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Artigo de método

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

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DOI:

10.3791/67733

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24 de junho de 2025

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1Department of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Resumo

γ-secretase é um complexo de protease embutido na membrana celular, consistindo nas subunidades catalíticas de presenilina (PS1 ou PS2) e três cofatores adicionais: nicastrina, Aph-1 e Pen2. Ele cliva os domínios transmembranares das proteínas transmembranares do tipo I, como a proteína precursora amilóide (APP) e Notch. A clivagem da APP gera os peptídeos β amilóides (Aβ), que se acumulam em pacientes com doença de Alzheimer. Apesar de pesquisas significativas, o mecanismo exato dessa proteólise única, que ocorre dentro das bicamadas lipídicas, ainda não é totalmente compreendido. Para estudar as propriedades enzimáticas da γ-secretase, estabelecemos um sistema repórter de levedura usando substratos artificiais de γ-secretase contendo fragmentos de APP ou Notch fundidos ao ativador transcricional Gal4. A atividade da γ-secretase foi avaliada pela ativação transcricional de genes repórteres após a liberação de Gal4 dos substratos ligados à membrana, conforme avaliado pelo crescimento da levedura ou atividade da β-galactosidase. Além disso, desenvolvemos um ensaio in vitro para identificar as diferentes formas de Aβ produzidas a partir de microssomas de levedura. Esses modelos de levedura fornecem uma plataforma para rastrear mutações, genes e compostos que afetam a função da γ-secretase. Ao estudar as propriedades de perda de função dos mutantes da doença de Alzheimer familiar PS1 (FAD), é possível rastrear mutações supressoras de FAD e moduladores de γ-secretase (GSMs), além de inibidores de γ-secretase (GSIs). Neste relatório, descrevemos os métodos genéticos e bioquímicos usados para estudar a atividade da γ-secretase no sistema de levedura com as etapas essenciais do protocolo para o vídeo.

Introdução

A γ-secretase é responsável pela clivagem intramembrana de mais de 150 proteínas transmembranares tipo I, incluindo a proteína precursora amilóide (APP) e Notch1. O significado da clivagem intramembrana inclui não apenas a renovação de proteínas, mas também a transdução de sinal através dos fragmentos gerados. Por exemplo, o processamento de APP produz pequenos peptídeos de β amilóide (Aβ). Embora o Aβ deva ser removido como um produto de degradação, na doença de Alzheimer, ele se acumula no cérebro para formar placas senis2. Por outro lado, o processamento do Notch é essencial para a sinalização NOTCH3, que é crucial para o desenvolvimento. γ-secretase consiste em quatro proteínas transmembranares: presenilina (PS1 ou PS2), nicastrina (NCT), faringe anterior-1 (Aph-1a ou 1b) e intensificador de presenilina 2 (Pen2)4. Essas proteínas têm um total de 19 domínios transmembranares: existem nove em PS, sete em Aph1, dois em Pen2 e um em NCT. O PS serve como subunidade catalítica e contém dois resíduos de ácido aspártico localizados nos domínios transmembrana TM6 e TM75. Durante a maturação do complexo, o PS sofre clivagem endoproteolítica dentro de sua alça hidrofílica HL6, levando à formação de fragmentos amino-terminais e carboxi-terminais4. Mutações associadas à doença de Alzheimer familiar (FAD) são encontradas nos genes APP e PS2. Essas mutações patogênicas de sentido incorreto afetam adversamente a atividade da γ-secretase, reduzindo sua capacidade de processar efetivamente a APP. Isso leva ao aumento da produção das formas Aβ42 propensas à agregação, em vez do Aβ406 comum. Os mecanismos exatos pelos quais essas mutações interrompem a clivagem permanecem obscuros. Os moduladores da γ-secretase (GSMs), que podem alterar a proporção de Aβ42 para outras formas de Aβ, mostram-se promissores como potenciais agentes terapêuticos para o tratamento da doença de Alzheimer, diminuindo os níveis de Aβ427.

A levedura Saccharomyces cerevisiae há muito serve como organismo modelo para investigar funções-chave em células eucarióticas, como divisão celular, transporte de proteínas e autofagia. Os pesquisadores empregaram complementação funcional para estudar homólogos humanos, incluindo genes de ciclo de divisão celular (CDC), secreção (SEC) e autofagia (ATG). A transformação de mutantes de levedura com genes humanos permite que os pesquisadores analisem os processos celulares de uma perspectiva funcional. Das cinco famílias conhecidas de proteases intramembranares, a levedura possui apenas três: peptidase peptídica sinal (Ypf1), rombóides (Pcp1 e Rbd2) e enzima conversora de Ras (Rce1). No entanto, não há homólogos de γ-secretase ou protease do sítio 2 na levedura8, tornando a abordagem de complementação inadequada. Apesar da ausência de contrapartes de levedura para essas proteases, S. cerevisiae permanece valioso para explorar proteínas humanas. Técnicas como ensaios de levedura de um, dois híbridos e três híbridos, que usam o ativador transcricional de levedura Gal4, são empregadas para detectar interações entre DNA, fatores de transcrição, proteínas ou RNA9. Modificamos o sistema Gal4 para monitorar a proteólise intramembrana mediada pela γ-secretase.

Reconstituímos com sucesso a reação de clivagem da γ-secretase em leveduras, introduzindo γ-secretase humana junto com substratos artificiais fundidos a Gal4 (Figura 1) 10 . A reação de clivagem foi rastreada através do sistema repórter Gal, monitorando o crescimento da levedura ou medindo a atividade da β-galactosidase. Além disso, identificamos várias formas de Aβ (Aβ38, Aβ40, Aβ42, Aβ43 e Aβ45) liberadas em microssomas de levedura por immunoblotting (Figura 1)11.

Quando mutantes PS1 ou APP relacionados ao FAD foram introduzidos neste sistema, foram observados graus variáveis de atividade de perda de função12. Realizamos uma triagem baseada em crescimento para identificar mutações supressoras que restauram a função prejudicada desses mutantes FAD (Figura 2). Esses supressores não apenas resgataram o defeito, mas também aumentaram independentemente a atividade de corte da γ-secretase. Especificamente, eles reduziram os níveis de formas mais longas de Aβ, particularmente Aβ42, de maneira semelhante aos moduladores de γ-secretase (GSMs) que reduzem Aβ42. O sistema de reconstituição de leveduras permite a triagem de mutações, genes e compostos que regulam a atividade, incluindo inibidor da γ-secretase (GSI) e modulador (GSM)13.

O objetivo deste protocolo é atingir dois objetivos principais: i) estabelecer um sistema de triagem de γ-secretase à base de leveduras e ii) fornecer um exemplo de técnicas de reconstituição para reações enzimáticas humanas em leveduras, enfatizando a essência dos métodos de reconstituição. Descrevemos os métodos em três procedimentos principais com as seguintes etapas essenciais: 1) reconstituição da γ-secretase em levedura, 2) realização de um ensaio de γ-secretase in vitro usando microssomas de levedura e 3-5) triagem de mutações de γ-secretase e reguladores químicos em levedura.

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Protocolo

1. Medição da atividade da γ-secretase usando um sistema repórter de levedura

  1. Transforme os plasmídeos (Tabela 1) na cepa de levedura PJ-69-4A (Tabela 2) usando o método padrão de acetato de lítio para expressar γ-secretase e seu substrato14. Para reconstituir a reação de clivagem, transforme três plasmídeos: dois para γ-secretase e um para o substrato. Selecione transformantes em meio de ágar SC sem Leu, Trp e Ura (SC-LWU).
  2. Para avaliar a clivagem do substrato por crescimento, coloque cepas de levedura em meio SC-LWU também sem histidina e adenina (SC-LWHUAde) e incube a 30 ° C por 3 dias.
  3. Use o tamanho da colônia para avaliar os níveis de expressão de HIS3 e ADE2. Avalie o tamanho da colônia da seguinte forma: +++ representa o crescimento do tipo selvagem com colônias maiores que 1 mm, - representa nenhum crescimento e ++ ou + representa o crescimento parcial com colônias maiores que 0,5 mm ou menores que 0,5 mm, respectivamente. A expressão desses genes é uma medida indireta da atividade da γ-secretase (Figura 1).
  4. Para avaliar a clivagem do substrato pela atividade da β-galactosidase, ou seja, o nível de expressão de lacZ (Figura 1), cultivar cepas em meio SC-LWU a 30 °C até que a cultura atinja uma concentração de 1 x 107 células/mL, correspondendo a OD600 de 0,8-1,0.
    1. Colher células de uma cultura de 1,5 mL por centrifugação em tubo de 1,5 mL a 21.100 x g por 3 min a 4 °C, lavar com 100 μL de água gelada e ressuspender em 30 μL de tampão D (20 mM Tris/Cl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% de glicerol) com 1 mM de ditiotreitol (DTT) e coquetéis inibidores de protease PIs/água (solução 1000x: 1 M p-aminobenzamidina (pABA), 1 mg/mL antipainal, 1 mg/mL de aprotinina, 1 mg/mL de leupeptina) e PIs/DMSO (solução 1000x: 1 M fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 0,1 M N-p-Tosl-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK), 1 mg/mL de quimostatina, 1 mg/mL de pepstatina).
    2. Adicione uma conta de vidro lavada com ácido logo abaixo da superfície da solução e lise as células agitando a mistura 10x na velocidade máxima por 1 min, colocando-a no gelo em intervalos de 1 min.
    3. Centrifugar células lisadas a 21.100 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante como lisado bruto.
    4. Prepare a mistura de reação com 5-10 μL de lisado bruto e 0,4 mL de tampão Z (40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4). Inicie a reação adicionando 80 μL de solução de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) a 0,4% e, em seguida, incube a 37 ° C até que a solução fique amarelo-pálida devido à formação de nitrofenol.
    5. Pare a reação adicionando 0,2 mL de solução 1 M Na2CO3 e meça a absorbância a 420 nm para calcular a atividade da β-galactosidase.
    6. Quantificar as concentrações de proteínas em lisados brutos utilizando um kit de ensaio de proteínas, baseado no método de Bradford, utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão. Prepare o reagente de corante diluindo 1 parte do estoque de corante com 4 partes de água deionizada duplamente destilada (DDI).
    7. Misture 1-5 μL de lisado ou solução de BSA com 100 μL de corante diluído em um poço de placa de microtitulação. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min e medir a absorbância a 595 nm. Determine a concentração de proteína a partir da curva padrão BSA.
      Unidade de β-galactosidase = (1.000 x A420) / (t x c x V)
      onde t = tempo de incubação, c = concentração de proteína (mg/mL), V = volume de lisado no ensaio (mL). Uma unidade de β-galactosidase é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 μmol de ONPG para produzir o-nitrofenol e D-galactose por minuto por mg de proteína.
  5. Para confirmar a expressão das subunidades da γ-secretase e dos substratos, cultive as cepas em meio SC-LWU a 30 ° C até que a cultura atinja OD600 0,8-1,0.
    1. Colher células de uma cultura de 10 ml por centrifugação num tubo de 50 ml a 2.100 x g durante 10 min a 4 °C, lavar com 1 ml de água gelada seguida de centrifugação num tubo de 1,5 ml a 21.100 x g durante 3 min a 4 °C e ressuspender em 100 μL de tampão B88 (20 mM Hepes/KOH (pH 6,8), 250 mM de Sorbitol, 150 mM de KOAc, 5 mM de Mg(OAc)2) com 1 mM de DTT e os coquetéis inibidores de protease, PIs/água e PIs/DMSO.
    2. Adicione esferas de vidro logo abaixo da superfície da solução e lise a célula por vórtice 10x na velocidade máxima por 1 min, mantendo a mistura no gelo por intervalos de 1 min.
    3. Centrifugar lisados a 845 x g durante 2 min a 4 °C e recolher o sobrenadante como lisado total que contém a fracção de membrana.
    4. Misture 100 μL de lisado total com 96 mg de uréia e 40 μL de tampão de amostra 6x SDS (0,4 M Tris / Cl (pH 6,8), 12% SDS, 0,6M DTT, 0,05% Bromophenol Blue, 50% glicerol) e incube a 65 ° C por 10 min. A adição de uréia é necessária para evitar a agregação de presenilina.
    5. Analise a expressão da γ-secretase e seus substratos executando amostras em géis de poliacrilamida Tris / Glycine a 12,5% e immunoblotting.
    6. Detecte γ-secretase e seus substratos por anticorpos contra presenilina, nicastrina, Aph1, Gal4, FLAG, HA ou Pgk1 (controle de carga) e o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) contra IgG de camundongo (para FLAG, HA e Pgk1), IgG de coelho (para presenilina, Aph1 e Gal4) ou IgG de cobaia (para nicastrina).
    7. Para detecção quimioluminescente, misture a solução A (50 mM Tris / Cl (pH 8,5), 1,25 mM de luminol, 0,02 mM de ácido p-cumárico) com a solução B (50 mM Tris / Cl (pH 8,5), 0,009% H2O2) imediatamente antes do uso. Incube o borrão em um volume suficiente da mistura por 1 min. O volume necessário depende do tamanho do borrão; para um borrão de 10 cm x 6 cm, 4 mL são usados. Desenvolva o blot e quantifique a intensidade do sinal usando o analisador de imagem luminescente.

2. Medição da produção de Aβ por ensaio microssômico in vitro

  1. Transforme os plasmídeos APP C55, APP C99 ou γ-secretase (Tabela 1) em cepa de levedura PJ-69-4A pep4Δ conforme descrito na etapa 1.1. expressar a γ-secretase e seu substrato separadamente (Tabela 2; cepas γ311, γ312 e γ313)14. Selecione as cepas C55 e C99 no meio de ágar SC-U e a cepa de γ-secretase no meio de ágar SC-LW.
  2. Isolar os microssomas de estirpes de levedura que expressam APP C55, APP C99 ou γ-secretase de acordo com o protocolo padrão11. Separe os microssomas por centrifugação com gradiente de densidade de sacarose e recupere na interface de sacarose de 1,2 M-1,5 M usando uma pipeta de plástico descartável. Determine a concentração de proteína nos microssomas medindo a absorbância a 260 nm após solubilizá-los em SDS a 0,2%.
  3. Prepare a mistura de reação com dois microssomas, ou seja, APPC55 ou γ-secretase, contendo 40 μg de proteína cada e γ-tampão (50 mM PIPES/KOH (pH 7,0), 250 mM de sacarose, 1 mM EGTA) em um volume final de 12,5 μL. Solubilize misturando com um volume igual (12,5 μL) de 2% de CHAPSO em tampão γ e incube em 1% de CHAPSO por 1 h.
  4. Para iniciar a reação, dilua as misturas quatro vezes até um volume final de 100 μL usando γ-tampão contendo 1x mistura de inibidor de protease (PI): 50 μM de diisopropil fluorofosfato (DIFP), 50 μM de PMSF, 0,1 μg/mL de N α-p-tosil-L-lisina clorometilcetona (TLCK), 0,1 μg/mL de anti-dor, 0,1 μg/mL de leupeptina, 0,1 mM de EGTA, 1 mM de tiolfano e 5 mM de fenantrolina (PNT) a 0,25% de CHAPSO com 400 μg/mL de proteínas. Incubar a mistura de reação a 37 °C durante 24 h. Se necessário, adicione 0,1% de fosfatidilcolina (PC), 10 μM L685,458 ou DAPT (inibidores da γ-secretase).
  5. Pare a reação adicionando 500 μL de clorofórmio / metanol (2: 1) e incube por 1 h com vórtice intermitentemente. Adicione 900 μL de metanol, misture e centrifugue a 21.100 x g por 15 min para coletar os peptídeos Aβ no pellet.
  6. Lave o pellet com 500 μL de clorofórmio/metanol/água (1:2:0,8), deixe-o secar ao ar, suspenda-o em 40 μL de tampão de amostra SDS e ferva a mistura por 10 min. Analise a produção de Aβ executando amostras em um gel de poliacrilamida Tris / Tricine a 16,5%. Para identificar as formas Aβ, use um gel de poliacrilamida Tris/Tricine a 10% com ureia 8 M (pH 8,45).
  7. Detecte Aβ por immunoblotting usando o anticorpo 82E1 específico para o local Asp-1 de Aβ humano e o anticorpo secundário conjugado com HRP contra IgG de camundongo. Para detecção quimioluminescente, misture quantidades iguais de solução A e B imediatamente antes do uso, conforme descrito na etapa 1.5.7, e incube o blot em um volume suficiente da mistura por 1 min. O volume necessário depende do tamanho do borrão; para um borrão de 10 cm x 6 cm, 4 mL são usados.
  8. Desenvolva o blot e quantifique a intensidade do sinal usando o analisador de imagem luminescente.

3. Triagem de mutações γ-secretase ou APP com efeito modulatório

  1. Para gerar mutações aleatórias por PCR propenso a erros, projete primers para incorporar regiões sobrepostas de 40 pb do gene de interesse na extremidade 5 'de cada primer.
  2. Prepare 50 μL de reação de PCR propensa a erros em 1x tampão Taq com 50 ng de DNA molde, 0,2 mM dGTP, 1 mM dATP/dTTP/dCTP, 3 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 1,25 U Taq polimerase e 400 nM primers. Use o seguinte protocolo de PCR: 94 °C por 5 min, seguido por 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 120 s, terminando com 72 °C por 10 min. Essa configuração produz uma taxa de mutação aproximada de 1,9 mutações por quilobase10.
  3. Transforme os fragmentos de DNA mutagênicos (4 μg) com DNA de plasmídeo linearizado (4 μg) em cepa de levedura PJ69-4A contendo mutações FAD APP ou PS114. A sobreposição de 40 pb nos primers facilita a recombinação homóloga entre os fragmentos na levedura, levando à reconstrução do plasmídeo. Selecione transformantes em placas SC-LWU conforme descrito na etapa 1.1.
  4. Conte os transformantes nas placas SC-LWU e replique-os nas placas SC-LWHUAde usando veludo. Para replicar, pressione a placa transformadora em um bloco cilíndrico coberto de veludo e, em seguida, pressione uma nova placa SC-LWHUAde no veludo para transferir as colônias. As cepas que expressam mutantes APP ou PS1 FAD crescem mal em SC-LWHUAde, enquanto aquelas com mutações modulatórias exibem crescimento robusto e formam colônias.
  5. Para recuperar o DNA do plasmídeo de clones positivos, cultivar as cepas em 3 mL de meio SC-LWU durante a noite a 30 ° C até OD600 >1,0. Centrifugue as células em um tubo de 15 mL a 2.100 x g por 10 min a 4 ° C, lave com 0,8 mL de água gelada seguida de centrifugação em um tubo de 1,5 mL a 21.100 x g por 3 min a 4 ° C e, em seguida, ressuspenda em 0,3 mL de solução de lise (10 mM Tris / Cl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% Triton X-100, 1% SDS).
  6. Lise as células adicionando 0,3 mL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) e 0,3 g de esferas de vidro. Vortex na velocidade máxima por 10 min, depois centrifugue a 21.100 x g por 10 min em temperatura ambiente.
  7. Após a centrifugação, a amostra se separa em uma fase aquosa superior e uma fase fenol inferior. Recuperar a fase aquosa e misturar com 30 μL de acetato de sódio 3 M e 700 μL de etanol a 100%. Evite levar materiais na interfase.
  8. Centrifugue a solução a 21.100 x g por 10 min a 4 ° C, lave o pellet com etanol a 70%, seque ao ar e ressuspenda em 15 μL de tampão TE.
  9. Como a concentração de DNA do plasmídeo é normalmente muito baixa para análise posterior, é necessário amplificá-la em E. coli. Transformar o DNA do plasmídeo em E. coli DH5α por métodos de transformação de alta eficiência15 e purificar para análise posterior. Identifique mutações por sequenciamento de DNA usando o método de Sanger16.
  10. Este método é aplicável a plasmídeos mutagénicos preparados por métodos diferentes (como nos passos 3.1 e 3.2). Se tiver como alvo regiões específicas de proteínas, projete primers de PCR inversos com nucleotídeos aleatórios. Após PCR e ligação para circularizar o DNA do plasmídeo, uma biblioteca de plasmídeos mutagênicos é obtida. Introduza mutações específicas usando o kit de mutagênese específico do local.

4. Triagem para inibidor da γ-secretase (GSI) em levedura

  1. Use a triagem química de alto rendimento de GSI desenvolvida com base no crescimento de leveduras ou no ensaio de β-galactosidase, conforme descrito abaixo.
  2. Realize a triagem de GSI com cepas de levedura, γ124, γ126 e γ190 (Tabela 2). Selecione candidatos a GSI como compostos que reduzem o crescimento ou a atividade da β-galactosidase da γ-secretase do tipo selvagem em APP (γ124) e/ou Notch (γ126) (Tabela 3).
  3. Selecione GSIs poupadores de APP ou Notch específicos do substrato. Excluir compostos tóxicos por contra-peneiramento com a expressão de Gal4 solúvel. Os candidatos a GSI não devem afetar o crescimento ou a atividade da β-galactosidase da cepa de controle Gal4 (γ190) (Tabela 3).
  4. Para o ensaio de crescimento, cultive cepas em meio SC-LWHUAde contendo GSIs potenciais em placas de 384 poços de OD600 de 0,03. Incubar durante a noite a 30 °C sem agitar. Monitore o crescimento após 24 h por OD600.
  5. Para ensaios de β-galactosidase em um formato de 384 poços, cultive cepas até uma concentração de 1 x 107 células/mL em meio SC-LWU contendo GSIs potenciais. Lisar as células usando o sistema de ensaio Beta-Glo e medir a atividade da β-galactosidase usando 6-o-β-galactopiranosil-luciferina como substrato de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Para candidatos a GSI, medir a produção de Aβ por ensaio microssômico in vitro para confirmar o efeito inibitório.

5. Triagem para modulador de γ-secretase (GSM) em levedura

  1. Use a triagem química de alto rendimento do GSM, que foi desenvolvida com base no crescimento de leveduras ou no ensaio de β-galactosidase, conforme descrito abaixo.
  2. Realize a triagem GSM com cepas de levedura, γ106, γ112 e γ5 (Tabela 2). Selecione candidatos GSM como compostos que aumentam o crescimento ou a atividade da β-galactosidase de cepas mutantes FAD PS1 (γ106 e γ112) ou FAD APP (Tabela 4). Excluir produtos químicos ativadores repórteres não específicos por contra-peneiramento com a cepa sem γ subunidade catalítica secretase. Os candidatos GSM não devem afetar o crescimento ou a atividade da β-galactosidase da cepa controle sem PS1 (γ5) (Tabela 4).
  3. Para o ensaio de crescimento, cultive cepas em meio SC-LWHUAde contendo GSMs potenciais em placas de 384 poços de OD600 de 0,03. Incubar durante a noite a 30 °C sem agitar. Monitore o crescimento após 48 h por OD600.
  4. Para ensaios de β-galactosidase em um formato de 384 poços, cultive as cepas até uma concentração de 1 x 107 células/mL em meio SC-LWU contendo GSMs potenciais. Lisar as células usando o sistema de ensaio Beta-Glo e medir a atividade da β-galactosidase usando 6-o-β-galactopiranosil-luciferina como substrato de acordo com o protocolo do fabricante.
  5. Para os candidatos GSM, medir a produção de Aβ por ensaio microssômico in vitro para confirmar o efeito modulador, ou seja, a redução das formas tóxicas de Aβ Aβ42 e Aβ43.

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Resultados

Usando as técnicas descritas até agora, analisamos genes, mutações, substâncias químicas e peptídeos como fatores que afetam a atividade da γ-secretase 10,11,12,13,17,18,19. A triagem baseada no crescimento de genes e mutações permite o teste de um grande nú...

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Discussão

Etapas críticas no protocolo e solução de problemas
A reconstituição da γ-secretase em leveduras usando métodos genéticos e bioquímicos é relativamente simples, mas existem algumas etapas críticas para garantir o sucesso.

Durante a transformação da levedura (etapas 1.1, 2.1 e 3.3), vários plasmídeos devem ser introduzidos: dois para os componentes da γ-secretase e um para os substratos. A transformação sequencial (uma de cada vez) também po...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 22K06121. Os autores desejam agradecer o apoio dos membros do Laboratório de Enzimologia da Universidade de Tohoku.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpos
anti-Amiloide & beta; (N) (82E1) anticorpoIBLCat# 10323
anticorpo antiAph1a, 245-265 (C terminal)BioLegendCat# 823101
Anticorpo anti-FLAG (M2)SigmaCat# F3165
Anticorpo anti-Gal4SigmaCat# G9293
Anticorpo anti-HA (12CA5)SigmaCat# 11 583 816 001
Anticorpo anti-NicastrinChemiconCat# AB5890
anticorpo anti-PGK1 (22C5D8)AbcamCat# ab197960
anticorpos anti-PS1 N-terminal (G1Nr) ou laço (GIL)Takasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205
Anti Coelhos  IgG, anticorpo ligado ao HRPSinalização de CelularCat# 7074
IgG-HRP anti-cobaiaSanta Cruz BiotecnologiaCat# sc-2438
anti-camundongo, anticorpo ligado ao HRPSinalização de CelularCat# 7076
Cepas bacterianas e de leveduras
E. coli DH5 & Alpha;InvitrogenCat# 18265017
S. cerevisiae PJ-69-4AJames P. et. al., Genética 144:1425-1436 (1996)
Químicos, peptídeos, proteínas recombinantes
(3,5-Difluorofenilacetil)-Ala-Phg-OBut (DAPT)Instituto de PeptídeosCat# 3219-v
Amiloide &beta-proteína (Humano, 1-38)Instituto de PeptídeosCat# 4484-v
Proteína amiloide β-(Humano, 1-40)Instituto de PeptídeosCat# 4307-v
Proteína amiloide &beta-proteína (Humano, 1-42)Instituto de PeptídeosCat# 4349-v
Amiloide &beta-proteína (Humano, 1-43)Instituto de PeptídeosCat# 4370-v
Antidor, di-hidrocloretoInstituto de PeptídeosCat# 4062
aprotinininaSigmaCat# A1153
CHAPSODojindoCat# 343-05163
QuimostatinaSigmaCat# C7268
Diisopropil fluorofosfato (DIFP)Química WakoCat# 049-18921
L685.458Instituto de PeptídeosCat# 4394-v
LeupeptinInstituto de PeptídeosCat# 4041
N-p-Tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK)SigmaCat# T4376
Nα -p-tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK)SigmaCat# T7254
o-nitrofenil-β-D-galactopiranódeo (ONPG)SigmaCat# N1127
p-aminobenzamidina (pABA), di-hidrocloretoSigmaCat# 857661
Pepstatina ASigmaCat# P5318
Fenantriolina (PNT)SigmaCat# P9375
Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)SigmaCat# P7626
fosfatidil colina (PC), gema de ovo, Tipo XVI-ESigmaCat# P3556
Taq DNA polimeraseTakaraCat# R001A
ThiolphanSigmaCat# T6031
kits comerciais de ensaio, outros materiais e instrumentos
Sistema de Ensaio Beta-GloPromegaCat# E4720
Kit de ensaio de proteínas Bio-RadBio-RadCat# 5000001
Contas de vidro, lavadas com ácido (425-600 & mu; m)SigmaCat# G8772
ImageQuant LAS4000GE HealthcareImageQuant LAS4000
Kit de Mutagênese Dirigido por Site QuikChangeAgilentCat# 200518

Referências

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