Este protocolo descreve um método eficiente, simples e minimamente invasivo para o estudo de nódulos pulmonares. A coleta de sangue da veia submaxilar e a microtomografia computadorizada são usadas como técnicas de investigação.
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Artigo de método
* These authors contributed equally
Este protocolo descreve um método eficiente, simples e minimamente invasivo para o estudo de nódulos pulmonares. A coleta de sangue da veia submaxilar e a microtomografia computadorizada são usadas como técnicas de investigação.
A microtomografia computadorizada (microtomografia computadorizada) é uma técnica em tempo real, intuitiva, sensível e minimamente invasiva para monitorar alterações de nódulos pulmonares (NP) para câncer de pulmão (CP). A integração da amostragem de sangue da veia submandibular permite a detecção rápida, estável e direta de imagens e alterações do alvo principal durante a progressão da NP para LC. Neste estudo, administramos uma dose de 100 mg/kg de 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona em camundongos A/J para desenvolver um modelo de adenocarcinoma de pulmão. A progressão da doença nos animais experimentais foi então monitorada por meio de coleta de sangue da veia submandibular e ensaio de micro-CT. Os resultados experimentais mostraram a presença de focos nodulares nos pulmões de alguns animais na10ª semana, com o desenvolvimento de imagens de adenocarcinoma de pulmão tornando-se evidente na21ª semana. Em conclusão, a micro-CT pode efetivamente observar alterações patológicas nos pulmões de camundongos e, quando combinada com a amostragem de sangue da veia submandibular, pode monitorar dinamicamente as alterações no sangue, proteínas e alvos. Este método fornece uma abordagem altamente específica, simples e sensível para triagem de drogas, testes farmacocinéticos, experimentos toxicológicos e estudos de segurança.
O câncer de pulmão (CP) é uma neoplasia grave originada na mucosa brônquica ou nas glândulas pulmonares. De acordo com estatísticas de 2021, a CL causa aproximadamente dois milhões de mortes em todo o mundo a cada ano, com taxas de incidência e mortalidade em ascensão1. O diagnóstico e a intervenção precoces na CP contribuem para maiores taxas de cura, redução da mortalidade e menores custos de tratamento. Os nódulos pulmonares (NP) são precursores específicos da CL, caracterizados por sombras sólidas ou subsólidas localizadas, arredondadas e mais densas ≤30 mm de diâmetro nos exames radiológicos, sem evidência de colapso pulmonar, linfonodomegalia mediastinal ou derrame pleural2. A National Comprehensive Cancer Network (NCCN) em 2022 categorizou a NP por número, diâmetro e densidade, identificando combinações como um nódulo em vidro fosco isolado de 5 mm no pulmão direito3. No entanto, as diretrizes da NCCN indicam que o risco de malignidade na NP aumenta com o diâmetro e a quantidade dos nódulos. A aplicação generalizada da tomografia computadorizada de baixa dose aumentou drasticamente os diagnósticos de NP, com milhões de novos casos identificados a cada ano4.
A combinação de camundongos A/J com 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) é o modelo animal mais comumente usado para câncer de pulmão (CL)5,6. O uso de micro-CT juntamente com a amostragem de sangue da veia submandibular é uma abordagem eficaz para o monitoramento em tempo real das alterações de nódulos pulmonares (NP) para CP. A indução química de carcinógenos, particularmente em camundongos NNK e A/J, é o método mais prevalente para modelagem de câncer de pulmão e provou ser uma abordagem eficaz para o estabelecimento de carcinoma in situ 7,8. Este método de modelagem simula com mais precisão a progressão de NP para LC em comparação com o método de inoculação axilar.
Estudos anteriores se concentraram na análise estatística da morfologia do nódulo e na coloração patológica de amostras de tecido pós-eutanásia9. No entanto, esses métodos carecem da capacidade de monitoramento em tempo real da progressão dinâmica do NP para o LC10. A micro-TC, como técnica de imagem não invasiva, fornece dados longitudinais precisos com alta resolução, imagem rápida, baixa dose de radiação e segurança, tornando-a adequada para detectar imagens pulmonares em tempo real11,12. A amostragem de sangue da veia submandibular é o método mais recente, simples e rápido para obter amostras de sangue de camundongos13. Essa técnica não invasiva requer manuseio mínimo de animais e permite uma recuperação rápida, alinhando-se aos princípios 3R que visam reduzir o número de animais usados em pesquisas, minimizar o desconforto e promover o tratamento ético. O volume sanguíneo coletado, aproximadamente 0,2-0,5 mL, é suficiente para monitorar os parâmetros sanguíneos com necessidades moderadas14.
O uso concomitante de micro-TC e amostragem de sangue da veia submandibular permite a observação dinâmica e em tempo real da progressão de NP para LC em imagens e a detecção em tempo real de alvos-chave na corrente sanguínea15. Além disso, essa abordagem permite a investigação em tempo real de metabólitos e outros bioquímicos, que, quando combinados com técnicas como cromatografia de alta eficiência, avançam nossa compreensão da CL16,17.
Neste estudo, camundongos A/J combinados com NNK foram usados para criar um modelo de camundongo com câncer de pulmão in situ. Microtomografias computadorizadas foram realizadas em 4, 10 e 20 semanas após a indução do modelo para capturar imagens pulmonares, enquanto o sangue foi coletado por meio de amostragem de veias submandibulares durante todo o experimento. Este estudo tem como objetivo estabelecer uma base para a pesquisa de NP e LC, combinando amostragem de sangue da veia submandibular com micro-CT.
Em oncologia, a micro-TC é uma ferramenta altamente eficaz para detectar o crescimento tumoral, oferecendo uma técnica de alta resolução para medir as mudanças locais de foco de sombra a qualquer momento durante esses estudos18,19. No entanto, é essencial reconhecer que a micro-CT sozinha não fornece informações sobre as características do foco de sombra, o estado fisiológico do animal ou os níveis dos principais fatores biológicos. Portanto, a amostragem da veia submandibular foi utilizada como método complementar neste estudo.
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Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu e foram conduzidos de acordo com as leis e padrões éticos relevantes para pesquisa com animais (número da revisão: 2024035). Camundongos fêmeas endogâmicos A/JGpt (7-8 semanas de idade) foram mantidos a uma temperatura de 20-24 °C com umidade relativa de 40%-70%. Eles receberam ração animal padrão e água purificada ad libitum durante um ciclo claro-escuro de 12 horas. Antes do experimento, cada animal foi aclimatado a esse ambiente por 7 dias. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Reagentes e preparação animal
2. Imagem in vivo por micro-CT
NOTA: Sempre remova objetos de metal, como brincos, do animal de teste antes de usar a microtomografia computadorizada. Objetos de metal podem causar artefatos graves na imagem. Micro-CT emite uma certa quantidade de radiação; garantir que outros resultados experimentais não sejam afetados.
3. Tratamento e análise de dados
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Este estudo demonstrou a construção de um modelo estável de câncer de pulmão usando NNK em combinação com camundongos A/J. O desenho experimental é ilustrado na Figura 1. O objetivo foi observar o processo em tempo real da transição de nódulos pulmonares (NP) para câncer de pulmão (LC) em pulmões de camundongos, utilizando micro-TC e amostragem de sangue de veias submandibulares. Assim, a microtomografia computadorizada e a coleta de sangue dos pulmões do camundongo foram realizadas na quart...
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É importante reiterar vários pontos-chave deste estudo. Em primeiro lugar, embora a coleta de sangue da veia submandibular seja um procedimento de lesão relativamente baixa, ela ainda pode resultar em algum grau de dano aos animais. Portanto, é necessário realizar vários procedimentos para reduzir a carga sobre os camundongos e concluir o processo em tempo hábil27. Em segundo lugar, a remoção do cabelo antes da coleta da amostra de sangue garante a pureza da amost...
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Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecemos ao Professor Cong Huang, da Escola de Ciências Médicas Básicas, e ao Professor Yan Huang, da Escola de Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, por seu apoio. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Binjie Xu e ao Dr. Pengmei Guo. (Instituto Inovador de Medicina e Farmácia Chinesa, Chengdu
Universidade de Medicina Tradicional Chinesa) por fornecer instrumentos e suporte técnico.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos A/J | GemPharmatech LLC. | ||
| tubos EDTA de 0,5 mL Labshark | |||
| 1-Butanona,4-(metilnitrosoamino)-1-(3-piridinil) | Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co. | ||
| 75% de etanol | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2023052901 | |
| Barbeador animal | Codos | BM010220 | |
| Isoflurano | Shenzhen Reward Life Technology Co. | R510-22-16 | |
| tricorder médico | MedChemexpress | 69652 | |
| Quantum GX2 microCT sistema de imagem | PerkinElme | 2020166501 | |
| solução salina (medicina) | Beijing Biolabs Technology Co. | GL1736 |
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