Método otimizado para cultivo e bioaumento microbiano de Typha latifolia (taboa)

Summary

Typha latifolia, que se propaga principalmente assexuadamente através de rizomas, apresenta desafios de coleta devido ao seu extenso sistema radicular. Este artigo apresenta um método para o cultivo de T. latifolia a partir de sementes, facilitando o cultivo em laboratório e oferecendo o potencial para o crescimento de plantas estéreis e bioaumento microbiano precoce.

Abstract

Typha latifolia, mais comumente conhecida como taboa de folha larga ou junco comum, tem um alcance global e domina os ecossistemas de zonas úmidas na América do Norte. Embora diferentes espécies de taboa sejam frequentemente consideradas invasoras na América do Norte, T. latifolia é considerada a espécie nativa da região e é encontrada em todo o continente como a espécie dominante de Typha . Historicamente, Typha serviu a várias funções, desde fontes de alimentos até materiais de construção. Mais recentemente, T. latifolia emergiu como uma espécie proeminente para auxiliar nos esforços de biorremediação. Com o crescente interesse no desenvolvimento de sistemas de tratamento de zonas úmidas (CWTS) construídos para remediação de contaminantes, são necessárias técnicas reprodutíveis para cultivar taboa em ambiente de laboratório. O trabalho aqui apresentado examinou e testou vários parâmetros de crescimento para o cultivo bem-sucedido de T. latifolia a partir de sementes. A germinação bem-sucedida de espécies de Typha envolve escarificação (ruptura do tegumento), que foi alcançada usando técnicas mecânicas para produção em larga escala. O estabelecimento precoce das sementes mostrou favorecer condições de baixo crescimento de nutrientes na primeira semana, seguido pela introdução de fertilizantes nas semanas subsequentes para aumentar a sobrevida pós-transplante. Para o bioaumento microbiano do sistema vegetal, os resultados mostraram que a imersão das sementes em inóculo leva a uma colonização mais extensa do tecido radicular e persistência bacteriana a longo prazo. Uma técnica otimizada de esterilização de sementes usando uma combinação de alvejante e detergente foi usada para melhorar o sucesso da colonização de microrganismos. Os vasos de crescimento, estéreis e não estéreis, projetados neste estudo suportam o crescimento a longo prazo de T. latifolia sob várias condições.

Introduction

Como uma tecnologia de baixo custo e eficiência energética, os sistemas de tratamento de zonas úmidas (CWTS) construídos ganharam popularidade significativa para a remediação de contaminantes ambientais ^1,2,3. O CWTS usa processos físicos, químicos e biológicos para remover, transformar ou estabilizar contaminantes. Embora os processos físicos e químicos envolvidos na renovação química tenham sido bem caracterizados desde a gênese do CWTS, o impacto da vegetação permaneceu amplamente enigmático². Nos últimos anos, tem havido um foco crescente na compreensão dos mecanismos pelos quais as plantas transformam contaminantes orgânicos e inorgânicos de potencial preocupação em águas residuais ^2,4,5. No entanto, estudos mecanicistas como esses dependem da capacidade de cultivar um grande número de macrófitas e favorecem o crescimento a partir da semente para garantir que cada planta esteja no mesmo estágio de crescimento e desenvolvimento.

Os CWTS na América do Norte são frequentemente estabelecidos usando vegetação nativa de áreas úmidas naturais da região, como espécies de Typha, Scirpus, Juncus e Phragmites ^6,7. A escolha da vegetação também depende da área úmida construída que está sendo empregada, que pode variar em profundidade, fluxo de água, fonte de substrato e fonte de água (com ou sem recirculação)². Finalmente, o clima também influencia a vegetação de áreas úmidas, com climas mais frios favorecendo plantas submersas devido à sua maior adaptabilidade⁸. As espécies de Typha são de particular interesse em áreas úmidas construídas em águas úmidas profundas e de fluxo superficial devido à sua capacidade de colonizar rapidamente um ambiente e se adaptar a diversas condições ambientais ^9,10.

Uma revisão recente dos resultados relatou que, de 87 testes de fitotoxicidade usando espécies de Typha , apenas 15 estudos iniciaram as plantas de teste a partir de sementes e, desses, apenas um estudo examinou o crescimento em plantas maduras¹¹. Essa sub-representação da experimentação de taboa a partir de sementes indica uma lacuna na literatura sobre protocolos destinados a descrever o cultivo de taboa para estudos de laboratório. Os protocolos descritos aqui visam preencher essa lacuna, apresentando um protocolo aprofundado para o crescimento de Typha latifolia da semente à planta madura em condições estéreis e não estéreis. Além disso, este artigo discute uma técnica para bioaumento bacteriano de espécies de taboa no estágio de semente, onde a inoculação precoce pode ajudar a manter a persistência a longo prazo de micróbios rizos e endofíticos introduzidos.

Protocol

1. Escarificação de sementes

1. As sementes de taboa foram provenientes de um pântano em Calgary, AB, Canadá, no outono de 2023 (51,11312° N, 114,39381° W). Colete a inflorescência da taboa no outono e guarde em um saco de papel no escuro até o uso. Se ainda estiver no caule, colete a inflorescência na primavera, mas a recuperação das sementes será diminuída.
2. Usando uma tesoura de jardinagem, corte o caule da planta ~ 2 cm da base da inflorescência. Retire as sementes da inflorescência e coloque em um liquidificador de laboratório até que o volume do liquidificador esteja aproximadamente um quarto cheio. São aproximadamente 250 mL de sementes não compactadas.
3. Encha o liquidificador com 500 mL de água da torneira. Mantenha um espaço livre de 10 cm no liquidificador. Misture em velocidade média-baixa por 20 s e transfira imediatamente para um copo grande de 1 L. A solução resultante deve ser viscosa.
4. Transfira aproximadamente 100 mL desse lodo de água de semente de volta para o liquidificador e encha o liquidificador com 400-600 mL de água fresca da torneira. Misturar em velocidade média-alta durante 20 s e transferir imediatamente para um copo novo de 1 L.
5. Encha o copo com água da torneira até 800 mL e deixe descansar por pelo menos 60 s. As sementes de taboa escarificadas e viáveis afundarão no fundo do copo, e a pluma e o bico (consulte a Figura 1 para obter uma descrição da estrutura da semente de taboa) flutuarão para o topo. Retire o lodo no topo do copo e despeje lentamente a água do copo sem perturbar as sementes no fundo. Transfira as sementes para um copo de 100 mL.
6. Repita o processo de mistura no restante do lodo de taboa da etapa 1.5.
7. Coloque o copo contendo as sementes em uma placa de agitação e gire em velocidade média por 1 h. Após 1 h, retire qualquer material vegetal que flutue na parte superior do copo.
8. Despeje as sementes em um funil Büchner com papel de filtro preso a um vácuo para secar as sementes durante a noite. As sementes secas podem ser armazenadas a -20 °C em tubos cônicos de polipropileno de 15 mL.

2. Germinação usando técnica não estéril

1. Prepare placas de mídia Murashige e Skoog (MS) com 1% de fitoágar¹².
2. Coloque aproximadamente 1 mL de sementes secas em um tubo cônico de polipropileno de 15 mL e encha com 10 mL de água da torneira. Girar sobre um agitador orbital a baixa velocidade durante 24 h para induzir a germinação.
3. Remova o excesso de água de forma que 3 mL permaneçam no tubo cônico de polipropileno de 15 mL.
4. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de plástico de 1000 μL para aumentar o tamanho do furo e pipete a solução de sementes vigorosamente para suspender as sementes dentro da ponta da pipeta.
5. Coloque as sementes e a água nas placas de ágar MS de meia resistência. Gire o prato para distribuir as sementes uniformemente.
6. Envolva as placas em filme de vedação de laboratório e coloque-as em uma câmara de crescimento com um ciclo claro-escuro de 16 h / 8 h a 23 ° C e 70% de umidade. Incube as placas por 1 semana (até 2 semanas) para induzir a germinação das sementes.

3. Germinação usando técnica estéril

NOTA: Diferentes protocolos de esterilização de sementes foram testados e comparados. A técnica que produziu as maiores taxas de germinação durante a produção de sementes totalmente esterilizadas foi modificada a partir de um protocolo anterior¹³ e é descrita aqui.

1. Prepare placas de mídia MS de meia força com fitoágar^{12% a 1%.}
2. Coloque um volume de aproximadamente 1 mL de sementes em um tubo cônico de polipropileno de 15 mL e encha com 10 mL de ddH₂estéril Coloque em um agitador orbital em velocidade média-alta por 10 min.
3. Remova a água e adicione 5 mL de uma solução de polissorbato 20 a 0,1% (preparada em ddH₂O estéril) ao tubo cônico de polipropileno de 15 mL. Coloque em um agitador orbital em velocidade média-alta por 10 min.
4. Remova a solução e adicione 5 mL de alvejante comercial a 30% e solução de polissorbato 20 a 0,025% (preparada em ddH_{estéril 2}O) ao tubo cônico de polipropileno de 15 mL. Agite em velocidade média-alta por 30 min.
5. Remova a solução e substitua-a por ddH₂estéril Repita para um total de 3 enxágues com água.
6. Encha o tubo cônico de polipropileno de 15 mL com ddH₂O estéril e gire em velocidade baixa por 24 h para induzir a germinação. Após 24 h, retire o excesso de água para que fiquem 3 mL no tubo de plástico.
7. Corte assepticamente a ponta de uma ponta de pipeta de plástico de 1000 μL e pipete vigorosamente para suspender as sementes dentro da ponta.
8. Sementes e líquidos em placas de ágar MS de meia resistência. Gire o prato para distribuir uniformemente as sementes.
9. Envolver as placas em filme de vedação de laboratório e colocá-las em uma câmara de crescimento com um ciclo claro-escuro de 16 h / 8 h a 23 ° C e 70% de umidade. Deixe as placas por 1 semana (até 2 semanas) para permitir que ocorra a germinação.

4. Inoculação de sementes com bactérias selecionadas

1. Para inocular a semente de taboa, primeiro siga o protocolo de germinação de sementes estéreis acima até a etapa 3.6 para produzir sementes estéreis. Remova o enxágue final com água do tubo cônico de polipropileno de 15 mL conforme descrito na etapa 3.6 acima.
2. Usando culturas microbianas cultivadas durante a noite inoculadas a partir de um único isolado ou comunidade, meça o OD600 e normalize para um valor de absorbância de 1,0 diluindo em meio de cultura. Incubar culturas por um longo período de tempo se um OD600 de 1,0 não for alcançado.
   NOTA: Aqui, as culturas foram estabelecidas a partir de um Luteimonas sp. isolado de raízes de plantas no norte de Alberta e conjugado para expressar uma proteína fluorescente DsRed para visualização microscópica.
3. Gire 1 mL de cultura a 9300 x g por 2 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato. Gire a 9300 x g por 2 min.
4. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de ddH2O estéril.
5. Em um tubo cônico de polipropileno de 15 mL, agite aproximadamente 1 mL de sementes em velocidade baixa por 24 h em 10 mL de diluição de 1:10 do inóculo preparado com surfactante organossilicone a 0,025%.
6. Siga o restante do protocolo de germinação de sementes estéreis a partir da etapa 3.8.

5. Crescimento de taboa não estéril no solo

1. Encha os vasos com solo de baixa matéria orgânica de sua escolha, deixando 1 cm de espaço do topo do vaso. Umedeça previamente o solo com água da torneira e faça furos de 1 cm no solo.
2. Usando uma pinça, remova suavemente as mudas germinadas por 1 semana das placas de ágar MS cultivadas conforme descrito na etapa 3 acima, tomando cuidado para não danificar as raízes. Coloque delicadamente uma muda em cada buraco no solo e cubra-a com terra.
3. Coloque os vasos em uma bandeja e encha-os com água da torneira até o nível do solo. Para cada 10 vasos, adicione 100 mL de fertilizante NPK 20/20/20 a 0,5%.
4. Para cada conjunto de dez vasos, adicione fertilizante da seguinte forma: semana 2 - 100 mL de fertilizante a 0,5%, semana 3 - 100 mL de fertilizante a 1,0%, semana 4 - 100 mL de fertilizante a 1,0%.
5. Após 4 semanas, interrompa a fertilização semanal e fertilize apenas uma vez por mês com 100 mL de solução fertilizante a 1,0%. Com 4 semanas, transplante para vasos maiores, se necessário. As plantas são menos sensíveis ao tipo de solo neste momento, então use qualquer mistura.
6. Continue a transplantar taboas à medida que elas superam seu recipiente. Remova a folhagem morta com uma tesoura. Fertilize as taboas uma vez por mês.
7. Para experimentos, transplante as mudas em um pequeno vaso que, quando colocado no fundo de uma caixa vazia de ponteiras de pipeta, é ancorado pelas laterais da caixa. Isso permite a inundação adequada do solo, imitando assim as condições do pântano. Se estiver realizando experimentos em taboas mais antigas, modifique da mesma forma para que o pote possa ficar quase totalmente submerso na água.

6. Crescimento de mudas estéreis

1. Projeto da câmara de crescimento de mudas
   NOTA: A montagem de cada unidade da câmara de crescimento de mudas requer duas caixas de cultura, uma seringa com ponta luer lock, um filtro estéril descartável de 0.2 μm e silicone resistente ao calor. Consulte a Figura 2 para obter uma representação visual da configuração da câmara.
   1. Remova as tampas das caixas de cultura e use uma furadeira manual para criar orifícios de 3,5 cm de diâmetro no centro das tampas. Use silicone resistente ao calor para colar as partes superiores das duas tampas.
   2. Faça um furo do tamanho da ponta da seringa (~ 1 cm de diâmetro) no canto inferior de uma das caixas de cultura. Corte a ponta de uma seringa e descarte o corpo da seringa.
   3. Use silicone resistente ao calor para fixar a ponta da seringa na caixa de cultura com a rosca Luer lock na parte externa da caixa.
   4. Deixe o silicone curar pelo menos 24 h antes de usar.
2. Crescimento estéril no solo
   1. Siga o protocolo de germinação de sementes estéreis descrito na etapa 3 para obter sementes estéreis.
   2. Encha a unidade da câmara de crescimento estéril com solo de sua escolha, umedecido com água da torneira.
   3. Autoclave em um ciclo líquido de 20 minutos, cobrindo a ponta da trava da isca com papel alumínio. Após 24 h, autoclave o sistema novamente em um ciclo líquido de 20 min. Execute todas as etapas subsequentes em uma capela de fluxo laminar.
   4. Conecte uma unidade de filtro de 0.2 μm ao acessório de trava Luer na câmara de crescimento (Figura 2). Abra a câmara de crescimento e adicione 500 μL de fertilizante 1% 20/20/20 esterilizado por filtro ao solo. Misture o solo com uma espátula estéril. Ao misturar o solo, adicione ddH₂O estéril para garantir que esteja adequadamente hidratado sem supersaturação.
   5. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar o ágar MS de placas contendo mudas de 1 semana em quartos. Use uma espátula estéril para colocar o pedaço de ágar no solo.
   6. Coloque a unidade da câmara de crescimento em uma incubadora de crescimento de plantas em um ciclo dia-noite de 16 h / 8 h a 23 ° C e 70% de umidade.
3. Crescimento estéril em solução hidropônica
   1. Siga o protocolo de germinação estéril descrito na etapa 3 para obter sementes estéreis.
   2. Autoclave uma caixa de ponteira de pipeta e ágar MS de meia força em um ciclo líquido de 20 minutos. Em uma capela de fluxo laminar, enrole a parte inferior da inserção da ponta com filme de vedação de laboratório estéril. Encha cada abertura da ponta da pipeta com ágar quase até o topo.
   3. Adicione a inserção da ponta de volta à caixa de ponta, enchendo o fundo da caixa com solução de crescimento hidropônico de Hoagland com meia força (0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1mM MgSO₄, 0,023 mM H₃BO₃, 0,005 mM MnCl₂·4H₂O, 0,0004 mM ZnSO₄·7H₂O, 0,0002 mM CuSO₄·5H₂O, 0,00007 mM H₂MoO₄·1H₂O e 0,045 mM FeSO₄·7H₂O, ajustado para pH 7,0).
   4. Remova cuidadosamente as mudas das placas de ágar MS e coloque-as no ágar MS em cima do ágar na abertura da pipeta no inserto da caixa de pontas.
   5. Feche a tampa da caixa de pontas e coloque em uma câmara de crescimento em um ciclo dia-noite de 16 h / 8 h a 23 ° C e 70% de umidade.
   6. Quando as plantas forem muito grandes para a caixa de pontas, transplante-as para a câmara de crescimento da cultura descrita na etapa 5.1. Para transferir, remova todo o tampão de ágar com a planta e mova-o para uma rolha de espuma com um corte radial. A rolha de espuma pode ser colocada entre as duas caixas de cultura, e a caixa de cultura inferior pode ser preenchida com Hoagland de meia resistência.

Results

A Figura 1 mostra uma representação de uma semente de Typha que passou pelo processo de escarificação, juntamente com uma semente incompletamente escarificada com o bico removido e uma semente não escarificada. Certifique-se de que o tempo de mistura seja suficiente para produzir principalmente sementes totalmente escarificadas.

Após escarificar e secar as sementes, a viabilidade das sementes deve ser testada usando a técnica de germinação não estéril. Ao...

Discussion

O protocolo aqui apresentado fornece um guia detalhado para o crescimento de espécies de taboa a partir de sementes para aplicações em laboratório. Embora a taboa possa ser facilmente propagada a partir de estacas de rizoma, iniciar as plantas a partir da semente permite a variação genética dentro de um conjunto de amostras, garante que as plantas estejam em estágios de crescimento iguais e oferece a oportunidade de colonização precoce para experimentos de bioaumento microbiano. É import...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 & micro; Filtro estéril m	VWR	514-4126
3′,5′-Dimetoxi-4′-hidroxiacetofenona	Laboratórios PhytoTech	S7777
Caixas de cultura com tampas (77 mm e tempos 77 mm e vezes 97 mm)	Millipore Sigma	V8505
Selante de silicone resistente ao calor em alta temperatura	Grupo Imperial de Manufatura	KK0205
Filme de vedação laboratorial	Millipore Sigma	P7793
Murashige e Skoog media	Laboratórios PhytoTech	M401
Organossilício surfactante	Laboratórios PhytoTech	S7777
Phytoagar	GoldBiotecnologia	P1003
Polissorbato 20	Roche	11332465001