Artigo de método

Determinando quatro componentes em um sistema de entrega de RNA de nanopartículas lipídicas por cromatografia líquida combinada com detector de espalhamento de luz evaporativa

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 de maio de 2025

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1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, estabelecemos um método de análise quantitativa para quatro componentes em um sistema de entrega de RNA de nanopartículas lipídicas (LNP) usando cromatografia líquida de alta eficiência combinada com um detector de espalhamento de luz evaporativo (ELSD). O método tem boa separação, alta sensibilidade e alta eficiência.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo apresenta um método para a análise de componentes de nanopartículas lipídicas (LNP). O LNP, servindo como um vetor fundamental para medicamentos à base de RNA, consiste principalmente em colesterol, PEG com modificações, lipídios ionizáveis e lipídios auxiliares. Esses componentes exibem polaridade fraca, levando a forte retenção e dificuldade de separação usando cromatografia de fase reversa, além de não ter características distintas de absorção ultravioleta. Para enfrentar esse desafio, um sistema de cromatografia líquida foi acoplado a um detector de espalhamento de luz evaporativo (ELSD). Ajustando sistematicamente o tipo de coluna cromatográfica e otimizando o programa de eluição de gradiente da fase móvel, foi realizada uma separação rápida e completa da linha de base dos quatro componentes críticos. A utilização da mais recente tecnologia ELSD aumentou significativamente a sensibilidade de detecção e expandiu a faixa linear do método. Os resultados experimentais demonstraram que, dentro de uma faixa de concentração de 5 μg/mL a 250 μg/mL, os quatro componentes do LNP apresentaram excelente linearidade com coeficientes de correlação superiores a 0,999, e a precisão variou de 94,2% a 108,0%. Em experimentos de precisão, os desvios padrão relativos do tempo de retenção e da área de pico para uma solução padrão de 10 μg/mL foram inferiores a 0,1% e 2%, respectivamente. Ao usar este método para analisar diferentes amostras de LNP, todos os componentes são separados com sucesso e seus respectivos conteúdos são quantificados com precisão, destacando a adaptabilidade robusta dessa abordagem analítica.

Introdução

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A nanopartícula lipídica (LNP) é um dos sistemas de entrega de genes não virais mais avançados, usado principalmente para a entrega de medicamentos de ácidos nucleicos, como oligonucleotídeos antisense, pequenos nucleotídeos interferentes, mRNA, etc. 1,2,3. O LNP é geralmente composto por quatro componentes: lipídios ionizáveis, lipídios modificados por polietilenoglicol (PEG), fosfolipídios e colesterol. O componente chave são os lipídios ionizáveis, que são o fator decisivo na eficiência da administração de medicamentos de ácido nucleico. Os outros três componentes podem aumentar a estabilidade do LNP e reduzir o reconhecimento do sistema imunológico 4,5,6.

As proporções variáveis dos quatro componentes do LNP podem impactar significativamente o processo de automontagem das nanopartículas, afetando propriedades como a eficiência de encapsulamento do ingrediente farmacêutico ativo (API), sua eficácia de entrega e a taxa de liberação in vivo 7,8,9. Portanto, é essencial estabelecer um método de análise quantitativa para os componentes do LNP, facilitando assim a síntese de um sistema de entrega de LNP ideal10,11.

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica analítica contemporânea amplamente empregada em análises farmacêuticas e é estimada por sua alta eficiência, sensibilidade e capacidade de automação. A HPLC engloba vários detectores, incluindo detectores ultravioleta (UV) convencionais, bem como detectores de uso geral, como detectores de índice de refração (RID), detectores de espalhamento de luz evaporativa (ELSD), detectores de aerossóis carregados (CAD) e detectores de radiofrequência (RF) altamente seletivos, entre outros12.

No caso da análise dos quatro componentes do LNP, que não possuem grupos distintos de absorção de UV e, portanto, não produzem resposta em detectores de UV, foi considerado o uso de detectores de uso geral. Embora o RID seja uma dessas opções, ele não é adequado para análise de gradiente e oferece sensibilidade relativamente menor em comparação com os outros dois detectores de uso geral; portanto, não foi escolhido12. Além disso, embora os detectores CAD possuam alta sensibilidade, seu custo proibitivo os torna menos atraentes12.

Consequentemente, o detector ELSD foi selecionado. Este detector apresenta uma opção de modo de ganho distinta - o modo 'amplo' - que permite a análise simultânea de componentes de alta concentração e traços, aumentando a sensibilidade e expandindo a faixa linear.

Este artigo emprega um sistema de HPLC acoplado ao ELSD, alcançando separação eficiente e análise quantitativa dos quatro componentes do LNP por meio da otimização de colunas cromatográficas, eluição de gradiente de fases móveis e outras condições13.

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Protocolo

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1. Preparação do instrumento

  1. Configuração do instrumento
    1. Configure um sistema de HPLC acoplado a um ELSD.
  2. Instalação de coluna
    1. Instale a coluna cromatográfica (C4-300; 150 mm × 4,6 mm de diâmetro interno, 5 μm), seguindo a direção da seta na coluna, com uma extremidade conectada à saída do amostrador automático e a outra à entrada ELSD.
  3. Preparação da fase móvel
    1. Preparar as fases móveis: fase A, solução aquosa de TEAA a 10 mM (pH = 7,0) e fase B, solução de metanol de TEAA a 10 mM (pH = 7,0).
    2. Para preparar a fase A, pese com precisão 1,01 g de trietilamina, dissolva-a em 1000 mL de água, misture bem e ajuste o pH para 7,0 com ácido acético.
    3. Para preparar a fase B, dissolva 1,01 g de trietilamina em 1000 mL de metanol, misture e ajuste o pH para 7,0 com ácido acético.
  4. Edição de método
    1. Ligue os interruptores de energia para cada módulo do LC-ELSD e inicie o software LabSolutions . Em seguida, abra a janela Análise em tempo real .
    2. Clique em Arquivo e selecione Novo para criar um novo arquivo de método. Modifique o Tempo de parada de LC no método para 15 e clique em Aplicar a todos os tempos de aquisição.
    3. Em seguida, clique em Bomba para modificar os parâmetros da bomba. Selecione o modo de análise como Gradiente binário de alta pressão (B.GE) e defina a vazão para 1.0 mL/min.
    4. Em seguida, defina a concentração inicial da bomba B (%B) para 80% e modifique o gradiente de fase móvel: em 3 min, %B é 80%, em 4 min, %B é 85% de 5.5 min a 12 min, %B é 100%, em 12.1 min, %B retorna a 80%.
    5. Em seguida, clique em Forno de coluna e defina a temperatura do forno para 55 °C. Por fim, clique em ELSD para modificar a temperatura do tubo de deriva para 40 °C. Salve o método.
      NOTA: O resumo dos parâmetros é mostrado na Tabela 1.
  5. Inicie e equilibre o instrumento.
    1. Clique em Download e inicialização para iniciar e equilibrar o instrumento.

2. Preparação de soluções-padrão e amostras

  1. Preparação de soluções-padrão
    1. Pesar com precisão 10,0 mg das quatro substâncias padrão componentes do LNP separadamente, dissolver em 1 mL de metanol e vórtice até dissolver completamente para obter soluções estoque com uma concentração de 10 mg/mL para cada componente.
    2. Usando uma pipeta, transfira com precisão 100 μL de cada uma das quatro soluções de estoque para um frasco de amostra e, em seguida, adicione 600 μL de metanol. Misturar bem para preparar uma solução intermédia mista 1 com uma concentração de 1000 μg/ml.
    3. Transfira com precisão 20 μL de cada uma das quatro soluções de estoque para um frasco de amostra e, em seguida, adicione 920 μL de metanol. Misturar bem para preparar uma solução intermédia mista 2 com uma concentração de 200 μg/ml.
    4. Em seguida, prepare uma série de soluções-padrão em concentrações de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL e 250 μg/mL por diluição seriada de acordo com a Tabela 2.
  2. Preparação de amostras
    1. Usando uma pipeta, transfira com precisão 100 μL da amostra para um frasco de amostra, adicione 900 μL de metanol e misture bem. Neste ponto, certifique-se de que a concentração de LNP na amostra seja diluída 10 vezes e o LNP seja dissociado do medicamento de ácido nucleico.

3. Aquisição de dados

  1. Colocar as soluções-padrão e as soluções de amostra no amostrador automático do cromatógrafo líquido.
  2. Clique em Lote em Tempo Real na barra de ferramentas do assistente da janela Análise em Tempo Real . Em seguida, clique em Novo no menu Arquivo para criar uma nova tabela de lotes.
  3. Na tabela de lotes, insira o Vial#, o Nome da bandeja, o Data file e o volume de injeção das soluções padrão e sample e selecione o método file salvo na etapa 1.4. Clique em Salvar arquivo em lote no menu Arquivo para salvar o arquivo em lote.
  4. Aguarde até que a pressão do cromatógrafo líquido e a linha de base do cromatograma estejam estáveis. Em seguida, clique em Iniciar lote em tempo real na barra de ferramentas do assistente para iniciar a aquisição de dados.

4. Análise dos dados

  1. Estabeleça curvas de calibração
    1. Abra a janela do navegador do software LabSolutions e arraste os dados da solução padrão para a visualização de resultados quantitativos para estabelecer uma curva de calibração. Em seguida, modifique os parâmetros de processamento de dados. Clique em Editar na visualização do método.
    2. Na janela Parâmetros de integração , altere o valor da inclinação para 10000. Em seguida, nos Parâmetros de identificação, altere o método de identificação para Banda e defina a Largura de banda padrão para 0,1 min.
    3. Depois disso, modifique os parâmetros quantitativos. Altere o Método Quantitativo para Padrão Externo e defina o # do Nível de Calibração como 7. Selecione o tipo de curva de calibração como Exponencialmente. Em seguida, modifique o Composto.
    4. Insira os nomes e as concentrações de solução padrão dos quatro componentes do LNP. Clique duas vezes no ápice de pico para atualizar os tempos de retenção. Por fim, clique em Exibir para concluir a modificação dos parâmetros de processamento de dados.
    5. Modifique o tipo de amostra na visualização Resultados quantitativos para Padrão (ponto de cálculo). De acordo com as concentrações, definir os níveis da solução-padrão de 1-7. Depois que as curvas de calibração forem estabelecidas, clique em Arquivo na barra de menus e salve o arquivo do método.
  2. Análise quantitativa de amostras
    1. Arraste os dados das amostras para a Visualização de Resultados Quantitativos da janela do navegador, que exibirá os resultados da concentração dos quatro componentes LNP nas amostras.

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Resultados

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A análise da solução padrão LNP usando este método alcançou um grau de separação maior que 1,5 para os quatro componentes, realizando a separação da linha de base. Além disso, não foram observados resíduos em soluções padrão de alta concentração, conforme ilustrado na Figura 1. Uma curva de calibração foi estabelecida dentro de uma faixa de concentração de 5 a 250 μg/mL, exibindo coeficientes de correlação todos superiores a 0,999, indicando uma ampla faixa linear e excelente linearidade. A ...

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Discussão

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Todos os quatro componentes do LNP exibem uma polaridade relativamente fraca. Quando analisados usando uma coluna C18, os compostos-alvo demonstram forte retenção dentro da coluna, levando ao alargamento do pico de fosfolipídios para componentes fortemente retidos. Além disso, após a análise de soluções de alta concentração, os resíduos se acumulam no topo da coluna C18, o que pode comprometer a precisão da quantificação. O cromatograma é mostrado na Figura 5

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradeço às empresas biofarmacêuticas por fornecerem as amostras de LNP para o experimento e agradecemos à Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd por fornecer a coluna de cromatografia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
EquilíbrioShimadzu (Xangai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdAP135W
ColunaShimadzu (Xangai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO.,LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO.,LTD
LCShimadzu (China) CO., LTDLC40D XR
MetanolANPEL Laboratory Technologies (Xangai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipeta-100 µ LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,Ltd00-NAR-100
Pipeta-1000 µ LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Sistema de Água Ultra-puradeMillipore
ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B
Misturador Vórtice ZIQ7000T0C

Referências

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  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
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  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
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