O modelo de lesão da medula óssea murina é uma ferramenta útil para estudar a osteogênese pós-natal por ossificação intramembranosa. Este protocolo cirúrgico simplificado descreve o procedimento de ablação da medula óssea para avaliação a jusante da nova formação óssea e respostas celulares após a lesão.
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Artigo de método
Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina
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Resumo
Resumo
As lesões ósseas longas cicatrizam por meio de vias de formação óssea endocondral ou intramembranosa. Ao contrário da via endocondral que requer um molde de cartilagem, o processo de ossificação intramembranosa envolve a conversão direta de células-tronco esqueléticas e progenitoras (SSPCs) em osteoblastos formadores de osso. Existem métodos cirúrgicos limitados para modelar esse processo em camundongos experimentais. Aqui, aprimoramos um modelo de lesão da medula óssea em camundongos para facilitar o estudo do reparo ósseo por ossificação intramembranosa e avaliar os reguladores pós-natais da osteogênese. Este método é altamente reprodutível e fácil de usar, e permite a avaliação temporal da nova formação óssea em um curto período (3-7 dias pós-lesão) usando microtomografia computadorizada (μCT) e histologia de congelação. Além disso, as contribuições de SSPCs e osteoblastos maduros podem ser prontamente avaliadas usando uma combinação de camundongos repórteres fluorescentes e este modelo de lesão intramembranosa da medula óssea. Em contextos clínicos, a formação óssea intramembranosa é relevante para a cicatrização de defeitos de tamanho crítico, fraturas estabilizadas, defeitos corticais, traumas de ressecções tumorais e substituições articulares.
Introdução
As lesões ósseas longas cicatrizam através da via de formação óssea endocondral ou intramembranosa. Ao contrário da via endocondral, que requer uma etapa precursora da cartilagem, o reparo ósseo por ossificação intramembranosa envolve a conversão direta de células-tronco e progenitoras esqueléticas (SSPCS) em osteoblastos formadores de osso1. Clinicamente, esse processo é relevante para a cicatrização óssea em uma variedade de contextos, incluindo defeitos de tamanho crítico, fraturas estabilizadas, defeitos corticais, osteogênese por distração, trauma de ressecções tumorais e osseointegração de implantes de substituição de articulações 2,3. Curiosamente, em estudos de pacientes com fraturas de ossos longos, 66%-82% tiveram fraturas desviadas, o que exigiu dispositivos de fixação para estabilizar o osso 4,5. Esses ossos rigidamente estabilizados cicatrizam principalmente por ossificação intramembranosa, pois as extremidades ósseas quebradas entram em contato direto umas com as outras 6,7. No entanto, a regulação mecanicista da regeneração óssea intramembranosa permanece relativamente pouco estudada em comparação com a formação óssea pelas vias endocondrais. As terapias aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para aumentar a cicatrização óssea são prejudicadas pela eficácia clínica limitada e altos custos e estão associadas a efeitos adversos significativos8.
A ablação mecânica da medula óssea fornece um modelo valioso para estudar a formação óssea intramembranosa. Este modelo de lesão simples permite estudar a regeneração óssea na medula óssea sem interromper o osso cortical. Após a ablação da MO, o processo de cicatrização envolve fases distintas, mas sobrepostas. A fase inicial ocorre nos primeiros 1 a 5 dias e envolve a formação de coágulos e inflamação, onde células inflamatórias e citocinas iniciam a cicatrização. Do 3º ao 14º dia, a segunda fase é caracterizada pela regeneração, incluindo neovascularização, migração e proliferação de células-tronco mesenquimais (CTM), diferenciação osteoblástica e formação óssea tecida. A fase final de remodelação inicia-se aproximadamente 10 dias após a cirurgia, com o tecido ósseo passando por maturação e reestruturação até que a medula seja totalmente restaurada até o 56ºdia9. Essa linha do tempo de cicatrização rápida torna o modelo de ablação de MO ideal para estudar as respostas iniciais de reparo ósseo, particularmente durante os períodos críticos de inflamação, recrutamento de células progenitoras e diferenciação de osteoblastos. Usando técnicas como histologia, citometria de fluxo e análise quantitativa de μCT, as respostas celulares e a formação óssea nos estágios iniciais de reparo podem ser avaliadas. Usando as técnicas acima mencionadas, o modelo de ablação de MO pode fornecer informações sobre os mecanismos de regeneração óssea intramembranosa e ajudar na identificação de alvos terapêuticos importantes para melhorar a cicatrização óssea.
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Protocolo
Os procedimentos a seguir foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Saúde da Universidade de Connecticut (IACUC). Todas as cirurgias foram realizadas em condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do National Institutes of Health (NIH). A dor e o risco de infecções foram controlados com analgésicos e antissépticos adequados para garantir um resultado bem-sucedido.
1. Preparação da área cirúrgica e dos instrumentos
- Prepare a sala de procedimentos cirúrgicos desinfetando as superfícies de trabalho com um limpador desinfetante de nível clínico.
NOTA: O cirurgião deve usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo luvas descartáveis estéreis, touca de cabelo, avental e máscara. - Prepare uma almofada de aquecimento coberta com uma almofada cirúrgica estéril. Reúna e organize todos os instrumentos e reagentes estéreis (Tabela de Materiais) com acesso conveniente.
2. Anestesia pré-operatória
- Pese todos os camundongos antes da cirurgia. Calcule os volumes de analgésico a serem usados com base na formulação disponível de buprenorfina.
- Monte uma unidade de anestesia animal dentro do espaço de trabalho estéril, que inclui uma câmara de indução e um conjunto nariz-cone. Defina a saída de oxigênio para 2 L min-1 e o isoflurano para 1,5-3% (v / v), dependendo da idade e do peso do camundongo.
- Assim que o camundongo estiver sedado, remova o animal da câmara de indução e coloque-o em uma almofada cirúrgica estéril na posição supina. Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos. Coloque o cone do nariz sobre a cabeça. Verifique se o mouse está adequadamente anestesiado beliscando suavemente o dedo do pé. Certifique-se de que não haja resposta reflexa dos membros posteriores antes de prosseguir.
- Antes da cirurgia, remova brevemente o camundongo do cone do nariz para injetar a dose total de buprenorfina de liberação prolongada por via subcutânea; A dose total é de 3,25 mg/kg.
3. Descrição do procedimento cirúrgico
NOTA: Este procedimento cirúrgico utiliza camundongos machos e fêmeas C57BL/6 com idade entre 10 semanas e 24 semanas. O procedimento pode ser realizado em camundongos de 6 semanas a 33 semanas de idade e em várias linhagens endogâmicas, como mostrado por outros10,11. Camundongos mais jovens podem exigir comprimentos de agulha mais curtos, enquanto camundongos mais velhos ou maiores podem exigir uma agulha mais longa.
- Encha uma seringa de 3 ml equipada com uma agulha de 26 G com soro fisiológico estéril. Coloque isso de lado.
- Remova o pelo do membro posterior no qual o procedimento será realizado com tesouras elétricas ou operadas por bateria (lâmina # 40) e remova qualquer pelo solto do campo cirúrgico. Usando aplicadores estéreis com ponta de algodão, trate o local da cirurgia com uma esfoliação à base de iodo (10% de iodopovidona), seguida de álcool isopropílico a 70%. Esfregue o local da cirurgia começando no centro do joelho e fazendo uma varredura circular para fora. Deixe o local secar. Repita as etapas de lavagem 3 vezes.
- Coloque o mouse de costas e flexione o joelho da perna operativa. Segure a perna do mouse com a mão não dominante de forma que o joelho fique dobrado sobre o dedo médio, o segundo dedo apoiado no fêmur e o polegar apoiado na tíbia.
- Faça uma incisão horizontal pequena e rasa logo abaixo da patela usando um bisturi.
NOTA: Esta etapa melhora a visualização do local de inserção. Com a experiência, esta etapa pode ser ignorada. - Localize o espaço articular colocando a agulha horizontalmente sobre o joelho dobrado e sentindo o espaço entre o fêmur e a tíbia. Usando este local anatômico para guiar, pegue uma agulha de 25 G e perfure manualmente (torcendo a agulha e aplicando simultaneamente pressão moderada na agulha) no fêmur distal do joelho em direção ao lado proximal. Insira a agulha através ou ao redor da patela.
- Faça um raio-X do mouse para garantir que a agulha tenha sido colocada adequadamente na cavidade medular, o mais próximo possível do centro (Figura 1).
- Remova a agulha de 25 G e insira imediatamente uma agulha de 26 G no mesmo orifício dentro da cavidade da medula. Alargar as laterais da cavidade medular em movimentos circulares pelo menos 5 vezes até ficar lisa. Mantenha o número de movimentos de alargamento consistente entre cada mouse.
NOTA: As etapas 3.5 e 3.7 podem causar ferimentos com agulhas no cirurgião se não forem manuseadas com cuidado. - Remova a agulha 26 G e substitua a agulha 26 G conectada à seringa salina. Lave a cavidade até que o refluxo fique limpo. Isso normalmente requer 1,5-2 mL de solução salina. Remova a seringa e a agulha e descarte-as com segurança em um recipiente pontiagudo.
NOTA: Não deve haver resistência ao empurrar o fluido. Em caso afirmativo, reinsira a agulha para garantir que ela esteja dentro da cavidade. Pode ser necessário puxar a agulha até a metade. - Feche a ferida na pele usando uma sutura adesiva tópica.
4. Cuidados pós-operatórios
- Imediatamente após a cirurgia, administre a meia dose restante de buprenorfina de liberação prolongada usando a dosagem da etapa 2.4.
NOTA: A buprenorfina de liberação prolongada proporciona alívio da dor por até 72 h. - Monitore os animais na almofada de aquecimento em busca de sinais de respiração normal e desobstruída até que eles despertem da cirurgia. Uma vez ambulatório, devolva os ratos à gaiola.
- Continue monitorando os camundongos uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para garantir que eles estejam cicatrizando adequadamente e tenham mobilidade total, observando sinais de dor.
5. Processamento de ossos para varredura e análise de μCT
- Eutanásia dos camundongos de acordo com o método de eutanásia humana regulamentado e aprovado pela IACUC ou outra política institucional aplicável. Aqui, foi utilizado o método primário de eutanásia por inalação de CO2 , seguido por um método secundário de luxação cervical.
- Colha os fêmures descascando a pele ao redor dos membros posteriores e removendo todo o membro na articulação do quadril.
- Coloque cada membro entre duas esponjas em um de incorporação. Transfira os ossos de seus para uma solução de formalina a 10% e fixe-os a 4 °C por 5-7 dias, considerando a idade e o tamanho do camundongo.
NOTA: Tanto a fixação excessiva quanto a subfixação resultam em baixa resolução da medula. - Após a fixação, lave os em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min 3 vezes.
- Remova os membros dos e corte o músculo usando um bisturi, conforme necessário.
NOTA: Dependendo das aplicações a jusante, o manuseio brusco pode interromper a camada periosteal do osso. - Separe o fêmur no joelho cortando cuidadosamente os ligamentos usando uma pequena tesoura cirúrgica ou um bisturi.
NOTA: As tíbias podem ser usadas para outras aplicações ou descartadas. - Transfira os fêmures para tubos cônicos de 1,7 mL ou 15 mL para uma solução de etanol a 70%. Os ossos podem permanecer em etanol a 70% a 4 °C até que estejam prontos para a tomografia computadorizada μCT.
- Escanear e avaliar os fêmures quanto aos parâmetros trabeculares, produzindo dados qualitativos e quantitativos.
6. Processamento de ossos para seccionamento congelado e histologia
NOTA: Os ossos podem ser processados para seccionamento congelado e histologia após serem submetidos à varredura de μCT. A varredura não afeta a marcação fluorescente ou a coloração subsequente de anticorpos.
- Transfira os ossos do etanol 70% para PBS e lave 3 vezes, 5 min por lavagem.
- Incubar numa série de soluções de sacarose de 10%, 20% a 30% em PBS a 4 °C durante a noite em cada concentração. Armazene os ossos em sacarose a 30% por até 5 dias a 4 ° C ou nesta solução a -20 ° C por 6-12 meses até que estejam prontos para incorporação.
NOTA: O uso de um gradiente de sacarose resulta em melhor penetração do tecido. Após a etapa 6.1, os ossos podem ser colocados diretamente em uma solução de sacarose a 30% durante a noite. - Incorpore ossos em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) usando moldes de crioincorporação. Conservar a -80 °C até estar pronto para seccionar.
- Corte os ossos embutidos usando o método de fita de criofilme com temperatura de criostato ajustada entre -24 °C e -26 °C.
- Cole as seções do filme criogênico em uma lâmina adesiva usando adesivo óptico e cure-o até endurecer usando um reticulador ultravioleta (UV).
7. Processamento para citometria de fluxo
NOTA: Este protocolo é compatível com uma variedade de anticorpos. Para caracterizar células-tronco esqueléticas e progenitoras, recomenda-se agrupar 3-4 ossos, pois são populações de células raras na medula óssea.
- Prepare meios de coloração (FSM) de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Para fazer 1000 mL de solução de FSM, combine: 100 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS), 10 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 20 mL de soro fetal bovino (FBS), 870 mL de dd H2O. Passe a solução FSM por um filtro de 0,2 μm.
- Antes de colher o tecido, encha as placas de Petri com 4-5 mL de PBS estéril sem cálcio e magnésio.
- Prepare o meio de digestão
- Para cada 4-6 fêmures, prepare uma mistura de digestão em 10 mL de PBS contendo 0,005 g de colagenase P e 0,02 g de hialuronidase. Misturar por vórtice suave e passar a mistura através de um filtro de 0,22 μm.
- Colha os ossos no dia 3 pós-operatório, conforme descrito na etapa 5.2. Remova todo o músculo e tecido conjuntivo com uma lâmina de bisturi.
- Encha uma placa de Petri com 5 mL de meio de digestão. Coloque 4-6 ossos no meio de digestão. Pique cada osso finamente, fazendo o primeiro corte longitudinal e lateralmente.
- Transfira o tecido para um tubo de fundo redondo de 14 mL e sele com parafilme. Cubra os tubos em folha de alumínio.
- Agite a 37 °C durante 20 minutos, mantendo o tubo horizontalmente no agitador.
- Remova o tubo do agitador. As células serão agrupadas na parte inferior. Recolha suavemente o material digerido sem perturbar as células no fundo e passe o digerido através de um filtro de 70 μm. Colete o filtrado em um novo tubo de 50 mL contendo 10 mL de FSM frio e mantenha-o no gelo.
- Às células, adicione os 5 mL restantes da mistura de digestão. Sele novamente com parafilme e cubra com papel alumínio. Agite o tubo conforme descrito acima. Repita as etapas 7.7 a 7.8.
- Após 20 min de incubação a 37 °C, transferir o digesto para o mesmo tubo que contém o digest do passo 7.8, passando através de um filtro de 70 μm com mais 10 ml de FSM.
- Centrifugar a suspensão a 274 x g a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e recolher o sedimento celular. Desaloje o pellet batendo suavemente no tubo.
NOTA: A força centrífuga (g) é baseada em um raio de rotor de 170 mm. Verifique o raio do rotor e ajuste a velocidade de acordo. - Para realizar a lise dos glóbulos vermelhos, adicione 1 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK). Mantenha todos os reagentes e células no gelo.
- Incube as células em ACK por cerca de 5 min em RT. Não exceda 5 min para evitar a lisura excessiva das células.
- Adicione 9 mL de FSM. Centrifugue a 274 x g durante 5 min a 4 °C.
- Aspire o sobrenadante. Quebre o pellet celular varrendo suavemente o tubo em um suporte para tubos.
- Adicione 10 mL de FSM (volume para 4 ossos, pode ser ajustado com base em quantos ossos estão combinados) e ressuspenda.
- Pegue uma alíquota de cada amostra e adicione iodeto de propídio (PI) de acordo com as instruções do fabricante. Conte células ativas e totais com um contador de células.
- Prossiga com a coloração de anticorpos das amostras usando os marcadores desejados para análise de citometria de fluxo 12,13,14.
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Resultados
O sucesso do procedimento mecânico de ablação da medula óssea (MO) foi validado por radiografia, enquanto a agulha 26G foi inserida na cavidade medular (Figura 2A). Quando a imagem de raios-X indicou que a agulha foi inserida em um ângulo impróprio ou penetrou através do osso, a agulha foi reinserida no ângulo adequado e refeita para confirmar o posicionamento preciso. Quando uma posição de sucesso não pôde ser alcançada, o animal foi excluído da análise. Embora a imagem radiográfica bidimen...
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Discussão
O objetivo era estabelecer um método confiável e reprodutível para estudar os processos moleculares e celulares que regem o reparo ósseo, com foco na conversão direta de células-tronco esqueléticas e progenitoras (SSPCs) em osteoblastos depositadores ósseos no espaço/cavidade da medula óssea. O método de ablação mecânica da medula óssea aqui descrito é um protocolo otimizado e validado para ablação da medula óssea por lesão mecânica, que permite a investigação da formação óssea intramemb...
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Divulgações
Os autores não têm divulgações a relatar.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pelo NIH / NIDCR R01-DE030716-01 e NIH / NIAMS R01-DE030716-01S1 para AS, NIH / NIAMS R01AR080131 para RG e UConn REP Convergence Grant para RG e AS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de Formalina a 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 25 G 0.625 in Agulha Hipodérmica Air-tite EZ Flo | Ait Tite/ Fisher Scientific | 14-817-239; ref #NEZ25058 | |
| 26 G 1/2" Agulhas Hipodérmicas Descartáveis | Exel International/ Fisher Scientific | 14-840-83; ref #26402 | Qualquer agulha de 26 G pode ser substituída, deve ser destacável da seringa |
| Seringa Estéril de 3 mL | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 14-955-457 | |
| AB Almofada Estéril | McKesson/ Fisher Scientific | NC0593755 | Alternativamente, pode usar almofadas absorventes autoclaváveis |
| Ácido Acético, | Milipore Glacial Sigma | AX0073 | Precisa ser diluído para 1% |
| Cloreto de Amônio-Potássio (ACK) Tampão de Lise | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | A1049201 | Usado para lise de glóbulos vermelhos em preparação para citometria de fluxo |
| Câmara de Indução de Anestesia 2 L | VetEquip | 941444 | |
| Solução de Betadine (Providona-Iodo) | Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Buprenorfina HCL Injeção 0.3 mg/mL | Genérico/ Covetrus | 59122 | Deve obter licença estadual e federal da DEA para comprar substância controlada |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 206700-1MG | |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 | Usado para digerir |
| cotonetes de osso e Aplicadores | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 22-363-172 | |
| Cryofilm Tipo II C(10), Laboratório de Seção de 3,5 cm | , Japão | CFS 105 | |
| DAPI | Abcam | ab228549 | |
| Balança Digital | Toprime/ Amazon | B06X6LW4V9 | Pode usar qualquer marca de balança para pesar ratos |
| Pinça de Dissecação | Marca Fisher/ Fisher Scientific | 08-953E; 08-953F | |
| Tesoura de Dissecação | Marca Fisher/ Fisher Scientific | 08-940 | |
| Lâminas de criostato/micrótomo | Endure Tanner Scientific | TNR315LP | |
| Ethiqa XR Buprenorfina de liberação prolongada 1,3 mg/mL | Ethiqa XR/ Cevetrus | 72117 | Deve obter licença estadual e federal da DEA para compra de substância controlada |
| Fast Green, 0,2% | Electron Miscroscopy Sciences EMS | 50-319-57 | |
| Fetal Bovine Serum heat | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | A5256801 | Usado para fazer Mídia de Coloração FACS (FSM) |
| Solução de Montagem Fluoromount-G | Biotecnologia do Sul | 0100-01 | |
| GLUSEAL Adesivo Tópico para Pele | AD Surgical | GLU-550 | |
| Cabra anti-Coelho Alexa 647 | Thermo Fisher | A21244 | Diluição 1:300 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 14065056 | Usado para fazer Mídia de Coloração FACS (FSM) |
| Almofada de Aquecimento (grande) | Boncare/ Amazon | B0CLHSWXSX | Pode usar qualquer almofada de aquecimento de marca, remova a capa de pano |
| Hematoxilina | MilliporeSigma/ Fisher Scientific | M1051740500 | |
| Hialuronidase | MilliporeSigma | HX0514 | Usado para digerir ossos |
| Sistema de Anestesia Animal Isoflurano | VetEquip | 901810 | |
| KUBTEC Parâmetro 2D Sistema de Raios | X OncoMed Solutions | N/A | Qualquer sistema de imagem de gabinete de raios X pode ser usado |
| Microcentrífuga Tubos | Corning/ Thomas Scientific | 8600A52 | |
| Vidro de Cobertura para Microscópio, 18 mm x 18 mm, Espessura # 1 Globe | Scientific | 1414-10 | |
| N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfônico HEPES (1M) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 156300-80 | Usado para fazer Mídia de Coloração FACS (FSM) |
| Adesivo óptico Norland NO61 | Edmund Optical | 37-322 | Usado para aderir seções de criofilme a uma lâmina |
| Anticorpo Monoclonal Coelho Osterix | Abcam | ab209484 | diluição 1:500 |
| Peroxigard Pronto para Uso Desinfetante de Uma Etapa | Virox Technologies | 29101 | Pode ser substituído por qualquer outro desinfetante de grau clínico/laboratorial |
| Iodeto de Propídio (PI) | Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific | P1304MP | Mancha fluorescente nuclear usada para detectar células mortas para contagens de viabilidade |
| Aparador elétrico recarregável | Wahl/ Amazon | B001FWXKUE | Qualquer aparador pode ser usado, um aparador de tamanho menor facilitará a depilação de animais menores |
| Cone de nariz de roedor | VetEquipar | 921609 | |
| Safranin O, 85% puro, certificado | Fisher Scientific | AC419211000 | |
| O quadrado de Seal'N Freeze Cryotray molda | o elétron Miscroscopy Sciences EMS | 62642-01 | Usado para encaixar, outros moldes de encaixe podem ser usados. Este modelo específico tem um molde mais profundo, bem como uma tampa para selar o bloco |
| Nitrato de prata | Sigma Aldrich | S6506 | Nitrato de prata para coloração de von Kossa |
| Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Alternativamente, PBS recém-preparado que foi filtrado e autoclavado pode ser usado |
| Bisturis padrão estéreis | Integra Miltex / Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| Bisturis | padrão estéreisIntegra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| Sucrose em Pó 1 KG | Thermo Fisher Scientific | 036508-A1 | |
| Superfrost Plus Lâminas de Miscroscópio | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 1255015 | Lâminas adesivas |
| Sure-Tek Casettes de Processamento/ Incorporação de Tecidos | Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific | 22-048-141 | |
| Tecido Plus Temperatura de Corte Ótima O.C.T Composto Fisher | Scientific | 23-730-571 | |
| Esponjas de Tecido | Epredia/ Fisher Scientific | 84-53 | As esponjas de tecido protegem os tecidos de excesso de processamento |
| Toluidina Azul | Fisher AC348600050 |
Referências
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