensaio é relativamente barato, requer poucos materiais ainda não disponíveis em ambientes de laboratório e é facilmente adaptável para atender às necessidades específicas de qualquer estudo com o objetivo de observar a preparação. Além disso, o baixo nível de habilidade necessário para realizar o ensaio, em comparação com métodos automatizados pesados em ciência da computação, torna o protocolo adequado para pequenos laboratórios e alunos. Discutimos em detalhes as etapas necessárias para realizar este ensaio e suas limitações atuais.

Introduction

Drosophila melanogaster é um organismo modelo bem estabelecido em estudos comportamentais e neurobiológicos, fornecendo informações sobre os mecanismos que impulsionam comportamentos humanos análogos. O autocuidado nesse organismo é um comportamento altamente regulado e bem definido, seguindo padrões estereotipados que são facilmente distinguidos uns dos outros¹. Os comportamentos de higiene separados exibidos pela mosca geralmente podem ser classificados pela região anatômica², sendo mais facilmente definidos como posterior ou anterior. A preparação da Drosophila se concentrará inicialmente na região anterior e, posteriormente, fará a transição para a extremidade posterior³. Em condições típicas, as moscas exibem comportamentos de higiene para manter a limpeza (por exemplo, removendo a poeira) e ocorrem em resposta à exposição a estímulos externos potencialmente prejudiciais, como micróbios patogênicos⁴.

Anormalidades no comportamento de aliciamento, especificamente o aliciamento obsessivo espontâneo, têm sido usadas em vários sistemas modelo como um indicador de comportamento obsessivo e / ou compulsivo. Descobertas translacionais que observam comportamentos obsessivos de higiene em organismos como roedores, pássaros e caninos forneceram informações sobre condições que provocam comportamento compulsivo semelhante em humanos⁵. Isso inclui condições como tricotilomania, transtorno obsessivo-compulsivo e síndrome de Tourette⁶. O comportamento excessivo de aliciamento também tem sido usado como referência na avaliação de fenótipos comportamentais em modelos de condições semelhantes de neurodesenvolvimento em Drosophila melanogaster. Comportamentos obsessivos de aliciamento foram observados em modelos de moscas da Síndrome do X Frágil (FSX) e transtorno do espectro do autismo (TEA) associado. O excesso de aliciamento espontâneo ocorre sob mutações de dfmr1, o ortólogo do gene FMR1 7 associado ao TEA e FSX^. Além disso, há uma mudança notável na distribuição de limpeza entre as extremidades posterior e anterior nesses mutantes⁸. Essas mudanças são interpretadas como reflexo de comportamentos obsessivos e compulsivos focados no corpo exibidos por alguns pacientes com essas condições. Ao usar o ensaio de limpeza descrito aqui, observamos comportamentos de limpeza em moscas após um knockdown mediado por RNAi do gene Atg8a de Drosophila produzido por drivers GAL4 disponíveis comercialmente e linhas⁹ de UAS-RNAi.

Este método envolve a anotação manual de imagens tiradas de moscas para comportamentos específicos de higiene. Estudos anteriores com o objetivo de avaliar o comportamento de higiene, como aqueles que usam métodos indiretos como corantes, embora eficazes na quantificação da eficácia da higiene, não permitem medir a duração ou a frequência da higiene10. Este ensaio, no entanto, permite quantificar a frequência e a duração da preparação de Drosophila, tanto em geral quanto por região anatômica. O método aqui detalhado apresenta algumas vantagens sobre os métodos automatizados atuais, pois é facilmente modificado e pode ser conduzido por indivíduos sem formação computacional. Com o equipamento necessário facilmente disponível na maioria dos laboratórios, apresentamos uma maneira econômica de avaliar a presença de um fenótipo excessivo de auto-limpeza (ver Tabela de Materiais). Isso torna o método prontamente acessível principalmente a instituições de graduação e facilmente adaptável a ambientes de treinamento ou laboratórios de ensino.

Protocol

NOTA: Uma visão geral do protocolo é apresentada na Figura 1.

1. Preparação para as filmagens

1. Coloque quatro pratos de três poços lado a lado em uma superfície branca, cobrindo cada um com uma lâmina de vidro.
2. Posicione uma câmera (aqui, um sistema Raspberry Pi, mas qualquer câmera capaz de vídeo de alta definição é suficiente) acima dos pratos.
   1. Verifique se todos os pratos estão enquadrados e focados.
   2. Verifique se não há brilho nas lâminas que limitem a visibilidade das moscas no prato. Elimine o brilho ajustando a posição da placa ou diminuindo as luzes no espaço de gravação.
   3. Use alta resolução (mínimo de 1920 x 1080 pixels) para visualizar com precisão os membros das moscas.
3. Marque a posição da loiça e da câmara na bancada onde a gravação está a decorrer.
   NOTA: Isso limitará o tempo gasto na etapa 2 no uso futuro do aparelho. Realizar os ensaios ao mesmo tempo e no mesmo espaço limitará a variabilidade no comportamento com base em fatores além das manipulações pretendidas.
4. Anestesifique levemente as moscas de 4 a 9 dias de idade com frio em um bloco de gelo coberto com parafilme e uma toalha de papel (a anestesia com CO₂ terá um impacto significativo no comportamento).
   1. Bata as moscas no bloco e, uma vez anestesiadas, mova-as para as câmaras de observação o mais rápido possível usando um pincel.
      NOTA: Essa transferência deve acontecer o mais rápido possível, pois a exposição excessiva a anestesia de qualquer tipo pode afetar negativamente as moscas.
5. Coloque uma única mosca em cada poço.
6. Permita que os arquivos se aclimatem ao novo ambiente por 30 minutos após a anestesia. Não toque ou perturbe os poços que contêm moscas após este ponto, pois estressores adicionais afetarão o comportamento.

2. Registrando as moscas

1. Após a aclimatação de 30 minutos, registre as moscas usando uma câmera.
2. Use uma câmera Raspberry Pi executada no PiSpy¹¹ para coleta de dados comportamentais.
   NOTA: O software é gratuito e está disponível no GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), e um sistema Pi pode ser facilmente configurado por menos de US $ 300. Outras câmeras, se já disponíveis, também são suficientes para gravar imagens
3. Inicie uma gravação com Pi com o seguinte fluxo de comando.
   1. Abra o terminal e digite cd PiSpy. Em seguida, digite python3 PiSpy.py, insira a duração de gravação desejada e insira a taxa de quadros desejada. Selecione a resolução desejada e clique em Captura rápida.
   2. Use a função Preview Camera para garantir que as moscas estejam focadas e suficientemente visíveis.
4. Grave as moscas por 10 minutos a uma taxa de quadros recomendada de 24 fps e salve o arquivo (o PiSpy salva automaticamente na pasta de vídeos).

3. Análise de vídeo (Figura 2)

1. Para analisar o vídeo, importe o arquivo para o software Elan 6.8¹².
   NOTA: Este software, embora originalmente desenvolvido para sebos psicolinguísticos, permite anotações detalhadas de vídeos e análise aprofundada dos comportamentos de higiene
2. Atribua cada linha, conforme ilustrado abaixo, para anotar a filmagem de indivíduos manualmente.
   1. Faça isso com o seguinte fluxo de comando: Camada > Adicionar Nova Camada > Digite Local no prato em Nome da Camada > Adicionar.
3. Dependendo das necessidades de um estudo, observe e quantifique vários comportamentos específicos (higiene anterior e posterior, caminhada, sono e ficar em pé).
   1. Faça anotações seguindo as etapas abaixo.
      1. Clique duas vezes na camada a ser anotada. Clique com o botão direito do mouse e arraste o cursor ao longo da camada selecionada por um período em que uma única sessão de limpeza é exibida. Clique com o botão esquerdo, selecione Nova anotação e clique duas vezes no período de tempo recém-destacado. Digite a abreviação do comportamento exibido naquele momento.
   2. Observe os vídeos lentamente, percorra-os com um mouse e faça anotações. Amplie um único poço de mosca durante a anotação para evitar a falsa identificação de comportamentos. Isso pode incluir bater na borda do vidro pela mosca ou deslocar as pernas, o que inicialmente pode parecer uma higiene.
4. Depois que o vídeo estiver completamente anotado, obtenha um detalhamento de cada comportamento. Certifique-se de que a mesma abreviação ou anotação seja usada em todos os vídeos para usar esse recurso.
   NOTA: O Elan 6.8 fornecerá o número de vezes que um comportamento ocorre, a duração total dos comportamentos e o tempo médio gasto em cada comportamento.
   1. Defina as sessões de preparação como 2 s de preparação ininterrupta. Identifique cada comportamento observado da seguinte maneira. Defina os parâmetros para as regiões anatômicas antes da realização do ensaio.
      1. Preparação anterior: Identifique a preparação realizada na região anterior do corpo da mosca como preparação anterior.
         NOTA: Esse comportamento quase sempre envolve um movimento de fricção em uma parte anterior, como a cabeça ou a tromba, com as duas patas dianteiras da mosca.
      2. Preparação posterior: Identifique a preparação realizada na extremidade ântero-posterior do corpo da mosca como preparação posterior.
         NOTA: Além disso, as asas foram incluídas na região posterior para simplificar. Esse comportamento quase sempre envolve um movimento de fricção com o conjunto central e posterior de pernas em tempo real. Um bom indicador de que a limpeza posterior está ocorrendo será que, à primeira vista, a mosca pode parecer que está faltando suas pernas mais posteriores, conforme ilustrado na Figura 2D.

Results

Este ensaio produz dados quantitativos que medem o tempo e a frequência dos comportamentos de higiene a partir de imagens anotadas. Uma imagem representativa da configuração e como os comportamentos são definidos é descrita na Figura 2. Dada a subjetividade introduzida pela análise de vídeo, todas as anotações de vídeos devem ser cegas para o pesquisador que realiza a análise.

Este método foi usado para avaliar o papel que o gene Atg8a da Drosophila <...

Discussion

No geral, este ensaio facilmente executável e econômico permite uma caracterização robusta do comportamento de limpeza de Drosophila melanogaster . Essa técnica fornece informações sobre a frequência, o tempo gasto e a distribuição anatômica de um grande número de comportamentos de higiene previamente identificados. Um bom indicador de que a preparação ocorrerá ou está em andamento são as mudanças no posicionamento das pernas, especificamente levantando qualquer uma das 6 pernas...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cartão Micro SD de 16 GB	Adafruit	1294	Para uso na introdução do sistema operacional
Display	Adafruit	3578	Qualquer monitor que possa ser conectado por HDMI ou cabo flexível é suficiente
Drosophila Atg8a-RNAi Linha UAS	Bloomington Stock Center	34340	Linha usada em dados representativos
Drosophila Ok6 Driver	N/A	N/A	Linha usada em dados representativos
Lâminas de vidro	Fisher Scientific	12-550-A3	Mantém as moscas em contenção
Dissipadores de calor	Adafruit		Previne o superaquecimento do computador
Lente	Adafruit	4563	Usado apenas com câmera HD
PiCamera	Adafruit	4561	A versão HD foi usada aqui, mas uma câmera padrão pode ser usada sob restrições orçamentárias
Raspberry pi 4	Computador Adafruit	4292	PiSpy é executado no
cabo Ribbion	Adafruit	1648	Para uso na conexão de componentes de câmera e display
SB Case	Adafruit	4301	Protege o computador
Placa de Spot	Fisher Scientific	S99406	As versões Pyrex já estavam disponíveis para nosso uso, mas placas de cultura de células ou placas de plástico também são suficientes
Tripé	Best Buy	6355959	Para suspensão e posicionamento da câmera, qualquer aparelho capaz disso é suficiente
Fonte de alimentação USB C	Adafruit	1995	Fornece energia para o computador