Artigo de método

In vitro Teste de trombose para dispositivos de assistência ventricular

1.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/67731

⸱

21 de março de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Cardiovascular Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo de bancada para induzir trombose em dispositivos de assistência ventricular (DVA) dentro de uma plataforma de teste de recirculação. Este método serve para identificar pontos de acesso trombogênicos no caminho do fluxo sanguíneo e pode ajudar a melhorar a resistência à tromborresistência antes dos testes pré-clínicos em modelos animais.

Resumo

O risco de trombose continua sendo uma preocupação significativa no desenvolvimento e uso clínico de dispositivos de assistência ventricular (DVAs). As avaliações tradicionais da trombogenicidade do DVA, principalmente por meio de estudos em animais, são caras e demoradas, levantam preocupações éticas e, em última análise, podem não refletir com precisão os resultados humanos. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um protocolo de teste in vitro agressivo projetado para provocar trombose e identificar possíveis áreas de alto risco no caminho do fluxo sanguíneo. Este protocolo, motivado pelo trabalho de Maruyama et al., emprega uma estratégia de anticoagulação modificada e utiliza componentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível à maioria dos laboratórios que realizam exames de sangue in vitro de VADs. Demonstramos a utilidade desse método por meio de testes iterativos e refinamento de um VAD pediátrico em miniatura levitado magneticamente (PediaFlow PF5). O método tem sido eficaz na identificação de pontos críticos trombogênicos causados por falhas de projeto e fabricação nos primeiros protótipos de VAD, permitindo melhorias direcionadas antes de avançar para estudos em animais. Apesar de suas limitações, incluindo a ausência de fluxo pulsátil e a influência das características do sangue do doador, este protocolo serve como uma ferramenta prática para o desenvolvimento de DVA em estágio inicial e mitigação de riscos.

Introdução

Os dispositivos de assistência ventricular (DVA) tornaram-se um padrão de tratamento no tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca avançada, mas o risco de trombose e acidente vascular cerebral continua sendo um desafio significativo 1,2. A trombose dentro dos VADs é normalmente avaliada durante estudos pré-clínicos em animais, que, embora valiosos, apresentam custos substanciais e desafios logísticos. Esses estudos consomem muitos recursos, são demorados e são suscetíveis a um único defeito que compromete todo o teste e necessita de ensaios adicionais. Isso não apenas aumenta a carga financeira, mas também levanta preocupações éticas devido à necessidade de testes repetidos em animais.

Embora existam muitos modelos numéricos para prever deposição de plaquetas e trombose 3,4,5,6, apenas alguns são adequados para simular a formação de trombos em dispositivos de macroescala, como VADs 7,8,9. Além disso, os modelos existentes inevitavelmente assumem superfícies idealizadas e geometrias "estanques" simplificadas, que não refletem com precisão as complexidades e imperfeições dos conjuntos de bombas do mundo real. Quando as interações plaqueta-superfície são consideradas, esses modelos em macroescala geralmente empregam propriedades de material uniformemente prescritas (normalmente modeladas como um coeficiente nas condições de contorno do fluxo de superfície) 10 , 11 , 12 . Consequentemente, os modelos numéricos não podem substituir completamente os testes experimentais com sangue.

Tanto a escolha do material quanto o acabamento da superfície desempenham papéis críticos na adesão plaquetária nas superfícies VAD 13,14,15,16,17. Imperfeições como manchas ásperas ou irregularidades podem promover a adesão plaquetária e a formação de trombos. Além disso, fendas entre componentes no caminho do fluxo podem servir como um nidus para trombose, fornecendo ambientes protegidos onde os coágulos podem se formar e crescer18,19. O uso de graxa, lubrificantes ou selantes durante a montagem também pode representar um risco, pois essas substâncias podem penetrar no caminho do fluxo e interagir com o sangue, aumentando ainda mais o risco de complicações.

Há, portanto, a necessidade de um protocolo de teste in vitro bem definido que possa avaliar de forma confiável a tromborresistência dos VADs antes de serem submetidos a testes em animais ou uso clínico. Embora exista um padrão ASTM amplamente adotado para a avaliação da hemólise20, não existe tal padrão para o teste de trombogenicidade de VADs sob condições operacionais clinicamente relevantes21. Apesar de estudos seminais que datam de três décadas demonstrarem a viabilidade do teste de trombose in vitro para bombas de sangue22 , 23 , 24 , 25 , o teste em animais persistiu como a prática de fato para avaliar a trombose até o momento26. O obstáculo para uma adoção mais ampla de métodos in vitro provavelmente tem sido a natureza complexa da coagulação, com a multiplicidade de fatores de confusão que podem influenciar os resultados dos testes, tornando difícil diferenciar a trombogenicidade intrínseca da bomba dos artefatos decorrentes de limitações metodológicas e erros de procedimento.

Isso nos motivou a compartilhar um protocolo detalhado como um guia para os experimentalistas evitarem armadilhas, promovendo assim o uso de testes in vitro e mitigando a dependência de estudos em animais. O protocolo aqui descrito, derivado de Maruyama et al.27, foi refinado e validado durante o projeto da DVA pediátrica PediaFlow (PF5) de5ª geração28,29. Este método de teste provou ser fundamental na identificação e abordagem sistemática de riscos trombogênicos potenciais nos protótipos VAD antes dos testes em animais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O sangue total ovino usado neste estudo foi obtido de um fornecedor comercial e, portanto, não exigiu uma revisão pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell.

1. Construção do circuito de fluxo de teste

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista detalhada dos componentes do loop e todos os outros materiais usados neste protocolo.

  1. Modifique a bolsa intravenosa (IV).
    1. Use um selador térmico de plástico para modificar uma bolsa IV para ajustar seu volume e forma, conforme ilustrado na Figura 1.
      NOTA: O formato da bolsa facilita a desaeração e permite que a bolsa seja pinçada com um hemostático através da linha de fluido30,31. A localização da linha de vedação é escolhida com base no volume de escorva do VAD e da tubulação para atingir um volume total de escorva de 150 mL.
    2. Introduza uma saída de ar fazendo uma incisão de 4 mm na parte superior da bolsa. Insira uma trava luer fêmea farpada na incisão e sele o local com adesivo de borracha de silicone RTV. Fixe uma torneira unidirecional à trava luer.
  2. Monte o circuito de teste usando a bolsa IV modificada, tubulação de cloreto de polivinila (PVC), conectores farpados de policarbonato e torneiras de 3 e 1 vias, conforme mostrado na Figura 1.
  3. Conecte o manômetro de pressão.
    1. Conecte linhas de extensão de 6 polegadas às portas de pressão do lado de entrada e saída. Prenda uma torneira unidirecional na outra extremidade da linha de extensão.
      NOTA: A torneira permite desconectar a tubulação do manômetro para escorvar a linha de extensão com fluido antes de ligar a bomba, conforme descrito na etapa 4.3.
    2. Conecte uma extremidade de cada tubo de diâmetro interno (ID) de 1/8" a uma farpa do manômetro e insira um encaixe luer macho na outra extremidade.
    3. Conecte as conexões luer macho às torneiras unidirecionais. Abra as torneiras para permitir as leituras de pressão.
  4. Aplique uma sonda de fluxo ultrassônica clamp-on para medir a taxa de fluxo.
  5. Coloque um Hoffman clamp distal à porta de pressão de saída para regular a resistência ao fluxo.

2. Preparação da solução de cloreto de cálcio (CaCl2)

  1. Dissolva o CaCl2 em pó em solução salina tamponada com 1x TRIS (pH 7,4) para preparar uma solução 1 M. Evite tampões contendo fosfato (por exemplo, PBS ou DPBS), pois o cálcio e o fosfato reagem para formar um precipitado insolúvel.
  2. Se estiver preparando CaCl2 em grandes quantidades, adicione o pó de CaCl2 de forma incremental em várias etapas, pois sua dissolução é um processo exotérmico.
  3. Titular o pH da solução para 6-8 usando ácido clorídrico (HCl) ou hidróxido de sódio (NaOH), se necessário.

3. Preparação de sangue

NOTA: O sangue ovino usado neste estudo foi obtido de um fornecedor comercial listado na Tabela de Materiais. O sangue foi coletado com agulha 14-G, com o animal contido em posição ortostática agrícola padrão. O processo de coleta levou de 10 a 12 minutos desde a inserção da agulha até a conclusão. O sangue foi anticoagulado com 14 partes de CPD para 86 partes de sangue (formulação de CPD: 26,3 g/L de Na-Citrato, 25,2 g de dextrose, 3 g/L de ácido cítrico e 2,2 g/L de Na-Fosfato em água deionizada [DI]). A bolsa de sangue foi enviada durante a noite em um recipiente isolado com bolsas de gelo e foi usada para o experimento dentro de 24 h após a coleta.

  1. Prepare o sangue do doador para uso.
    1. Coloque a bolsa de sangue em uma plataforma basculante por 15 a 30 minutos para misturar o sangue suavemente e permitir que ele atinja a temperatura ambiente (RT).
    2. Coloque uma barra de agitação magnética em um béquer ou recipiente de policarbonato designado para a transferência de sangue.
    3. Transferir o sangue para o copo através de um filtro de transfusão para remover os macroagregados. Manuseie o sangue suavemente para evitar danos aos componentes celulares. Despeje o sangue ao longo das paredes do recipiente para evitar queda livre e minimizar o trauma celular.
      NOTA: Descarte o sangue se houver trombos grandes ou se o filtro entupir.
    4. Coloque o copo ou recipiente em um agitador magnético e ajuste a velocidade até que a superfície do sangue comece a girar suavemente sem formar um grande vórtice. Mexa continuamente por pelo menos 5 min.
    5. Meça o hematócrito e a contagem de plaquetas para garantir que os valores estejam dentro da faixa normal para a espécie.
  2. Realize titulações para determinar a concentração alvo de CaCl2 .
    NOTA: O sangue citrato é recalcificado para permitir o teste de coagulação e trombose, com heparina adicionada para evitar a coagulação descontrolada. O tempo de coagulação ativado (ACT) alvo para o início do teste é de 300 s. Observe que os valores de referência do ACT fornecidos nesta seção foram obtidos usando sangue de ovelha de doadores e podem variar dependendo da espécie e do nível de anticoagulação usado durante a coleta. Além disso, as medidas do TCA podem variar entre os instrumentos 32,33,34. Algumas tentativas e erros podem ser necessários para estabelecer a faixa ideal de ACT para uma configuração laboratorial específica.
    1. Transfira 2 mL da solução preparada de 1 M CaCl2 e 0,5 mL de heparina sódica (1000 U / mL) da embalagem do fabricante para tubos de microcentrífuga para evitar a contaminação das soluções de estoque.
    2. Transfira 10 mL de sangue para tubos de ensaio de polipropileno de 14 mL. Prepare quatro desses tubos.
    3. Para atingir uma concentração de 0,5 U/mL de heparina no sangue, adicione 5 μL de heparina sódica à amostra de sangue de 10 mL.
    4. Para atingir uma concentração de cálcio de 5 mM no sangue, adicione 50 μL de solução de CaCl2 1 M à amostra de sangue de 10 mL. Durante a dispensação, gire a ponta da pipeta para distribuir o CaCl2 em uma área mais ampla.
    5. Imediatamente, inverta o tubo 10 vezes, role-o horizontalmente (em uma superfície plana ou entre as palmas das mãos) e inverta mais 10 vezes para garantir uma mistura completa.
    6. Meça o ACT usando um sistema de coagulação de sangue total no local de atendimento seguindo as instruções do fabricante. O ACT inicial normalmente varia entre 400-500 s.
    7. Mantendo a concentração de heparina constante, aumente a concentração de CaCl2 (para aproximadamente 7-8 mM) para atingir um ACT de 300 s.
    8. Verifique a concentração final e o TCA resultante em um tubo de sangue separado.

4. Procedimentos de pré-ensaio

NOTA: Todas as etapas descritas nesta seção se aplicam às Seções 5 e 6. Execute estas etapas antes de operar a bomba com albumina de soro bovino (BSA) ou sangue na alça. Transfira sangue entre vasos usando alimentação por gravidade para minimizar o estresse mecânico. Evite usar o êmbolo da seringa para conduzir o sangue, pois isso pode criar pressão excessiva. Além disso, evite estrangular o sangue através de aberturas estreitas para evitar danos aos componentes celulares.

  1. Enchimento e drenagem do circuito de teste
    1. Conecte uma linha de extensão de 30 polegadas à porta de injeção e conecte um corpo de seringa de 60 mL como um funil. Abra a torneira do reservatório para atuar como uma saída de ar.
    2. Despeje o fluido no funil, levantando-o conforme necessário para acelerar o arquivamento. Encha o laço até 1-2 cm abaixo da saída de ar na parte superior da bolsa. Feche as torneiras da saída de ar e da porta de injeção.
    3. Para drenar, abra as torneiras da saída de ar e da porta de injeção e abaixe o funil abaixo do nível da bancada. Levante a bomba acima da porta de drenagem para evacuar o fluido restante.
  2. Desarejar o loop de teste
    NOTA: Execute este procedimento ao preencher o circuito com BSA ou sangue antes de iniciar a bomba.
    1. Certifique-se de que não haja ar preso em nenhum lugar do circuito. Desaloje as bolhas de ar nas superfícies batendo e apertando suavemente a tubulação e o reservatório.
    2. Se estiver avaliando uma bomba de sangue de fluxo axial, gire-a para a posição vertical para liberar o ar por flutuabilidade. Se estiver usando uma bomba centrífuga, vire-a de cabeça para baixo e gire-a para garantir que nenhum ar fique preso nos caminhos de fluxo secundários.
    3. Inspecione de perto as seções horizontais da tubulação e as junções entre a tubulação e os conectores para garantir que não haja bolhas de ar.
    4. Aperte a bolsa IV para aproximar o nível do fluido da parte estreita superior e prenda a bolsa com um hemostático na linha de fluido para eliminar a interface fluido-ar. Feche a torneira de ventilação.
  3. Preparação das linhas de pressão e da porta de amostragem
    1. Feche a torneira no final das linhas de pressão, remova a tubulação do manômetro e coloque uma seringa de 3 mL. Abra a torneira e puxe 1-2 mL de fluido para a linha de extensão (aproximadamente 4 cm).
    2. Feche a torneira, retire a seringa e reconecte o tubo do manômetro. Abra a torneira para permitir as leituras de pressão.
    3. Preparar a porta de amostragem com uma seringa.
  4. Limpeza das portas de injeção e amostragem
    1. Corte ou rasgue um lenço sem fiapos em três fragmentos iguais. Torça o canto de um fragmento para formar uma ponta e insira-o na porta para absorver qualquer sangue residual.
    2. Torça o segundo fragmento, umedeça-o com soro fisiológico e insira a ponta úmida na porta. Torça-o ao redor da porta para remover todo o sangue restante.
    3. Use o terceiro fragmento para absorver qualquer solução salina residual na porta.
      NOTA: Execute este procedimento de limpeza imediatamente após a coleta de uma amostra de sangue ou sempre que houver sangue residual nas portas.

5. Passivando as superfícies de contato com o sangue

  1. Encha o circuito com solução de BSA a 1% e opere o VAD para circulá-lo por pelo menos 30 min.
  2. Inspecione o loop quanto a vazamentos e remonte, se necessário.
  3. Drene a solução BSA completamente para evitar hemodiluição.

6. Teste de trombose

  1. Prepare o loop de teste.
    1. Encha o circuito com 150 mL de sangue.
    2. Desar o circuito e preparar as linhas de pressão e a porta de amostragem conforme descrito nas etapas 4.2 a 4.4.
    3. Ligue a bomba em baixa velocidade e opere-a por cerca de 5 s para desalojar quaisquer bolhas de ar presas dentro da bomba e, em seguida, pare a bomba.
    4. Se aparecerem bolhas no saco, repita o passo 4.2 para realizar a desventilação novamente.
    5. Reinicie a bomba em baixa velocidade para circular o sangue no circuito.
  2. Adicione heparina ao sangue na alça.
    1. Transfira 1 mL de heparina sódica (1000 U / mL) e 1,5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA; 0,5 M) da embalagem do fabricante para tubos separados para facilitar o manuseio durante o teste.
    2. Use a porta transversal da torneira de 3 vias para administrar substâncias no laço usando uma seringa. Gire a trava luer macho na torneira de modo que a porta de injeção fique voltada para cima para reter as bolhas de ar na parte superior.
    3. Atinja uma concentração de heparina de 0,5 U/mL na alça adicionando 75 U de heparina sódica a 150 mL de sangue. Aspire 75 U de heparina (75 μL se estiver usando concentração de 1000 U / mL) em uma micropipeta e dispense-a em uma seringa de 3 mL dispensando simultaneamente a pipeta e puxando o êmbolo da seringa. Certifique-se de que todo o líquido seja transferido sem derramar.
    4. Encaixe a seringa na porta de injeção através da trava luer, com a porta voltada para cima e a ponta da seringa apontando verticalmente para baixo. Puxe o êmbolo da seringa para enchê-lo de sangue e misture a heparina com o sangue enquanto aspira o ar para a seringa. Deixe a bolha de ar subir até o topo da seringa. Injete a mistura no circuito, garantindo que nenhum ar entre.
    5. Transporte o sangue para dentro e para fora da seringa 4-5 vezes para garantir que o sangue heparinizado não fique confinado ao espaço na porta. Certifique-se de que nenhum ar entre no circuito.
  3. Titular o ACT de sangue no loop.
    1. Atingir uma concentração inicial de cálcio de 5 mM na alça adicionando 750 μL de solução 1 M CaCl2 a 150 mL de sangue usando o mesmo procedimento da heparina.
      1. O sangue exposto a altas concentrações de cálcio pode começar a coagular na seringa. Injete rapidamente o fluido após remover o ar residual. Opcionalmente, dilua o CaCl2 na seringa com 1 ml de solução salina tamponada com TRIS para reduzir o risco de coagulação prematura.
    2. Deixe o CaCl2 injetado circular no loop por pelo menos 2 minutos antes de coletar uma amostra de sangue para medir o TCA inicial.
    3. Conecte uma seringa de 1 mL à porta de amostragem. Retire e descarte 0,5 mL de sangue residual para limpar o sangue estagnado da porta.
    4. Conecte uma nova seringa de 1 mL, retire 0,5 mL de sangue para análise e meça o TCA. Limpe a porta de amostragem usando o procedimento na etapa 4.4.
    5. Consulte os valores de titulação na etapa 3.2 para informar a concentração alvo de CaCl2 . Aumente gradualmente a concentração de cálcio para atingir um ACT de 300 s. Evite adicionar a quantidade total de CaCl2 de uma só vez para evitar a coagulação rápida.
      NOTA: Nos testes utilizados neste estudo, a concentração inicial de cálcio de 5 mM resultou em TCA de 450 ± 50 s, e a concentração final de 7-8 mM rendeu TCA de 300 ± 20 s. Embora essa resposta possa variar, tente trazer o ACT para ou abaixo de 300 s para o início do teste.
  4. Comece o teste.
    1. Assim que o ACT de 300 s for alcançado no loop, comece o teste de 1 h. Ajuste a bomba para a vazão e pressão desejadas modificando a velocidade do rotor e regulando a resistência usando o grampo Hoffman.
    2. Meça o ACT a cada 15 minutos seguindo as etapas 6.3.3-6.3.4.
    3. Se o ACT cair abaixo de 200 s, injete mais 25 U de heparina sódica na alça.
  5. Finalize o teste.
    1. Ao final de 1 h, injete EDTA na alça para inibir a coagulação adicional, visando uma concentração final de 5 mM no sangue. (Injete 1,5 mL se estiver usando uma solução EDTA 0,5 M.)
    2. Deixe o EDTA circular e misture por 2 min, depois pare a bomba.
  6. Desconecte e lave a bomba.
    1. Prenda a tubulação conectada à entrada e saída da bomba usando hemostáticos, posicionando as braçadeiras a 3-4 cm de distância das farpas de entrada e saída.
    2. Desconecte cuidadosamente a tubulação para liberar a bomba.
    3. Drene o sangue da bomba e flua para um recipiente.
    4. Lave qualquer sangue residual da bomba por gravidade ou pipetando solução salina através da entrada e saída da bomba.
      NOTA: As etapas 6.7 e 6.8 são executadas simultaneamente.
  7. Inspecione o caminho do fluxo da bomba.
    1. Capture imagens da entrada e saída da bomba usando uma câmera de endoscópio/boroscópio.
    2. Desmonte a bomba (se aplicável). Lave os componentes em um banho de solução salina e inspecione se há trombos usando um escopo de dissecação ou lente macro.
    3. Fotografe superfícies de contato com o sangue para documentação.
      NOTA: Inspeção consistente e documentação completa são essenciais para testes comparativos.
  8. Filtre o sangue usado.
    1. Corte um pedaço de tecido de malha de nylon de 100 μm grande o suficiente para cobrir a abertura de um recipiente de captura.
    2. Posicione a malha sobre o recipiente com uma leve cortina para permitir que o sangue flua através dela de forma eficaz. Prenda as bordas da malha para evitar que escorregue durante a filtração.
    3. Passe o sangue usado através de uma malha de nylon. Descarte o sangue de acordo com as diretrizes de manuseio de resíduos biológicos da instituição.
    4. Examine a malha em busca de trombos capturados e documente os achados.
  9. Prepare-se para a análise histológica.
    1. Se a análise histológica for planejada, fixe quaisquer trombos encontrados na solução de formalina seguindo os procedimentos de segurança apropriados.
      CUIDADO: Sempre use uma hotte ao manusear formaldeído.

7. Procedimento de limpeza

  1. Desmonte o loop de fluxo. Descarte a bolsa de sangue e o tubo de PVC.
  2. Mergulhe todos os outros componentes em contato com o sangue (conectores, torneiras, travas luer, etc.) em uma solução de detergente em pó ativo com enzimas a 1% durante a noite. Enxágüe com água morna da torneira, seguida de água DI e seque ao ar.
    1. Se os coágulos permanecerem, sonice os componentes na solução detergente. Enxágue bem e seque ao ar.
  3. Limpe a bomba.
    1. Se a bomba puder ser desmontada, mergulhe e sonice os componentes em contato com o sangue com uma solução de limpeza/desengraxante multiuso a 1%, seguida por uma solução de detergente em pó ativo com enzima a 1%.
    2. Se a bomba não puder ser desmontada, conecte-a a um novo circuito de fluxo cheio de soluções de limpeza e opere-a em alta velocidade por pelo menos 30 min. Repita conforme necessário.
  4. Enxágue bem a bomba com água morna da torneira, seguida de água DI e seque ao ar.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A execução bem-sucedida deste protocolo permite a identificação de áreas localizadas de deposição de plaquetas, revelando pontos problemáticos dentro do caminho de fluxo da bomba. A aplicação consistente deste protocolo permite melhorias incrementais ao abordar esses "pontos críticos" identificados.

Por exemplo, durante o desenvolvimento do PediaFlow PF5 VAD, encontramos desafios no polimento manual do lado da pressão das palhetas do estator devido ao tamanho em miniatura dos componentes. Os t...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O primeiro teste em humanos de uma nova bomba é sempre um esforço precário, pois os estudos pré-clínicos não podem prever com segurança a trombogenicidade dos VADs em humanos26. Notavelmente, alguns VADs que demonstraram ausência de trombose em ensaios com animais exibiram posteriormente trombogenicidade significativa no uso clínico36. Um regime agressivo de testes in vitro projetado especificamente para provocar trombose oferece u...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

S.E.O. atualmente atua como consultor da Magenta Medical e anteriormente foi consultor da Boston Scientific. Nenhum outro autor tem quaisquer divulgações financeiras relevantes ou conflitos de interesse a relatar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R01HL089456 e pelo Projeto de Atividade de Aquisição de Pesquisa Médica do Exército dos EUA Número W81XWH2010387.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de ensaio de 14 mLFalcon352059Tubos de ensaio de polipropileno de fundo redondo com tampa de pressão
Torneira de 1 viaQosina99759Luer Lock, Luer Macho com Spin Lock
Torneira de 3 viasQosina997712 Luer Locks Fêmea, Cuvetes Luer Lock
ACT+ Macho Rotativo para HemochronWerfen000JACT+45/Caixa
Multiuso limpador/desengorduranteSimple Green2710200613005Simple Green Cleaner and Degreaser. Use solução a 1%.
Conectores farpadosQosina73311Material: policarbonato; ¼ ” x ¼ ” conector reto
Conectores farpados com trava luerQosina73316Material: policarbonato; ¼ ” x ¼ ” conector reto com trava luer
Albumina de soro bovino (BSA)Thermo Scientific ChemicalsAAJ6465522Ou
equivalente Cloreto de cálcio, CaCl2Thermo Scientific ChemicalsAA89866-30Anidro, ≥ 96,0% ACS
Escopo de dissecação (recomendado)Olympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/Olympus SZH10 (ampliação de zoom contínuo 7x - 70x) ou
DPBS semelhante (sem cálcio e magnésio)Gibco14200075solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio, 10X (deve ser diluído para 1X antes do uso)
EDTA Quality Biológico351-027-721EA0.5 M, pH 7.0– 8.0 (Ácido etilenodiaminotetracético)
Câmera de endoscópio/boroscópio/otoscópio (opcional)Bebirdhttps://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers3– Diâmetro da sonda de 4 mm
Detergente em pó enzyme-activeAlconox1304-1Alconox Tergazyme. Use solução a 1%.
Linha de Extensão, 30"Qosina 3621830" de comprimento,  luer lock fêmea para luer lock macho
Linha de Extensão, 6"Qosina 362126" de comprimento,  trava luer fêmea para trava luer macho
Trava luer fêmea, farpadoQosina11548Serve para tubulação ID de 1/8 de polegada; material: policarbonato;
Medidor de vazãoTransônicohttps://www.transonic.com/t402-t403-consolesMódulo Transônico TS410
HemostatFisherbrand13-820-004Hemostático de travamento com pelo menos 5 cm de comprimento da ponta
Heparina SódicaMcKesson Serviços de Embalagem949513concentração de 1000 U/mL
Braçadeira HoffmanHumboldtH8720pinça de rosca fina
(reservatório de sangue compatível)Qosina51494Material: PVC, 2 portas de tubo 0.258" ID. O saco de 100 ml é modificado usando um selador de calor
Toalhetes sem fiaposKimberly-Clark Professional34120Kimtech Science Wipers
Agitador magnéticoINTLLABMS-500Ou similar
Fechadura luer macho, farpadoQosina11549Serve para tubulação de 1/8 de polegada ID; material: policarbonato;
Manômetro (digital)Sper Scientific840081SPER-840081 ou
similar Malha filtrante de nylonMcMaster-Carr9318T21100-μ m (0.0039") tamanho da abertura
Sangue ovinoLampire7209004Doador sangue total, anticoagulado com ACD 14:86, enviado durante a noite
Seladora térmica de saco plásticoUlineH-190Uline H-190 ou similar (sem cortador)
Adesivo de borracha de siliconeSmooth-On B00IRC1YI0Seringa Sil-Poxy ou similar
com trava luer, 1 mLSeringa manual Fisher Scientific14-955-646Fisherbrand sem agulha para fins de pesquisa
Seringa com trava luer, 3 mLSeringa manual Fisher Scientific14-955-457Fisherbrand sem agulha para fins de pesquisa
Seringa com trava luer, 60 mLFisher Scientific14-955-461Seringa manual da marca Fisherbrand sem agulha para fins de pesquisa
Filtro de transfusãoHaemonetics Corporation SQ40S/SQ40NSHaemonetics Corporation SQ40S filtro de transfusão de sangue de nuvem
TRIS Buffered SalineThermo Scientific ChemicalsAAJ62938K2TBS 10x (deve ser diluído para 1X antes do uso), pH 7.4
TubulaçãoTygonADF00017Tubulação Tygon ND-100-65 (grau médico)
Sensor de fluxo ultrassônicoTransonic https://www.transonic.com/hqxl-flowsensorsSelecione o modelo de sensor de fluxo apropriado para o tamanho da tubulação usada. O sensor de fixação ME6PXL se encaixa no sensor de 3/8" Tubulação OD. O sensor é calibrado pela Transonic para o fluido de teste (por exemplo, sangue a 24C) e grau de tubulação (por exemplo, Tygon ND-100-65)
Sonicador ultrassônico (opcional)Ultrassônico BransonCPX952238RBranson CPX2800H ou
similar Sistema VADPediaFlowPF5O sistema VAD a ser testado; inclui a bomba e o controlador
Sistema de Coagulação de Sangue TotalWerfenhttps://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-eliteHemochron Signature Elite ou Signature Jr
Bolsa IV de

Referências

  1. Kirklin, J. K., et al. Eighth annual INTERMACS report Special focus on framing the impact of adverse events. J Heart Lung Transplant. 36 (10), 1080-1086 (2017).
  2. Kormos, R. L., et al. The Society of Thoracic Surgeons Intermacs Database Annual Report: Evolving indications, outcomes, and scientific partnerships. Ann Thorac Surg. 107 (2), 341-353 (2019).
  3. Leiderman, K., Fogelson, A. An overview of mathematical modeling of thrombus formation under flow. Thromb Res. 133 (SUPPL. 1), S12-S14 (2014).
  4. Anand, M., Rajagopal, K. A short review of advances in the modelling of blood rheology and clot formation. Fluids. 2 (3), 35(2017).
  5. Belyaev, A. V., Dunster, J. L., Gibbins, J. M., Panteleev, M. A., Volpert, V. Modeling thrombosis in silico: Frontiers, challenges, unresolved problems and milestones. Phys Life Rev. 26- 27, 57-95 (2018).
  6. Manning, K. B., Nicoud, F., Shea, S. M. Mathematical and computational modeling of device-induced thrombosis. Curr Opin Biomed Eng. 20, 100349(2021).
  7. Wu, W. T., Yang, F., Wu, J., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. High fidelity computational simulation of thrombus formation in Thoratec HeartMate II continuous flow ventricular assist device. Sci Rep. 6 (Decemeber), 1-11 (2016).
  8. Méndez Rojano, R., Lai, A., Zhussupbekov, M., Burgreen, G. W., Cook, K., Antaki, J. F. A fibrin enhanced thrombosis model for medical devices operating at low shear regimes or large surface areas. PLoS Comput Biol. 18 (10), e1010277(2022).
  9. Taylor, J. O., Meyer, R. S., Deutsch, S., Manning, K. B. Development of a computational model for macroscopic predictions of device-induced thrombosis. Biomech Model Mechanobiol. 15 (6), 1713-1731 (2016).
  10. Strong, A. B., Stubley, G. D., Chang, G., Absolom, D. R. Theoretical and experimental analysis of cellular adhesion to polymer surfaces. J Biomed Mater Res. 21 (8), 1039-1055 (1987).
  11. Sorensen, E. N., Burgreen, G. W., Wagner, W. R., Antaki, J. F. Computational simulation of platelet deposition and activation: I. Model development and properties. Ann Biomed Eng. 27 (4), 436-448 (1999).
  12. Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Wagner, W. R., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. Multi-constituent simulation of thrombus deposition. Sci Rep. 7 (1), 42720(2017).
  13. Yamane, T. How Do We Select Materials. Mechanism of Artificial Heart. , Springer. Tokyo. (2016).
  14. Sin, D., Kei, H., Miao, X. Surface coatings for ventricular assist devices. Expert Rev Med Devices. 6 (1), 51-60 (2009).
  15. Zhang, M., Tansley, G. D., Dargusch, M. S., Fraser, J. F., Pauls, J. P. Surface coatings for rotary ventricular assist devices: A systematic review. ASAIO J. 68 (5), 623-632 (2022).
  16. Linneweber, J., Dohmen, P. M., Kerzscher, U., Affeld, K., Nosé, Y., Konertz, W. The effect of surface roughness on activation of the coagulation system and platelet adhesion in rotary blood pumps. Artif Organs. 31 (5), 345-351 (2007).
  17. Jayaraman, A., Kang, J., Antaki, J. F., Kirby, B. J. The roles of sub-micron and microscale roughness on shear-driven thrombosis on titanium alloy surfaces. Artif Organs. 47 (3), 490-501 (2023).
  18. Jamiolkowski, M. A., Pedersen, D. D., Wu, W., Antaki, J. F., Wagner, W. R. Visualization and analysis of biomaterial-centered thrombus formation within a defined crevice under flow. Biomaterials. 96, 72-83 (2016).
  19. Zhussupbekov, M., Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Massoudi, M., Antaki, J. F. Influence of shear rate and surface chemistry on thrombus formation in micro-crevice. J Biomech. 121, 110397(2021).
  20. ASTM F1841-19: Standard practice for assessment of hemolysis in continuous flow blood pumps. , ASTM International. At https://www.astm.org/f1841-19.html (2019).
  21. Sarode, D. N., Roy, S. In vitro models for thrombogenicity testing of blood-recirculating medical devices. Expert Rev Med Devices. 16 (7), 603-616 (2019).
  22. Swier, P., Bos, W. J., Mohammad, S. F., Olsen, D. B., Kolff, W. J. An in vitro test model to study the performance and thrombogenecity of cardiovascular devices. ASAIO Trans. 35 (3), 683-686 (1989).
  23. Schima, H., et al. In vitro investigation of thrombogenesis in rotary blood pumps. Artif Organs. 17 (7), 605-608 (1993).
  24. Tayama, E., et al. In vitro thrombogenic evaluation of centrifugal pumps. Artif organs. 21 (5), 418-420 (1997).
  25. Paul, R., et al. In vitro thrombogenicity testing of artificial organs. Int J Artif Organs. 21 (9), 548-552 (1998).
  26. Jamiolkowski, M. A., Snyder, T. A., Perkins, I. L., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Preclinical device thrombogenicity assessments: Key messages from the 2018 FDA, industry, and academia forum. ASAIO J. 67 (2), 214-219 (2021).
  27. Maruyama, O., Tomari, Y., Suciyama, D., Nishida, M., Tsutsui, T., Yamane, T. Simple in vitro testing method for antithrombogenic evaluation of centrifugal blood pumps. ASAIO J. 55 (4), 314-322 (2009).
  28. Olia, S. E., et al. Preclinical performance of a pediatric mechanical circulatory support device: The PediaFlow ventricular assist device. J Thorac Cardiovasc Surg. 156 (4), 1643-1651.e7 (2018).
  29. Borovetz, H. S., Olia, S. E., Antaki, J. F. Toward the Development of the PediaFlowTM Pediatric Ventricular Assist Device: Past, Present, Future. Appl Eng Sci. 11, 100113(2022).
  30. Herbertson, L. H., et al. Multilaboratory study of flow-induced hemolysis using the FDA benchmark nozzle model. Artif Organs. 39 (3), 237-248 (2015).
  31. Olia, S. E., Herbertson, L. H., Malinauskas, R. A., Kameneva, M. V. A reusable, compliant, small volume blood reservoir for in vitro hemolysis testing. Artif Organs. 41 (2), 175-178 (2017).
  32. Doherty, T. M., Shavelle, R. M., French, W. J. Reproducibility and variability of activated clotting time measurements in the cardiac catheterization laboratory. Catheter Cardiovasc Interv. 65 (3), 330-337 (2005).
  33. Chia, S., Van Cott, E. M., Raffel, C. O., Jang, I. -K. Comparison of activated clotting times obtained using Hemochron and Medtronic analysers in patients receiving anti-thrombin therapy during cardiac catheterisation. Thromb Haemost. 101 (03), 535-540 (2009).
  34. Li, H., Serrick, C., Rao, V., Yip, P. M. A comparative analysis of four activated clotting time measurement devices in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Perfusion. 36 (6), 610-619 (2021).
  35. Hastings, S. M., Ku, D. N., Wagoner, S., Maher, K. O., Deshpande, S. Sources of circuit thrombosis in pediatric extracorporeal membrane oxygenation. ASAIO J. 63 (1), 86-92 (2017).
  36. Starling, R. C., et al. Unexpected abrupt increase in left ventricular assist device thrombosis. N Engl J Med. 370 (1), 33-40 (2014).
  37. Hastings, S. M., Deshpande, S. R., Wagoner, S., Maher, K., Ku, D. N. Thrombosis in centrifugal pumps: Location and composition in clinical and in vitro circuits. Int J Artif Organs. 39 (4), 200-204 (2016).
  38. Patel, M., Jamiolkowski, M. A., Vejendla, A., Bentley, V., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Effect of temperature on thrombogenicity testing of biomaterials in an in vitro dynamic flow loop system. ASAIO J. 69 (6), 576-582 (2023).
  39. ASTM F2888-19: Standard practice for platelet leukocyte count-An in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials. , ASTM International. Available from: https://www.astm.org/f2888-19.html (2019).
  40. Patel, M., Serna, C., Parrish, A., Gupta, A., Jamiolkowski, M., Lu, Q. Alternative anticoagulant strategy to improve the test sensitivity of ASTM F2888-19 standard for platelet and leukocyte count assay. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 112 (12), e35514(2024).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Testes de TromboseTrajeto do Fluxo Sangu neoProtocolo de BancadaTempo de Coagula o AtivadoTitula o de Cloreto de C lcioDeposi o Plaquet riaPrototipagem de BombasAlternativas a Testes em Animais

Artigos relacionados