Artigo de método

Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina

DOI:

10.3791/67727

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7 de fevereiro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O modelo de lesão da medula óssea murina é uma ferramenta útil para estudar a osteogênese pós-natal por ossificação intramembranosa. Este protocolo cirúrgico simplificado descreve o procedimento de ablação da medula óssea para avaliação a jusante da nova formação óssea e respostas celulares após a lesão.

Resumo

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As lesões ósseas longas cicatrizam por meio de vias de formação óssea endocondral ou intramembranosa. Ao contrário da via endocondral que requer um molde de cartilagem, o processo de ossificação intramembranosa envolve a conversão direta de células-tronco esqueléticas e progenitoras (SSPCs) em osteoblastos formadores de osso. Existem métodos cirúrgicos limitados para modelar esse processo em camundongos experimentais. Aqui, aprimoramos um modelo de lesão da medula óssea em camundongos para facilitar o estudo do reparo ósseo por ossificação intramembranosa e avaliar os reguladores pós-natais da osteogênese. Este método é altamente reprodutível e fácil de usar, e permite a avaliação temporal da nova formação óssea em um curto período (3-7 dias pós-lesão) usando microtomografia computadorizada (μCT) e histologia de congelação. Além disso, as contribuições de SSPCs e osteoblastos maduros podem ser prontamente avaliadas usando uma combinação de camundongos repórteres fluorescentes e este modelo de lesão intramembranosa da medula óssea. Em contextos clínicos, a formação óssea intramembranosa é relevante para a cicatrização de defeitos de tamanho crítico, fraturas estabilizadas, defeitos corticais, traumas de ressecções tumorais e substituições articulares.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As lesões ósseas longas cicatrizam através da via de formação óssea endocondral ou intramembranosa. Ao contrário da via endocondral, que requer uma etapa precursora da cartilagem, o reparo ósseo por ossificação intramembranosa envolve a conversão direta de células-tronco e progenitoras esqueléticas (SSPCS) em osteoblastos formadores de osso1. Clinicamente, esse processo é relevante para a cicatrização óssea em uma variedade de contextos, incluindo defeitos de tamanho crítico, fraturas estabilizadas, defeitos corticais, osteogênese por distração, trauma de ressecções tumorais e osseointegração de implantes de substituição de articulações 2,3. Curiosamente, em estudos de pacientes com fraturas de ossos longos, 66%-82% tiveram fraturas desviadas, o que exigiu dispositivos de fixação para estabilizar o osso 4,5. Esses ossos rigidamente estabilizados cicatrizam principalmente por ossificação intramembranosa, pois as extremidades ósseas quebradas entram em contato direto umas com as outras 6,7. No entanto, a regulação mecanicista da regeneração óssea intramembranosa permanece relativamente pouco estudada em comparação com a formação óssea pelas vias endocondrais. As terapias aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para aumentar a cicatrização óssea são prejudicadas pela eficácia clínica limitada e altos custos e estão associadas a efeitos adversos significativos8.

A ablação mecânica da medula óssea fornece um modelo valioso para estudar a formação óssea intramembranosa. Este modelo de lesão simples permite estudar a regeneração óssea na medula óssea sem interromper o osso cortical. Após a ablação da MO, o processo de cicatrização envolve fases distintas, mas sobrepostas. A fase inicial ocorre nos primeiros 1 a 5 dias e envolve a formação de coágulos e inflamação, onde células inflamatórias e citocinas iniciam a cicatrização. Do 3º ao 14º dia, a segunda fase é caracterizada pela regeneração, incluindo neovascularização, migração e proliferação de células-tronco mesenquimais (CTM), diferenciação osteoblástica e formação óssea tecida. A fase final de remodelação inicia-se aproximadamente 10 dias após a cirurgia, com o tecido ósseo passando por maturação e reestruturação até que a medula seja totalmente restaurada até o 56ºdia9. Essa linha do tempo de cicatrização rápida torna o modelo de ablação de MO ideal para estudar as respostas iniciais de reparo ósseo, particularmente durante os períodos críticos de inflamação, recrutamento de células progenitoras e diferenciação de osteoblastos. Usando técnicas como histologia, citometria de fluxo e análise quantitativa de μCT, as respostas celulares e a formação óssea nos estágios iniciais de reparo podem ser avaliadas. Usando as técnicas acima mencionadas, o modelo de ablação de MO pode fornecer informações sobre os mecanismos de regeneração óssea intramembranosa e ajudar na identificação de alvos terapêuticos importantes para melhorar a cicatrização óssea.

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Protocolo

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Os procedimentos a seguir foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Saúde da Universidade de Connecticut (IACUC). Todas as cirurgias foram realizadas em condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do National Institutes of Health (NIH). A dor e o risco de infecções foram controlados com analgésicos e antissépticos adequados para garantir um resultado bem-sucedido.

1. Preparação da área cirúrgica e dos instrumentos

  1. Prepare a sala de procedimentos cirúrgicos desinfetando as superfícies de trabalho com um limpador desinfetante de nível clínico.
    NOTA: O cirurgião deve usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo luvas descartáveis estéreis, touca de cabelo, avental e máscara.
  2. Prepare uma almofada de aquecimento coberta com uma almofada cirúrgica estéril. Reúna e organize todos os instrumentos e reagentes estéreis (Tabela de Materiais) com acesso conveniente.

2. Anestesia pré-operatória

  1. Pese todos os camundongos antes da cirurgia. Calcule os volumes de analgésico a serem usados com base na formulação disponível de buprenorfina.
  2. Monte uma unidade de anestesia animal dentro do espaço de trabalho estéril, que inclui uma câmara de indução e um conjunto nariz-cone. Defina a saída de oxigênio para 2 L min-1 e o isoflurano para 1,5-3% (v / v), dependendo da idade e do peso do camundongo.
  3. Assim que o camundongo estiver sedado, remova o animal da câmara de indução e coloque-o em uma almofada cirúrgica estéril na posição supina. Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos. Coloque o cone do nariz sobre a cabeça. Verifique se o mouse está adequadamente anestesiado beliscando suavemente o dedo do pé. Certifique-se de que não haja resposta reflexa dos membros posteriores antes de prosseguir.
  4. Antes da cirurgia, remova brevemente o camundongo do cone do nariz para injetar a dose total de buprenorfina de liberação prolongada por via subcutânea; A dose total é de 3,25 mg/kg.

3. Descrição do procedimento cirúrgico

NOTA: Este procedimento cirúrgico utiliza camundongos machos e fêmeas C57BL/6 com idade entre 10 semanas e 24 semanas. O procedimento pode ser realizado em camundongos de 6 semanas a 33 semanas de idade e em várias linhagens endogâmicas, como mostrado por outros10,11. Camundongos mais jovens podem exigir comprimentos de agulha mais curtos, enquanto camundongos mais velhos ou maiores podem exigir uma agulha mais longa.

  1. Encha uma seringa de 3 ml equipada com uma agulha de 26 G com soro fisiológico estéril. Coloque isso de lado.
  2. Remova o pelo do membro posterior no qual o procedimento será realizado com tesouras elétricas ou operadas por bateria (lâmina # 40) e remova qualquer pelo solto do campo cirúrgico. Usando aplicadores estéreis com ponta de algodão, trate o local da cirurgia com uma esfoliação à base de iodo (10% de iodopovidona), seguida de álcool isopropílico a 70%. Esfregue o local da cirurgia começando no centro do joelho e fazendo uma varredura circular para fora. Deixe o local secar. Repita as etapas de lavagem 3 vezes.
  3. Coloque o mouse de costas e flexione o joelho da perna operativa. Segure a perna do mouse com a mão não dominante de forma que o joelho fique dobrado sobre o dedo médio, o segundo dedo apoiado no fêmur e o polegar apoiado na tíbia.
  4. Faça uma incisão horizontal pequena e rasa logo abaixo da patela usando um bisturi.
    NOTA: Esta etapa melhora a visualização do local de inserção. Com a experiência, esta etapa pode ser ignorada.
  5. Localize o espaço articular colocando a agulha horizontalmente sobre o joelho dobrado e sentindo o espaço entre o fêmur e a tíbia. Usando este local anatômico para guiar, pegue uma agulha de 25 G e perfure manualmente (torcendo a agulha e aplicando simultaneamente pressão moderada na agulha) no fêmur distal do joelho em direção ao lado proximal. Insira a agulha através ou ao redor da patela.
  6. Faça um raio-X do mouse para garantir que a agulha tenha sido colocada adequadamente na cavidade medular, o mais próximo possível do centro (Figura 1).
  7. Remova a agulha de 25 G e insira imediatamente uma agulha de 26 G no mesmo orifício dentro da cavidade da medula. Alargar as laterais da cavidade medular em movimentos circulares pelo menos 5 vezes até ficar lisa. Mantenha o número de movimentos de alargamento consistente entre cada mouse.
    NOTA: As etapas 3.5 e 3.7 podem causar ferimentos com agulhas no cirurgião se não forem manuseadas com cuidado.
  8. Remova a agulha 26 G e substitua a agulha 26 G conectada à seringa salina. Lave a cavidade até que o refluxo fique limpo. Isso normalmente requer 1,5-2 mL de solução salina. Remova a seringa e a agulha e descarte-as com segurança em um recipiente pontiagudo.
    NOTA: Não deve haver resistência ao empurrar o fluido. Em caso afirmativo, reinsira a agulha para garantir que ela esteja dentro da cavidade. Pode ser necessário puxar a agulha até a metade.
  9. Feche a ferida na pele usando uma sutura adesiva tópica.

4. Cuidados pós-operatórios

  1. Imediatamente após a cirurgia, administre a meia dose restante de buprenorfina de liberação prolongada usando a dosagem da etapa 2.4.
    NOTA: A buprenorfina de liberação prolongada proporciona alívio da dor por até 72 h.
  2. Monitore os animais na almofada de aquecimento em busca de sinais de respiração normal e desobstruída até que eles despertem da cirurgia. Uma vez ambulatório, devolva os ratos à gaiola.
  3. Continue monitorando os camundongos uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para garantir que eles estejam cicatrizando adequadamente e tenham mobilidade total, observando sinais de dor.

5. Processamento de ossos para varredura e análise de μCT

  1. Eutanásia dos camundongos de acordo com o método de eutanásia humana regulamentado e aprovado pela IACUC ou outra política institucional aplicável. Aqui, foi utilizado o método primário de eutanásia por inalação de CO2 , seguido por um método secundário de luxação cervical.
  2. Colha os fêmures descascando a pele ao redor dos membros posteriores e removendo todo o membro na articulação do quadril.
  3. Coloque cada membro entre duas esponjas em um de incorporação. Transfira os ossos de seus para uma solução de formalina a 10% e fixe-os a 4 °C por 5-7 dias, considerando a idade e o tamanho do camundongo.
    NOTA: Tanto a fixação excessiva quanto a subfixação resultam em baixa resolução da medula.
  4. Após a fixação, lave os em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min 3 vezes.
  5. Remova os membros dos e corte o músculo usando um bisturi, conforme necessário.
    NOTA: Dependendo das aplicações a jusante, o manuseio brusco pode interromper a camada periosteal do osso.
  6. Separe o fêmur no joelho cortando cuidadosamente os ligamentos usando uma pequena tesoura cirúrgica ou um bisturi.
    NOTA: As tíbias podem ser usadas para outras aplicações ou descartadas.
  7. Transfira os fêmures para tubos cônicos de 1,7 mL ou 15 mL para uma solução de etanol a 70%. Os ossos podem permanecer em etanol a 70% a 4 °C até que estejam prontos para a tomografia computadorizada μCT.
  8. Escanear e avaliar os fêmures quanto aos parâmetros trabeculares, produzindo dados qualitativos e quantitativos.

6. Processamento de ossos para seccionamento congelado e histologia

NOTA: Os ossos podem ser processados para seccionamento congelado e histologia após serem submetidos à varredura de μCT. A varredura não afeta a marcação fluorescente ou a coloração subsequente de anticorpos.

  1. Transfira os ossos do etanol 70% para PBS e lave 3 vezes, 5 min por lavagem.
  2. Incubar numa série de soluções de sacarose de 10%, 20% a 30% em PBS a 4 °C durante a noite em cada concentração. Armazene os ossos em sacarose a 30% por até 5 dias a 4 ° C ou nesta solução a -20 ° C por 6-12 meses até que estejam prontos para incorporação.
    NOTA: O uso de um gradiente de sacarose resulta em melhor penetração do tecido. Após a etapa 6.1, os ossos podem ser colocados diretamente em uma solução de sacarose a 30% durante a noite.
  3. Incorpore ossos em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) usando moldes de crioincorporação. Conservar a -80 °C até estar pronto para seccionar.
  4. Corte os ossos embutidos usando o método de fita de criofilme com temperatura de criostato ajustada entre -24 °C e -26 °C.
  5. Cole as seções do filme criogênico em uma lâmina adesiva usando adesivo óptico e cure-o até endurecer usando um reticulador ultravioleta (UV).

7. Processamento para citometria de fluxo

NOTA: Este protocolo é compatível com uma variedade de anticorpos. Para caracterizar células-tronco esqueléticas e progenitoras, recomenda-se agrupar 3-4 ossos, pois são populações de células raras na medula óssea.

  1. Prepare meios de coloração (FSM) de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Para fazer 1000 mL de solução de FSM, combine: 100 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS), 10 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 20 mL de soro fetal bovino (FBS), 870 mL de dd H2O. Passe a solução FSM por um filtro de 0,2 μm.
  2. Antes de colher o tecido, encha as placas de Petri com 4-5 mL de PBS estéril sem cálcio e magnésio.
  3. Prepare o meio de digestão
    1. Para cada 4-6 fêmures, prepare uma mistura de digestão em 10 mL de PBS contendo 0,005 g de colagenase P e 0,02 g de hialuronidase. Misturar por vórtice suave e passar a mistura através de um filtro de 0,22 μm.
  4. Colha os ossos no dia 3 pós-operatório, conforme descrito na etapa 5.2. Remova todo o músculo e tecido conjuntivo com uma lâmina de bisturi.
  5. Encha uma placa de Petri com 5 mL de meio de digestão. Coloque 4-6 ossos no meio de digestão. Pique cada osso finamente, fazendo o primeiro corte longitudinal e lateralmente.
  6. Transfira o tecido para um tubo de fundo redondo de 14 mL e sele com parafilme. Cubra os tubos em folha de alumínio.
  7. Agite a 37 °C durante 20 minutos, mantendo o tubo horizontalmente no agitador.
  8. Remova o tubo do agitador. As células serão agrupadas na parte inferior. Recolha suavemente o material digerido sem perturbar as células no fundo e passe o digerido através de um filtro de 70 μm. Colete o filtrado em um novo tubo de 50 mL contendo 10 mL de FSM frio e mantenha-o no gelo.
  9. Às células, adicione os 5 mL restantes da mistura de digestão. Sele novamente com parafilme e cubra com papel alumínio. Agite o tubo conforme descrito acima. Repita as etapas 7.7 a 7.8.
  10. Após 20 min de incubação a 37 °C, transferir o digesto para o mesmo tubo que contém o digest do passo 7.8, passando através de um filtro de 70 μm com mais 10 ml de FSM.
  11. Centrifugar a suspensão a 274 x g a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e recolher o sedimento celular. Desaloje o pellet batendo suavemente no tubo.
    NOTA: A força centrífuga (g) é baseada em um raio de rotor de 170 mm. Verifique o raio do rotor e ajuste a velocidade de acordo.
  12. Para realizar a lise dos glóbulos vermelhos, adicione 1 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK). Mantenha todos os reagentes e células no gelo.
  13. Incube as células em ACK por cerca de 5 min em RT. Não exceda 5 min para evitar a lisura excessiva das células.
  14. Adicione 9 mL de FSM. Centrifugue a 274 x g durante 5 min a 4 °C.
  15. Aspire o sobrenadante. Quebre o pellet celular varrendo suavemente o tubo em um suporte para tubos.
  16. Adicione 10 mL de FSM (volume para 4 ossos, pode ser ajustado com base em quantos ossos estão combinados) e ressuspenda.
  17. Pegue uma alíquota de cada amostra e adicione iodeto de propídio (PI) de acordo com as instruções do fabricante. Conte células ativas e totais com um contador de células.
  18. Prossiga com a coloração de anticorpos das amostras usando os marcadores desejados para análise de citometria de fluxo 12,13,14.

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Resultados

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O sucesso do procedimento mecânico de ablação da medula óssea (MO) foi validado por radiografia, enquanto a agulha 26G foi inserida na cavidade medular (Figura 2A). Quando a imagem de raios-X indicou que a agulha foi inserida em um ângulo impróprio ou penetrou através do osso, a agulha foi reinserida no ângulo adequado e refeita para confirmar o posicionamento preciso. Quando uma posição de sucesso não pôde ser alcançada, o animal foi excluído da análise. Embora a imagem radiográfica bidimen...

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Discussão

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O objetivo era estabelecer um método confiável e reprodutível para estudar os processos moleculares e celulares que regem o reparo ósseo, com foco na conversão direta de células-tronco esqueléticas e progenitoras (SSPCs) em osteoblastos depositadores ósseos no espaço/cavidade da medula óssea. O método de ablação mecânica da medula óssea aqui descrito é um protocolo otimizado e validado para ablação da medula óssea por lesão mecânica, que permite a investigação da formação óssea intramemb...

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Divulgações

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Os autores não têm divulgações a relatar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O financiamento foi fornecido pelo NIH / NIDCR R01-DE030716-01 e NIH / NIAMS R01-DE030716-01S1 para AS, NIH / NIAMS R01AR080131 para RG e UConn REP Convergence Grant para RG e AS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Formalina a 10% Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 in Agulha Hipodérmica Air-tite EZ FloAit Tite/ Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Agulhas Hipodérmicas DescartáveisExel International/ Fisher Scientific14-840-83; ref #26402Qualquer agulha de 26 G pode ser substituída, deve ser destacável da seringa 
Seringa Estéril de 3 mLFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Almofada EstérilMcKesson/ Fisher ScientificNC0593755Alternativamente, pode usar almofadas absorventes autoclaváveis 
Ácido Acético,Milipore Glacial SigmaAX0073Precisa ser diluído para 1%
Cloreto de Amônio-Potássio (ACK) Tampão de LiseGibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Usado para lise de glóbulos vermelhos em preparação para citometria de fluxo 
Câmara de Indução de Anestesia 2 LVetEquip941444
Solução de Betadine (Providona-Iodo)Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
Buprenorfina HCL Injeção 0.3 mg/mL Genérico/ Covetrus59122Deve obter licença estadual e federal da DEA para comprar substância controlada
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenase P Roche11249002001Usado para digerir
cotonetes de osso e AplicadoresFisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Cryofilm Tipo II C(10), Laboratório de Seção de 3,5 cm, JapãoCFS 105
DAPI Abcamab228549
Balança DigitalToprime/ AmazonB06X6LW4V9Pode usar qualquer marca de balança para pesar ratos
Pinça de Dissecação Marca Fisher/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Tesoura de Dissecação Marca Fisher/ Fisher Scientific 08-940
Lâminas de criostato/micrótomoEndure Tanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorfina de liberação prolongada 1,3 mg/mLEthiqa XR/ Cevetrus72117Deve obter licença estadual e federal da DEA para compra de substância controlada
Fast Green, 0,2%Electron Miscroscopy Sciences EMS50-319-57
Fetal Bovine Serum heat Gibco/ Thermo Fisher Scientific A5256801Usado para fazer Mídia de Coloração FACS (FSM)
Solução de Montagem Fluoromount-G Biotecnologia do Sul 0100-01
GLUSEAL Adesivo Tópico para Pele AD Surgical GLU-550
Cabra anti-Coelho Alexa 647Thermo FisherA21244Diluição 1:300
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific14065056Usado para fazer Mídia de Coloração FACS (FSM)
Almofada de Aquecimento (grande)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXPode usar qualquer almofada de aquecimento de marca, remova a capa de pano 
HematoxilinaMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
HialuronidaseMilliporeSigmaHX0514Usado para digerir ossos
Sistema de Anestesia Animal IsofluranoVetEquip901810
KUBTEC Parâmetro 2D Sistema de RaiosX OncoMed SolutionsN/AQualquer sistema de imagem de gabinete de raios X pode ser usado
Microcentrífuga TubosCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Vidro de Cobertura para Microscópio, 18 mm x 18 mm, Espessura # 1 GlobeScientific1414-10
N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfônico HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Usado para fazer Mídia de Coloração FACS (FSM)
Adesivo óptico Norland NO61Edmund Optical37-322Usado para aderir seções de criofilme a uma lâmina 
Anticorpo Monoclonal Coelho Osterix Abcamab209484diluição 1:500
Peroxigard Pronto para Uso Desinfetante de Uma EtapaVirox Technologies29101Pode ser substituído por qualquer outro desinfetante de grau clínico/laboratorial
Iodeto de Propídio (PI) Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific P1304MPMancha fluorescente nuclear usada para detectar células mortas para contagens de viabilidade
Aparador elétrico recarregávelWahl/ AmazonB001FWXKUEQualquer aparador pode ser usado, um aparador de tamanho menor facilitará a depilação de animais menores
Cone de nariz de roedorVetEquipar921609
Safranin O, 85% puro, certificadoFisher ScientificAC419211000
O quadrado de Seal'N Freeze Cryotray moldao elétron Miscroscopy Sciences EMS62642-01Usado para encaixar, outros moldes de encaixe podem ser usados. Este modelo específico tem um molde mais profundo, bem como uma tampa para selar o bloco 
Nitrato de prataSigma AldrichS6506Nitrato de prata para coloração de von Kossa
Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS)Gibco / Thermo Fisher Scientific10010023Alternativamente, PBS recém-preparado que foi filtrado e autoclavado pode ser usado
Bisturis padrão estéreisIntegra Miltex / Fisher Scientific12-460-455
Bisturispadrão estéreisIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sucrose em Pó 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A1
Superfrost Plus Lâminas de MiscroscópioFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Lâminas adesivas
Sure-Tek Casettes de Processamento/ Incorporação de TecidosFisherbrand Histosette/ Fisher Scientific22-048-141
Tecido Plus Temperatura de Corte Ótima O.C.T Composto FisherScientific23-730-571
Esponjas de TecidoEpredia/ Fisher Scientific84-53As esponjas de tecido protegem os tecidos de excesso de processamento 
Toluidina AzulFisher AC348600050
Solução de Coloração de perfil baixo inativado; Científica

Referências

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