Conteúdo de flavonóides durante o crescimento e desenvolvimento floral de Calendula officinalis L.

Resumo

Aqui, apresentamos o método colorimétrico de cloreto de alumínio, uma técnica analítica direta para determinar quantitativamente os flavonóides na calêndula. Essa abordagem utiliza uma reação química direta envolvendo o tratamento do extrato de calêndula com um reagente de cloreto de alumínio, formando um complexo colorido. A intensidade da cor, avaliada por espectrofotometria, correlaciona-se com a concentração de flavonóides.

Resumo

Calêndula (Calendula officinalis L.) com múltiplos usos, notadamente suas aplicações medicinais devido à sua riqueza e diversidade em metabólitos secundários, como os flavonóides, que possuem propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes. Este estudo analisou o crescimento das plantas e a distribuição de biomassa, bem como a concentração total de flavonóides em flores tubulares, liguladas e cabeças de flores ao longo do desenvolvimento floral. . A iniciação e diferenciação floral ocorreram cinco semanas após o transplante, seguindo um padrão sigmóide de acúmulo de biomassa em seus órgãos, bem como na altura da planta. Os órgãos aéreos atingiram uma biomassa máxima de 76 g/g/planta no dia 69. A taxa máxima de crescimento absoluto foi de 2,38 g/dia aos 62 dias, enquanto a maior taxa de crescimento relativo foi registrada nos órgãos reprodutivos no dia 48 (0,137 g/g/dia). Os flavonóides, expressos como equivalentes de quercetina, apresentaram concentrações mais altas durante os estágios, variando de botões florais prestes a abrir a cabeças de flores totalmente abertas (145-177 mg/g de matéria seca). Esses achados enfatizam a importância da colheita em estágios ideais para maximizar o teor de flavonóides e alavancar seu potencial para aplicações terapêuticas e comerciais.

Introdução

O crescente interesse em metabólitos secundários de plantas medicinais é impulsionado por suas diversas aplicações nas indústrias farmacêutica, terapêutica, cosmética e outras. Entre eles está Calendula officinalis L., uma planta herbácea anual da família Asteraceae nativa da região do Mediterrâneo¹ mas amplamente cultivada em todo o mundo, ganhou reconhecimento devido aos vários usos de suas flores, incluindo aplicações ornamentais, medicinais, industriais e culinárias². Atualmente, a Inglaterra é o maior produtor mundial de C. officinalis³.

As cabeças florais são o órgão mais utilizado dessa planta, pois contêm compostos bioativos como flavonoides, carotenoides, terpenoides, óleos essenciais, taninos, cumarinas, carboidratos e ácidos graxos 3,4,5,6. Esses compostos naturais contribuem para suas propriedades farmacológicas, incluindo efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, antimicrobianos e cicatrizantes⁷. Historicamente, C. officinalis, comumente conhecido como calêndula, tem sido usado em sistemas de medicina tradicional, como Ayurveda e homeopatia, para aliviar uma ampla gama de doenças, desde feridas na pele e distúrbios gastrointestinais até irregularidades menstruais e condições inflamatórias⁸. As aplicações modernas se estendem às indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética, onde os extratos de calêndula são incorporados em cremes, soros, tinturas e sistemas de administração de medicamentos⁹. Apesar da extensa pesquisa, permanecem desafios na exploração total do potencial terapêutico de C. officinalis. A variabilidade na concentração de compostos bioativos devido a fatores ambientais e de cultivo destaca a necessidade de processos padronizados de extração e formulação. A atividade biológica dos flavonoides e sua identificação nos tecidos vegetais são aspectos essenciais do controle de qualidade ^10,11.

No México, o cultivo de calêndula geralmente ocorre sem uma compreensão detalhada de seus processos de crescimento e desenvolvimento floral, limitando assim seu desempenho fisiológico, rendimento e a correlação entre compostos bioativos e fatores agronômicos. A concentração e distribuição de flavonoides nos tecidos vegetais são influenciadas pelas condições de crescimento e cultivo, ressaltando a importância do estudo dos processos fisiológicos e de desenvolvimento dessa espécie.

Este estudo teve como objetivo analisar a distribuição de biomassa e as relações sumidouro-fonte nos órgãos vegetativos e reprodutivos de C. officinalis, para identificar os principais eventos de desenvolvimento floral, e quantificar a concentração total de flavonoides nas cabeças das flores por meio de um método microespectrofotométrico aqui proposto. As descobertas visam otimizar as práticas agrícolas e melhorar a qualidade dos produtos derivados dessa planta.

Protocolo

1. Materiais e métodos gerais

1. Experimento de campo para detecção de iniciação floral
   1. Configure o experimento em condições de campo. Transplante mudas de calêndula em uma área de 153 m² com densidade de plantio de plantas por metro quadrado, espaçadas de 60 cm.
   2. Estabelecer o sistema de irrigação por gotejamento localizado com calibre 16/8000 NOTA: O lote de sementes usado neste experimento foi colhido de um único genótipo e, em seguida, selecionado pelo método de melhoramento por seleção em massa em três ciclos de cultivo anteriores. Para um clima temperado, a época de semeadura é melhor na primavera, seguida pelo transplante aproximadamente 2 meses depois, quando as mudas estão prontas. A irrigação é recomendada uma vez por semana. Pragas e doenças devem ser evitadas, e o manejo agronômico deve ser realizado com base nas necessidades da cultura.
2. Colete amostras de plantas selecionadas a cada dois dias, começando 14 dias após o transplante. Procure o meristema apical sob um microscópio estereoscópico (cerca de 40X) para determinar a data de aparecimento do primórdio da inflorescência.
   NOTA: Quando o meristema floral (FM) aparece em pelo menos metade das amostras, essa data pode ser registrada como a idade adequada para FM. A unidade experimental para observar a iniciação floral foi de cinco meristemas em uma única planta, com oito repetições (plantas). Análise de crescimento e desenvolvimento floral
   1. Colete o capítulo apical quando o botão floral se abrir.
      NOTA: Certifique-se de que as flores liguladas estejam visíveis.
   2. Realizar coletas de órgãos florais durante os últimos sete estágios florais¹² (Figura 1).
      NOTA: Neste experimento, cinco capítulos de oito plantas diferentes foram utilizados em cada estádio fenológico. Em todos os casos, as flores foram coletadas da parte apical da planta.
   3. Amostra de plantas inteiras seis vezes ao longo do ciclo biológico.
   4. Secar as amostras recolhidas durante 48 h. Meça o peso seco dos órgãos vegetativos e reprodutivos.
      NOTA: A secagem é recomendada a 40 °C em um forno de circulação de ar.
   5. Calcule a Força do Sumidouro (SS) e a Atividade do Sumidouro (SA) para órgãos vegetativos e reprodutivos¹³.
      NOTA: Para SS e SA, use as fórmulas equivalentes à Taxa de Crescimento Absoluto (AGR) e à Taxa de Crescimento Relativo (RGR), respectivamente.
   6. Trace curvas de crescimento usando uma planilha.

2. Quantificação de flavonóides totais¹⁴

1. Secar o material vegetal numa estufa de ar forçado a 40 °C durante 48 h.
2. Armazene o material seco em sacos de papel. Mantenha-os no escuro à temperatura ambiente (RT).
3. Congele o material vegetal usando nitrogênio líquido para prepará-lo para moer.
4. Moa o material congelado em uma argamassa de porcelana até atingir uma textura uniforme.
   NOTA: Tenha cuidado ao manusear nitrogênio líquido, pois ele pode espirrar ao entrar em contato com o material vegetal.
5. Preparação da amostra: Pesar 25 mg de matéria seca pulverizada de cada amostra. Adicione 500 μL de metanol a 80%.
6. Extração de flavonóides: Incubar a mistura em ultrassom a 70 °C por uma h. Em seguida, centrifugar a 731 g durante 13 min¹⁵.
7. Prepare alíquotas: Pegue 150 μL do extrato obtido e adicione 37 μL de metanol a 80%.
8. Misture 50 μL do extrato, 100 μL de cloreto de alumínio a 10% e 100 μL de acetato de potássio 1 M. Adicione água destilada para elevar o volume total para 5 mL.
9. Deixe a solução repousar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
10. . Um espectrofotômetro foi usado para medir a absorbância a 415 nm.
11. Gerar curva de calibração: Prepare uma solução estoque dissolvendo 2,7 mg de quercetina em 10 mL de metanol a 80%. A partir deste estoque, prepare uma série de 5 soluções de quercetina variando de 50, 100,175, 250 e 350 μL. e dilua para 10 mL.
12. Prepare amostras de calibração: Para cada solução de quercetina (500 μL), adicione 100 μL de cloreto de alumínio a 10% e 100 μL de acetato de potássio 1M, 1,5 mL de metanol a 80% e 2,8 mL de água destilada.
13. Deixe a solução descansar por 40 minutos em temperatura ambiente.
14. Medir a absorvância das amostras de calibração a 415 nm com o espectrofotómetro. Registar os valores de absorvância para construir a curva de calibração.
    NOTA: Compare a concentração total de flavonóides em flores de raio, flores tubulares e cabeças de flores inteiras. Este experimento utilizou um delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco repetições por tratamento. A variável resposta foi a concentração de flavonoides; as médias dos tratamentos foram comparadas com o teste de Tukey (SAS Institute, 2003).

Resultados

O crescimento de C. officinalis exibiu cinética de acúmulo de biomassa sigmóide em toda a planta e seus órgãos. Essa observação se alinha com relatos de outros autores, que exibem consistentemente uma curva de crescimento sigmóide. Entre os órgãos aéreos, os caules acumularam mais biomassa (Figura 3). O crescimento inicial em todos os órgãos aéreos foi lento, com floração e desenvolvimento de gemas começando no dia 41. A planta atingiu sua biomassa máxima no dia 69, com média de 76 ...

Discussão

Dois tipos de flores, liguladas e tubulares, foram identificados (Figura 5). Descobrimos que as flores liguladas contêm uma concentração menor de flavonóides do que as flores tubulares, com diferenças variando de 11% a 53%. Isso indica que as flores tubulares acumulam mais flavonóides do que as flores liguladas, pois as flores tubulares têm mais biomassa e maior concentração desses compostos.

Quando comparados os estágios florais ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Forno de circulação de ar	Precision 17 GCA Corp.	N/A
Equipamento Bug clean	Alternagro	N/A	Controle de pragas agrícolas com óleos e extratos vegetais
Metanol grau analítico	merck	822283	Reagente
Nitrofoska especial 12+12+17+2 MgO+8 S	EUROCHEM	7/548/CEE,1999/45/CE	NPK - fertilizante granular contém: nitrato de amônio, sais de amônio, fosfatos, sais de cálcio, potássio, em alguns casos magnésio e oligoelementos. 1H-Pirazol, 3,4-dimetil-, fosfato (1:1)
PHC Healthy Start	PHC México	N/A	PHC Healthy Start 12-16-12 é um fertilizante para melhorar a nutrição, cor e vigor das plantas.
Quercetina	Sigma-Aldrich	204-187-1	Substância padrão