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Artigo de método

Entrega de genes eficaz e segura ao rim de camundongo por meio de injeção lenta e retrógrada da pelve renal de vetores de vírus adeno-associados

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DOI:

10.3791/67716

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1 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

Neste artigo

Resumo

Este relatório detalha o método de injeção localizada de vetores AAV através da pelve renal para transferência eficaz e segura de genes para o rim de camundongo.

Resumo

O desenvolvimento de ferramentas e métodos in vivo eficazes para a entrega de genes ao rim é crucial para o avanço da pesquisa renal básica e da terapia genética para doenças renais. Além disso, a crescente conscientização sobre doenças renais monogênicas, impulsionada por testes genéticos avançados, ressalta o potencial da terapia genética para tratar e até curar doenças renais genéticas difíceis de tratar. Nesse sentido, os vetores de vírus adeno-associados (AAV) têm atraído cada vez mais atenção como uma plataforma robusta para a entrega de genes in vivo ; no entanto, o método mais eficaz e seguro para a entrega de genes mediados por vetores AAV para cada tipo de célula terapeuticamente relevante no rim ainda não foi totalmente estabelecido. Aqui, o método de injeção lenta de pelve renal retrógrada (RP) de vetores AAV é detalhado, e seu alto potencial para transduzir rins de camundongos é demonstrado quando usado com capsídeos AAV adequadamente selecionados. Além disso, este método mostra-se eficaz não apenas com os vetores AAV purificados por ultracentrifugação de cloreto de césio padrão (CsCl AAV), mas também com minipreparações de vetor AAV (AAV) ultrafiltradas centrífugamente, que podem ser preparadas de forma rápida e simples usando técnicas que não requerem conhecimento especializado em vetores AAV. Como exemplo, este estudo demonstra que a injeção lenta de RP dos vetores CsCl e AAV-KP3 resulta em transdução robusta de túbulos proximais no rim de camundongo sem dano tecidual aparente, ao contrário das abordagens hidrodinâmicas relatadas anteriormente que inevitavelmente levam a danos teciduais. Assim, este estudo destaca que a injeção lenta de RP retrógrada de vetores selecionados derivados do capsídeo AAV é um método eficaz e seguro para a entrega de genes ao rim. Este método será aplicável a um amplo espectro de pesquisa renal, incluindo estudos de terapia genética. O uso de minipreparações vetoriais AAV aumentará significativamente o rendimento e melhorará a eficiência de tempo e custo necessária para gerar dados preliminares e obter insights cruciais.

Introdução

Métodos eficazes e seguros para entrega de genes ao rim em animais experimentais pequenos e grandes oferecem oportunidades cruciais para avançar na pesquisa renal básica e explorar abordagens terapêuticas inovadoras. O estabelecimento de tais métodos é particularmente relevante para a terapia gênica para várias doenças renais. Avanços recentes nos testes genéticos clínicos revelaram uma prevalência maior de doenças renais monogênicas do que o estimado anteriormente, afetando aproximadamente 30% dos pacientes com doenças renais crônicas (DRCs)1. A DRC é caracterizada por danos renais progressivos, levando à insuficiência renal sem terapias modificadoras da doença verdadeiramente eficazes. A hemodiálise e o transplante renal são tratamentos atualmente disponíveis; no entanto, apresentam limitações que prejudicam significativamente a qualidade de vida dos pacientes com DRC2. Assim, a terapia genética, uma abordagem poderosa clinicamente comprovada para o tratamento de doenças genéticas, tem atraído atenção significativa nos últimos anos como um novo caminho para o tratamento eficaz de doenças renais genéticas que levam à DRC 3,4,5,6. Essa abordagem pode abordar diretamente as causas profundas das doenças e potencialmente oferecer uma cura.

Apesar dos avanços constantes no campo, a entrega de genes ao rim continua sendo um desafio significativo tanto na pesquisa quanto nos ambientes terapêuticos. O direcionamento eficiente das células renais com genes terapêuticos é difícil devido à estrutura complexa do órgão e às barreiras fisiológicas únicas, incluindo a barreira de filtração glomerular, que é composta por células endoteliais glomerulares, membrana basal glomerular e processos de pé de podócito. Várias estratégias foram exploradas para a entrega de genes direcionados aos rins, incluindo injeção direta do córtex renal (RC) 7,8, injeção da artéria renal (AR) 9,10,11, injeção da veia renal (RV) 12,13,14, injeção da pelve renal (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 e injeção intravenosa (IV)19,26,27,28,29,30 de vetores de entrega gênica viral ou não viral, bem como liberação de ácido nucleico mediada por ultrassom e microbolhas 31,32. Essas abordagens demonstraram eficiências de transdução variáveis ou resultados funcionais, muitas vezes produzindo resultados inconsistentes que são difíceis de conciliar (revisados nas referências 3,33,34,35). A entrega de genes ao rim ainda é subdesenvolvida, tornando desafiadoras as comparações diretas entre sistemas de vetores e metodologias. No entanto, os métodos de administração localizada, que facilitam a administração de agentes altamente concentrados diretamente no rim, geralmente alcançaram melhores resultados do que a administração intravenosa sistêmica. Além disso, os vetores de vírus adeno-associados (AAV), com seus perfis de segurança robustos e histórico comprovado de tradução clínica36,37, têm sido os mais estudados e são considerados a principal escolha para transferência de genes renais.

Os sorotipos comuns de AAV e capsídeos modificados demonstraram transdução eficaz de células mesangiais e mesenquimais no rim após injeção intravenosa em camundongos 28,30,38. Notavelmente, estudos recentes mostraram que a administração IV de AAV9 pode efetivamente transduzir podócitos em modelos de camundongos de síndrome nefrótica e síndrome de Alport, embora esse efeito não seja observado em rins saudáveis38,39, e que a administração IV de um capsídeo AAV2 projetado pode atingir exclusivamente células endoteliais glomerulares em rins saudáveis e inflamados em camundongos40. Historicamente, os túbulos renais têm sido difíceis de transduzir por via intravenosa. No entanto, foi descoberto recentemente que a injeção de RP de capsídeos AAV selecionados, como AAV-KP141, pode alcançar a transdução de túbulos proximais em níveis mais altos do que aqueles alcançados com o capsídeo AAV9 de referência38. Embora sejam necessárias mais melhorias, esses avanços abrem novos caminhos para a pesquisa renal básica e a terapia genética, oferecendo oportunidades que antes eram inatingíveis.

No presente artigo, a injeção lenta e retrógrada de RP de vetores AAV é detalhada como um método eficaz e seguro para entrega de genes ao rim de camundongo38. Como um exemplo representativo dessa técnica, o AAV-KP3 foi escolhido como um capsídeo exemplar com base na descoberta de que é um dos seis capsídeos (ou seja, AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 e AAV2.7m844) que mostraram transdução renal aprimorada em comparação com AAV9 após injeção de RP em camundongos38. Notavelmente, os tecidos renais retrógrados lentos injetados com RP não mostraram danos teciduais aparentes em contraste com aqueles tratados com abordagens hidrodinâmicas relatadas anteriormente23,24. Além disso, os vetores miniprep AAV45 grosseiramente purificados por ultrafiltração centrífuga rápida e simples (ou seja, vetores AAV) alcançaram níveis de transdução renal aproximadamente 70% daqueles atingíveis por preparações de vetores AAV purificadas pela ultracentrifugação de gradiente de cloreto de césio padrão (CsCl) (ou seja, vetores CsCl AAV) quando administrados no mesmo título do genoma do vetor. Assim, o método e as observações aqui apresentadas fornecem um recurso valioso e prático para pesquisadores que buscam melhorar a entrega de genes ao rim em camundongos e animais potencialmente maiores.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oregon Health & Science University (OHSU) e foram realizados de acordo com as diretrizes para cuidados com animais na OHSU. Neste estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com oito semanas de idade. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Produção de vetor AAV por uma transfecção de plasmídeo livre de adenovírus

  1. Cultura de rim embrionário humano (HEK) 293 células em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco - glicose alta (4,5 g/L) suplementada com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de mistura de penicilina e estreptomicina e 1 mM de L-glutamina, em uma incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono (CO2).
  2. No Dia -2 (48 h antes da transfecção), coloque 4 x 106 HEK 293 células por frasco T225 em 40 mL do meio de cultura, conforme descrito na etapa 1.1. Isso atinge ~ 95% de confluência no Dia 0.
    NOTA: A escala de cultura pode ser ajustada com base na aplicação. Para uma minipreparação AAV (etapa 2), prepare um número apropriado de frascos com base no título alvo e na concentração do vetor, considerando que o processo de purificação normalmente resulta em uma perda aproximada de 50% de material. Para atingir >6 x 1012 vg/mL de vetores AAV9 e AAV-KP3 para injeção de RP em camundongos na dose de 3 x 1011 vg/camundongo em uma solução vetorial de 50 μL, recomenda-se pelo menos 2 frascos. Para a produção de vetores AAV em larga escala, como os vetores AAV purificados por gradiente de densidade de CsCl (CsCl AAVs), normalmente são usados 25 ou mais frascos.
  3. Dia 0: Transfecção de DNA de plasmídeo
    1. Preparação para transfecção
      1. Certifique-se de que as células atingiram ~ 95% de confluência.
      2. Aqueça o DMEM suplementado com 1% de penicilina e mistura de estreptomicina e 1 mM de L-glutamina, mas sem FBS (ou seja, meio sem soro) em banho-maria a 37 °C.
      3. Deixe a solução linear de polietilenonimina (PEI) atingir a temperatura ambiente.
    2. Preparação da mistura de DNA plasmidial
      1. Misture os plasmídeos (15 μg cada de pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap, e pHelper) em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem CaCl2 ou MgCl2 em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL. A quantidade total de ADN é de 45 μg/frasco.
        NOTA: Os volumes da solução de DNA do plasmídeo podem ser desconsiderados se forem mínimos. No entanto, o ajuste do volume é recomendado se o volume total da solução for ≥225 μL. As sequências dos plasmídeos usados neste estudo estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1.
    3. Transfecção de PEI
      1. Adicione 90 μL de solução de PEI (1 mg / mL) a 1 mL de PBS e misture com a mistura de DNA de plasmídeo PBS (preparada como acima) em um tubo de polipropileno de 50 mL. O volume final é de aproximadamente 2 mL (5% do volume do meio de cultura).
      2. Vortex os tubos por 5 s e gire brevemente os tubos com uma centrífuga para coletar o líquido para o fundo dos tubos.
    4. Mantenha em temperatura ambiente por 15 min para formar complexos DNA-PEI de plasmídeo.
    5. Quando a incubação de 15 minutos estiver concluída, adicione os 40 ml de meio pré-aquecido sem soro preparado na etapa 1.3.1.2 aos complexos DNA-PEI do plasmídeo. O volume é de aproximadamente 42 mL.
    6. Substituir o meio de cultura do balão T225 por complexos plasmidiais DNA-PEI contendo meio isento de soro descrito no passo 1.3.4.
    7. Mantenha as células neste meio de transfecção até a colheita no dia 5 (nenhuma troca de meio é necessária).
    8. No dia 2, observe as células transfectadas com o plasmídeo que expressa proteínas fluorescentes (por exemplo, pAAV-CAG-tdTomato) sob um microscópio de fluorescência invertida para avaliar a eficiência da transfecção do plasmídeo.
      NOTA: As condições descritas acima normalmente resultam em eficiências de transfecção superiores a 70%. Algumas alterações morfológicas (por exemplo, alongamento celular) podem ser observadas, provavelmente devido ao ambiente livre de soro.
    9. Nos dias 3 a 5, continue a cultivar as células transfectadas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
    10. No dia 5, colete as células e o meio contendo vírus em um tubo de polipropileno de 50 mL.
    11. Armazenar as amostras a -80 °C até à utilização.

2. Purificação por ultrafiltração centrífuga () de vetores AAV (AAV miniprep)

  1. Descongelar a amostra congelada do passo 1.3.11 num banho-maria a 37 °C.
  2. Reserve 1 mL de lisado bruto para o ensaio de DNA dot blot (usado como Fração 1).
  3. Adicione 80 μL de cloreto de magnésio 1M (MgCl2, concentração final de 2 mM), 160 μL de hidróxido de sódio 0,1M (NaOH, concentração final de 0,4 mM) e 16 μL de endonuclease de Serratia marcescens (concentração final de 100 unidades / mL) em um tubo de 50 mL. Incubar a 37 °C durante 1 h. Vortex a amostra a cada 15 min durante a incubação.
  4. Colete a amostra tratada com endonuclease de Serratia marcescens em um frasco de centrífuga de 250 mL e centrifugue a 10.000 x g a 4 ° C por 30 min.
  5. Transferir o sobrenadante para um tubo de polipropileno de 50 ml utilizando uma pipeta serológica de 50 ml.
  6. Filtre o sobrenadante para remover os detritos usando um filtro de seringa de PVDF de 0,45 μm. Mantenha 1 mL de 0,45 μm filtrado sample de lado para o ensaio de DNA dot blot (usado como Fração 2).
  7. Adicione 10 mL de água de grau molecular a um tubo de ultrafiltração centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa e centrifugue a 2.000 x g a 4 °C por 10 min. Remova o fluxo.
  8. Adicione 15 mL de sorbitol a 5% em PBS ao tubo de ultrafiltração centrífuga e centrifugue a 2.000 x g a 4 ° C por 10 min. Remova o fluxo.
  9. Adicione até 15 mL de amostra filtrada a 0,45 μm, conforme descrito na etapa 2.6, e centrifugue a 2.000 x g a 4 ° C por 15 min para concentração até que o volume alvo de aproximadamente 500 μL seja alcançado. Reserve 1 mL de fluxo para o ensaio de DNA dot blot (usado como Fração 3).
    NOTA: Antes de cada centrifugação, ressuspenda o retentado com uma pipeta para interromper o gradiente de concentração. Não toque na membrana com a ponta da pipeta. Se o volume alvo não for atingido após 15 minutos de centrifugação, estenda a centrifugação conforme necessário, ajustando a duração com base no volume restante no tubo.
  10. Repita a etapa 2.9 até que toda a amostra seja filtrada, atingindo o volume alvo de aproximadamente 500 μL. Mantenha 1 mL do fluxo da primeira e segunda iterações da etapa 2.10 de lado para o ensaio de DNA dot blot (usado como Fração 4 e Fração 5).
    NOTA: Um único tubo de ultrafiltração centrífuga pode ser usado para processar amostras obtidas de dois ou mais frascos.
  11. Adicione 15 mL de sorbitol a 5% em PBS e centrifugue a 2.000 x g a 4 ° C por 15 min até que o volume alvo de aproximadamente 500 μL seja alcançado. Reserve 1 mL de fluxo para o ensaio de DNA dot blot (usado como Fração 6).
  12. Repita a etapa 2.11 (usada como Fração 7).
    NOTA: Se forem necessários títulos de AAV mais altos para experimentos a jusante, o volume alvo final pode ser reduzido para 150 μL.
  13. Transfira o vetor AAV ultrafiltrado para um tubo de tampa de rosca de 2 mL com um O-ring. Mantenha 10 μL de vetor AAV ultrafiltrado de lado para o ensaio de DNA dot blot (usado como Fração 8).
  14. Determine os títulos de AAV pelo ensaio de DNA dot blot conforme descrito anteriormente46.
    NOTA: Os vetores purificados por CUS (AAV) contêm níveis mais altos de contaminação do capsídeo vazio e impurezas derivadas da célula hospedeira em comparação com os vetores purificados por CsCl (CsCl AAV). Esses fatores podem afetar a eficiência da transdução e as respostas imunes, exigindo consideração cuidadosa na interpretação dos dados.

3. Purificação de gradiente de densidade de CsCl de vetores AAV

  1. Descongelar a amostra congelada do passo 1.3.11 num banho-maria a 37 °C.
  2. Centrifugue a 10.000 x g a 4 °C por 30 min para remover os detritos celulares.
  3. Coletar os vetores AAV sobrenadante e precipitado no sobrenadante adicionando polietilenoglicol 8000 (PEG, concentração final de 8%) e cloreto de sódio (concentração final de 500 mM).
  4. Incubar no gelo durante 3 h.
  5. Centrifugar a 10.000 x g a 4 °C durante 30 min para obter os pellets contendo AAV.
  6. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets com 10 ml de Sarkosyl contendo tampão de ressuspensão (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl, pH 8,0).
  7. Transferir a suspensão de pellets para um tubo de polipropileno de 15 ml e mantê-lo a 4 °C durante a noite.
  8. No dia seguinte, tratar a suspensão de pellets com endonuclease de Serratia marcescens (concentração final de 200 unidades/mL) e MgCl2 (concentração final de 2 mM).
  9. Incubar a 37 °C durante 1h.
  10. Centrifugue a 10.000 x g a 4 °C por 30 min.
  11. Recolha o sobrenadante e adicione cloreto de césio (CsCl, concentração final do índice de refração (IR) = 1,3710 +/- 0,0005) e EDTA (concentração final de 20 mM).
  12. Carregue a amostra em um tubo de ultracentrífuga de 29,9 mL e adicione a solução de cobertura (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) até que esteja cheio.
  13. Centrifugar a 41.000 x g a 12 °C durante 22 h.
  14. Faça furos na parte inferior e lateral do tubo da ultracentrífuga para coletar um total de 15 frações de 2 mL cada.
  15. Use 10 μL de cada fração para verificar o IR e realizar o ensaio de DNA dot blot46.
  16. Com base nos resultados do ensaio de RI e DNA dot blot, determine as 5 melhores frações que contêm vetores AAV.
  17. Combine as 5 melhores frações (totalizando cerca de 10 mL) e ajuste o IR para 1,3710 +/- 0,0005.
  18. Carregue a amostra em um tubo de ultracentrífuga de 11,2 mL e adicione a solução de cobertura até que esteja cheia.
  19. Centrifugue a 65.000 x g a 12 °C por 12 h.
  20. Faça furos na parte inferior e lateral do tubo de ultracentrífuga de 11,2 mL para coletar um total de 18 frações de 0,5 mL cada.
  21. Use 10 μL de cada fração para verificar o IR e realizar o ensaio de DNA dot blot46.
  22. Com base nos resultados do ensaio de RI e DNA dot blot, determine as 6 melhores frações que contêm vetores AAV.
  23. Combine as 6 melhores frações (total de cerca de 3 mL) e coloque-as em um de diálise.
  24. Flutue o de diálise em 1,3 L de tampão de diálise (tampão PBS suplementado com surfactante não iônico a 0,001%) com uma barra de agitação por 2 h para remover o CsCl.
  25. Repita o passo 3.24 duas vezes (total de 6 h de diálise).
  26. Transfira o para 500 mL de sorbitol a 5% em tampão PBS suplementado com surfactante a 0,001% por 2 h para troca de tampão.
  27. Colete a amostra do de diálise com uma seringa e filtre a amostra coletada usando um filtro de seringa de PVDF de 0,22 μm.
  28. Títulos de AAV determinados por um ensaio quantitativo de dot blot46.

4. Avaliação da qualidade das preparações de vetores AAV por SDS-PAGE seguida de coloração com prata

  1. Misturar preparações vetoriais, 1 x 1010 vg para vetores CsCl AAV, e 1 x 109 e 1 x 1010 vg para vetores AAV, com 6x tampão Laemmli em um total de 18 μL (preparação vetorial: 6x Laemmli = 15:3) e aquecê-los a 100 °C por 5 min.
  2. Carregue as preparações de vetor AAV tratadas termicamente em um gel SDS-PAGE a 7,5% e eletroforse as amostras a 20 mA usando tampão de execução de gel Tris-glicina-SDS.
  3. Remova o gel do de gel, enxágue com água ultrapura e manche-o usando um kit de coloração de prata de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Incubar o gel carregado com vetores CsCl AAV na solução reveladora por 7 min, enquanto incubar o gel carregado com vetores AAV por 2 min para evitar a saturação do sinal.
    NOTA: As preparações de vetores AAV contêm níveis mais altos de impurezas proteicas em comparação com os vetores CsCl AAV. Portanto, os géis carregados com os vetores CsCl AAV e AAV foram separados após a execução do gel e corados com prata separadamente para evitar a saturação do sinal devido à alta sensibilidade do método de coloração.

5. Identificação de proteínas AAV VP em preparações de vetores AAV por western blot

  1. Misture 1 x 109 vg de preparações vetoriais AAV com tampão 6x Laemmli em um total de 18 μL (preparação vetorial: 6x Laemmli = 15: 3) e aqueça-as a 100 ° C por 5 min.
  2. Carregue as preparações de vetor AAV tratadas termicamente em um gel SDS-PAGE a 7,5% e eletroforse as amostras a 20 mA usando tampão de execução de gel Tris-glicina-SDS.
  3. Proteínas de eletrotransferência no gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF), ativada em metanol, usando um sistema de transferência semi-seco.
  4. Bloqueie a membrana com 5% de leite desnatado em 1x solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) em temperatura ambiente por 1 h.
  5. Incubar a membrana bloqueada com solução de anticorpo primário (anticorpo anti-VP policlonal de coelho, diluído a 1:1000 com 5% de leite desnatado em 1x TBST) a 4 °C durante a noite.
  6. Lave a membrana com 1x TBST por 10 min, 3 vezes.
  7. Incubar a membrana com solução de anticorpo secundário (anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano, diluído a 1:5000 com 5% de leite desnatado em 1x TBST) à temperatura ambiente por 1 h.
  8. Lave a membrana com 1x TBST por 10 min, 3 vezes.
  9. Visualize sinais na membrana usando um sistema de imagem de western blot.

6. Injeção de pelve renal (RP)

  1. Configuração pré-operatória e anestesia
    1. Meça o peso corporal de cada camundongo em um béquer de plástico em uma escala de peso com precisão de 0,1 g.
    2. Administre meloxicam (5 mg/kg) por via subcutânea com base no peso corporal para fornecer analgesia pré-cirúrgica.
    3. Diluir a solução vetorial AAV a uma concentração de 6,0 x 1012 vg/ml com sorbitol a 5% em PBS e mantê-la no gelo.
      NOTA: Prepare 40 μL a mais de solução de AAV do que o volume total de injeção (50 μL x número de camundongos a serem injetados) para contabilizar o espaço morto em uma seringa de vidro à prova de gás e um tubo de polietileno PE-10.
    4. Dobre e quebre apenas a ponta da agulha de uma agulha de 30 G usando um porta-agulha.
    5. Sob um estereomicroscópio, conecte a ponta da agulha de 30 G, 15 cm de tubo PE-10, uma agulha de 30 G e uma seringa de vidro à prova de gás nesta ordem da ponta (Figura 1D).
    6. Coloque a seringa de vidro à prova de gás conectada em uma bomba de seringa de infusão.
    7. Aspirar 90 μL de solução vetorial de AAV preparada na etapa 6.1.3 para a seringa de vidro estanque ao gás usando uma bomba de seringa de infusão.
    8. Defina o modo de infusão da bomba de seringa da seguinte forma: o volume alvo de 50 μL e uma taxa de fluxo de 50 μL / min.
    9. Coloque um camundongo em uma câmara de plástico cheia de isoflurano a 4% fornecido em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1,5 a 3,0 L/min até que esteja totalmente anestesiado.
    10. Coloque o focinho do camundongo em um cone nasal com fluxo de isoflurano de 1,5% a 3,0%. Monitore a profundidade da anestesia pelo reflexo de pinça do dedo do pé durante todo o procedimento cirúrgico.
    11. Cubra os olhos com pomada oftálmica usando um aplicador com ponta de algodão para evitar a dessecação da córnea.
    12. Remova o pelo da parte traseira esquerda do mouse com um depilatório usando um aplicador com ponta de algodão.
      NOTA: O creme depilatório deve ser completamente removido por enxágue para evitar irritação da pele.
    13. Coloque o mouse em uma posição lateral em uma almofada térmica de circuito fechado conectada a uma bomba de terapia de calor para manter a temperatura corporal a 37 °C (não há necessidade de prendê-lo com fita adesiva).
    14. Desinfete a área raspada com três aplicações alternadas de iodopovidona e etanol 70% usando um aplicador com ponta de algodão em movimentos circulares começando no local da incisão.
    15. Cubra o mouse com uma cortina cirúrgica estéril.
  2. Injeção de RP no rim esquerdo
    1. Aperte a pele com uma pinça de tecido e faça uma incisão de aproximadamente 1 cm na camada de pele com tesoura cirúrgica no nível do ângulo costovertebral no local do rim esquerdo.
    2. Depois de fazer uma incisão na pele, corte a camada muscular no mesmo comprimento.
      NOTA: Se o comprimento da incisão for muito curto, o rim não pode ser exposto e, em vez disso, o baço, que é menor em tamanho, pode ser exposto acidentalmente. Por outro lado, se o comprimento da incisão for muito longo, o rim não será mantido no lugar pela própria incisão e deslizará continuamente de volta para o abdômen através da incisão.
    3. Pressione suavemente o abdômen com os dedos, sem tocar diretamente o rim, para que o rim fique exposto através do local da incisão (Figura 1A).
    4. Remova minimamente a gordura circundante para que a pelve renal fique visível como uma pequena área branca.
    5. Primeiro, clampeie o ureter com um clipe de microvasos do tipo reto e, em seguida, a artéria renal e a veia renal junto com um clipe de microvasos do tipo curvo.
      NOTA: A cor do rim fica vermelha escura, confirmando o bloqueio bem-sucedido do fluxo sanguíneo para dentro e para fora do rim (Figura 1B).
    6. Insira a agulha de 30 G conectada à bomba de seringa aproximadamente 3 mm na cavidade pélvica com uma pinça curva e inicie uma injeção de 50 μL de solução vetorial AAV usando uma bomba de seringa de infusão a uma taxa de fluxo de 50 μL / min durante 1 min (Figura 1C).
    7. Mantenha a agulha e clamp por 5 min para aumentar a exposição do rim injetado ao vetor AAV.
      NOTA: O tempo de permanência apropriado pode variar e depender dos capsídeos AAV. Um tempo de permanência de 5 min demonstrou ser suficiente para a transdução com o vetor AAV-KP1 ou AAV-KP3.
    8. Quando a incubação de 5 minutos estiver concluída, remova o clamps.
      NOTA: A cor do rim muda imediatamente de vermelho escuro para vermelho sangue, confirmando a restauração do fluxo sanguíneo no rim.
    9. Retire a agulha de injeção com cuidado e lentamente, colocando simultaneamente um aplicador com ponta de algodão sobre o local da injeção com pressão. Certifique-se de que não há sangramento no local da injeção. A aplicação de um adesivo hemostático não é necessária.
    10. Coloque suavemente o rim de volta na cavidade peritoneal.
    11. Suturar a camada muscular com sutura absorvível 6-0 e a pele com sutura monofilamentar 5-0.
    12. Administre 1 mL de solução salina por via subcutânea nas costas dos camundongos para suporte de fluidos.
    13. Substitua a ponta da agulha usada de 30 G por uma recém-preparada, descarte a agulha usada de 30 G de acordo com as diretrizes da instituição para gerenciamento de resíduos químicos perigosos e carregue 50 μL da solução vetorial AAV usando uma bomba de seringa de infusão para administração no próximo mouse.
    14. Repita as etapas 6.2.12-6.2.13 para todos os mouses do grupo, exceto para o último, para o qual a etapa 6.2.13 não é necessária.
    15. Depois de concluir todas as injeções planejadas, descarte as agulhas e tubos de polietileno contaminados de acordo com as diretrizes da instituição para gerenciamento de resíduos químicos perigosos.
  3. Monitoramento e cuidados pós-operatórios
    1. Administrar meloxicam (5 mg/kg) por via subcutânea no dorso de ratinhos para analgesia pós-cirúrgica 24 h e 48 h após a injeção de RP.
    2. Administre 1 mL de solução salina por via subcutânea nas costas de camundongos para suporte de fluidos 24 h após a injeção de RP.
    3. Monitore o peso corporal e a aparência geral dos camundongos injetados diariamente por 1 semana após a cirurgia. Se ocorrer uma perda de peso corporal de 10%, administre 1mL de solução salina por via subcutânea nas costas dos camundongos três vezes por semana durante uma semana. Se nenhuma melhora for observada, os camundongos afetados são sacrificados.

7. Colheita de tecidos e criossecção

  1. Preparação da solução de fixação e crioproteção.
    1. Tampão fosfato 0,2 M (total 1 L)
      1. Preparar 800 ml de água ultrapura num copo de vidro de 1 L.
      2. Adicionar 6,4 g de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4) e 21,8 g de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) à solução.
      3. Ajuste o pH para 7,4 com ácido clorídrico.
      4. Encha com água ultrapura até 1 L.
      5. Conservar a 4 °C até à utilização.
    2. Solução de paraformaldeído (PFA) a 4% (total de 40 mL)
      1. Misture 10 mL de PFA a 16%, 20 mL de tampão fosfato 0,2M preparado na etapa 7.1.1 e 10 mL de água ultrapura.
      2. Alíquota de 10 mL em um tubo de polipropileno de 15 mL.
        NOTA: Faça a solução de PFA a 4% antes de usar para fixação de perfusão.
    3. Solução de sacarose a 30% (total de 40 mL).
      1. Misture 30 mL de PBS com 12 g de sacarose.
      2. Depois de dissolver completamente, encha com PBS até 40 mL.
  2. Fixação de perfusão e coleta de tecidos.
    CUIDADO: A fixação por perfusão deve ser realizada em um exaustor, pois a solução de PFA a 4% é um potente produto químico nocivo se inalada.
    1. Anestesie o mouse com isoflurano, coloque-o em decúbito dorsal e confirme a completa ausência de capacidade de resposta beliscando suavemente as extremidades.
    2. Uma vez que o camundongo esteja anestesiado, faça uma incisão usando uma tesoura cirúrgica do abdômen caudal até o xifóide. Em seguida, faça duas incisões laterais ao longo de cada lado do esterno e retraia a parede torácica anteriormente para expor o coração e os vasos principais.
    3. Abra o átrio direito por meio de uma dissecção aguda para descomprimir o sistema circulatório. Insira uma agulha borboleta 25 G no ventrículo esquerdo e infunda 50 mL de PBS a uma taxa de aproximadamente 10 mL / min, direcionando o fluxo para a aorta ascendente.
      NOTA: A exsanguinação é importante para obter imagens de imunofluorescência (IF) de alta qualidade porque o sangue exibe autofluorescência. Para garantir a remoção completa do sangue, 50 mL de PBS foram usados neste estudo, embora 20-30 mL sejam comumente usados.
    4. Infundir 20 mL de solução de PFA a 4% preparada na etapa 7.1.2 na mesma taxa, garantindo que nenhum ar seja introduzido durante a troca de soluções.
    5. Colha os tecidos e mantenha-os a 4 ° C durante a noite em um tubo de polipropileno de 15 mL cheio de solução de PFA a 4% para pós-fixação. Quando a proteína fluorescente for expressa no tecido coletado, cubra o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz.
  3. Cryoembedding
    1. Transfira o tecido para um tubo de polipropileno de 15 mL preenchido com solução de sacarose a 30% preparado na etapa 7.1.3 para crioproteção.
    2. Conservar a 4 °C até que os tecidos penetrem completamente no fundo dos tubos.
    3. Transfira o tecido para um criomold de plástico com uma pinça de padrão padrão.
    4. Coloque o composto OCT sobre o tecido, garantindo que o tecido esteja corretamente orientado e nivelado com o fundo do criomolde.
    5. Encha a parte superior com composto OCT. Remova todas as bolhas com uma ponta de pipeta.
    6. Coloque o criomoldor de plástico em um banho criogênico contendo 2-metilbutano, resfriado com gelo seco picado em um balde de gelo, até que o composto OCT esteja completamente congelado (o composto OCT ficará branco).
    7. Conservar os blocos de tecido a -80 °C até à utilização.
  4. Crioseccionamento
    1. Transferir os blocos de tecido congelado para um micrótomo de criostato a -20 °C antes da seccionação e deixar equilibrar a temperatura dos blocos de tecido congelado.
    2. Corte cada bloco de tecido congelado em uma espessura desejada (normalmente 5 μm) usando o micrótomo criostato. Coloque as seções de tecido em uma lâmina de vidro de microscópio para coloração de imunofluorescência.
    3. As seções podem ser armazenadas a -80 °C para uso posterior.

8. Coloração de imunofluorescência

  1. Secar lâminas congeladas à temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Isole a seção com uma caneta bloqueadora de líquidos e seque em temperatura ambiente por 5 min.
  3. Reidrate as seções com 150 μL de PBS por 10 min.
  4. Coloque as lâminas em uma superfície plana e adicione 150 μL de albumina de soro bovino a 1% (BSA) diluída com PBS por seção nas lâminas. Incube em temperatura ambiente por 45 min para bloqueio.
  5. Adicione 150 μL de solução de anticorpo primário (anticorpo anti-Wilms Tumor 1 (WT1), diluído a 1:100 com 1% de BSA; anticorpo anti-Na-K-2Cl cotransportador 2 (NKCC2), diluído a 1:100 com 1% de BSA; ou anticorpo anti-aquaporina 2 (AQP2), diluído a 1:100 com 1% de BSA) e incube a 4 ° C durante a noite sob uma câmara úmida.
  6. Lave as seções com PBS em temperatura ambiente por 5 min, 3 vezes.
  7. Adicione 150 μL de anticorpo secundário (anticorpo anti-IgG Alexa Fluor 647 de coelho, diluído a 1:500 com 1% de BSA) e Lotus tetragonolobus lectina (LTL)-fluoresceína (diluído a 1:200 com 1% de BSA) e incube em temperatura ambiente por 60 min.
  8. Lave as seções com PBS em temperatura ambiente por 5 min.
  9. Coloque as lâminas em uma superfície plana e adicione 150 μL de Hoechst 33342 (diluído a 1:10.000 com PBS) para coloração nuclear. Incubar em temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.
  10. Lave as seções com PBS em temperatura ambiente por 5 min.
  11. Monte as lâminas com 20 μL do meio de montagem e uma lamínula. Mantenha as lâminas no escuro a 4 °C até que a imagem seja realizada.

9. Extração de DNA do tecido

  1. Extração de DNA de tecidos usando um kit disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
    1. Transfira o tecido para um tubo de esferas de cerâmica e adicione 400 μL de tampão de extração de DNA (100 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 1% de SDS e 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0).
    2. Homogeneizar o tecido a uma velocidade de 5 m/s durante 20 s em 3 ciclos utilizando um homogeneizador.
    3. Centrifugue a 2.000 x g em temperatura ambiente por 2 min.
    4. Colete 200 μL do sobrenadante usando uma pipeta P200 e adicione 10 μL de solução de proteinase K (concentração final de 1 mg / mL).
    5. Misturar por vórtice durante 15 s e incubar a 55 °C durante 1 h.
    6. Adicione 200 μL de tampão de lise do kit de extração de DNA.
    7. Misturar por vórtice durante 15 s e incubar a 55 °C durante 15 min.
    8. Adicione 250 μL de etanol 100%.
    9. Misture por vórtice por 15 s e incube em temperatura ambiente por 5 min.
    10. Aplicar o lisado na coluna de rotação de extracção de ADN.
    11. Centrifugue a 6.000 x g em temperatura ambiente por 1 min.
    12. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL. Adicione 500 μL do primeiro tampão de lavagem do kit de extração de DNA.
    13. Centrifugue a 6.000 x g em temperatura ambiente por 1 min.
    14. Coloque a coluna giratória em um novo tubo de coleta. Adicione 500 μL do segundo tampão de lavagem do kit de extração de DNA.
    15. Centrifugue a 6.000 x g em temperatura ambiente por 1 min.
    16. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL. Adicione 500 μL de etanol 100%.
    17. Centrifugue a 6.000 x g em temperatura ambiente por 1 min.
    18. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL e centrifugue a 20.000 x g em temperatura ambiente por 3 min.
      NOTA: Esta etapa garante a secagem completa da membrana da coluna de rotação, pois o transporte de etanol para o eluato pode interferir nas aplicações a jusante.
    19. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de microcentrífuga de 1.5 mL. Adicione 35 μL de tampão de eluição do kit de extração de DNA à coluna de rotação.
      NOTA: O volume de eluato recuperado é normalmente cerca de 5 μL menor do que o volume de tampão de eluição inicialmente aplicado à coluna.
    20. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
    21. Centrifugue a 20.000 x g em temperatura ambiente por 1 min.
    22. Meça a concentração de DNA.
  2. Quantificação do número de cópias do genoma vetorial por PCR quantitativo (qPCR)
    1. Diluir o ADN extraído preparado no passo 9.1 até uma concentração de 25 ng/μl com água de qualidade molecular.
    2. Projetar um par de primers de qPCR para a quantificação do genoma do vetor (tdTomato foi usado neste estudo) e um par de primers de qPCR para o gene de referência de camundongo que será usado para quantificar os genomas diplóides nas amostras de DNA extraídas (o gene agouti de camundongo foi usado neste estudo).
      NOTA: As sequências de primers usadas neste estudo são as seguintes;
      tdTomato para a frente: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdtomato reverso: 5 ' - TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3 '
      cutia do rato para a frente: 5 ' - GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3 '
      agouti do rato reverso: 5 ' - TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3 '
    3. Para uma reação de qPCR de 25 μL, misture 4 μL de amostra de DNA diluído na etapa 9.2.1 (um total de 100 ng de DNA em uma mistura de reação de 25 μL), 12,5 μL de tampão de reação de qPCR 2x, 0,5 μL de primos diretos e reversos de 20 μM preparados na etapa 9.2.2 (concentração final de 400 nM de cada primer), e 7,5 μL de água de grau molecular.
    4. Meça a concentração de DNA dos padrões de plasmídeo para qPCR quatro vezes e determine o valor médio da concentração de DNA.
      NOTA: O plasmídeo circular superenrolado pAAV-CAG-tdTomato e um plasmídeo circular superenrolado contendo a sequência alvo de PCR derivada do gene agouti de camundongo foram usados para quantificação e normalização do genoma do vetor, respectivamente, neste estudo.
    5. Preparar uma série de diluições seriadas de 1:10 de padrões de ADN plasmidial cobrindo uma gama dinâmica de 106.
      NOTA: Cada amostra e padrão devem ser analisados pelo menos em duplicata.
    6. Realize qPCR usando as seguintes condições de ciclo térmico: uma etapa inicial de ativação de calor a 95 ° C por 10 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 15 s e recozimento / extensão a 60 ° C por 30 s.
    7. Depois de completar a reação de qPCR e obter os valores do número de cópias de fita dupla (ds) dos genomas do vetor e do gene de referência do camundongo nas amostras, determine o número de cópias do genoma do vetor ds por equivalente genômico diplóide (ds-vg/dge) normalizando os números de cópias do genoma do vetor ds para o número de cópias do gene de referência em cada amostra com base em curvas padrão geradas a partir de concentrações conhecidas do genoma do vetor e do gene de referência.
      NOTA: Ds-vg/dge pode ser determinado com base na seguinte aproximação de que 100 ng de DNA genômico de camundongo representam 16.900 células de camundongo diplóides (2N) (ou seja, 5,92 pg de DNA por célula de camundongo diplóide).

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Resultados

Um estudo recente identificou um pequeno subconjunto de capsídeos de AAV que exibe notável aumento da transdução renal em comparação com AAV9 após injeção de RP38. O subconjunto identificado inclui AAV-KP3, um capsídeo quimérico de AAV gerado por embaralhamento de DNA41. Portanto, AAV-KP3 foi escolhido para injeção de RP neste estudo, juntamente com AAV9 como referência. AAV9-CAG-tdVetor de tomate (AAV9) e AAV-KP3-CAG-tdVetor de tomate (KP3...

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Discussão

Este relatório detalhou a injeção retrógrada lenta de RP de vetores AAV como um método de administração local para entrega de genes ao rim de camundongos. Um passo crítico para realizar a injeção de RP com segurança é o ajuste da taxa de injeção dos vetores AAV para evitar danos ao parênquima nos rins injetados. Em um relatório anterior sobre injeção hidrodinâmica da pelve renal, 100 μL de solução de DNA plasmidial foram injetados no rim do camundongo em apenas 3 s24

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Divulgações

H.N. recebe royalties de tecnologias relacionadas ao AAV licenciadas pela Takara Bio Inc. e Capsigen Inc., atua como consultor para empresas de biotecnologia, é cofundador da Capsigen Inc. e detém ações da Capsigen Inc. e da Sphere Gene Therapeutics.

Agradecimentos

Agradecemos a Guangping Gao e James M. Wilson por nos fornecerem o plasmídeo auxiliar de AAV9 e Katja Pekrun e Mark A. Kay pelo plasmídeo auxiliar de AAV-KP3.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 µm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1,5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-methylbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7,5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975A marker for collecting duct cells
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401A marker for thick ascending limb
cells
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901A marker for podocytes
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29,9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Clamp for the renal artery and renal
vein
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4,5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2A marker for proximal tubules
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgesic
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Inner diameter: 0,28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polyethylene Glycol 800

Referências

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