Method Article

Plug-in Micro-Manager de código aberto para imagens de visualização ao vivo de dipolos fluorescentes

DOI:

10.3791/67755

⸱

March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvemos um plug-in Micro-Manager de código aberto, que permite a observação ao vivo de dipolos fluorescentes em um microscópio de iluminação estruturada. O plug-in suporta a observação da orientação do dipolo 2D e 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia de polarização de fluorescência (FPM) pode obter imagens da posição e orientação do dipolo dos fluoróforos. Apesar das conquistas da microscopia de polarização de fluorescência de super-resolução, sua dependência da pós-aquisição dificulta a observação em tempo real. A microscopia de iluminação estruturada polarizada (pSIM) oferece imagens de super-resolução de dipolos fluorescentes com velocidade de imagem rápida e é adequada para aplicações de células vivas. Desenvolvemos uma implementação de código aberto para reconstrução em tempo real de imagens de polarização e exibição dos dipolos fluorescentes. Além disso, estendemos o método para obter o mapeamento de orientação 3D (3DOM), ampliando sua utilidade para estudos biológicos complexos. Além disso, apresentamos uma introdução completa à extensão de um microscópio SIM existente em imagens de polarização e fornecemos um guia de configuração detalhado do Micro-Manager 2.0 para controlar o microscópio, permitindo a visualização em tempo real da imagem polarizada. Além disso, fornecemos o código MATLAB para reconstrução completa, abrangendo pSIM e 3DOM. Este guia abrangente tem como objetivo ajudar os iniciantes a dominar rapidamente e iniciar facilmente as operações.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia de polarização de fluorescência (FPM) surgiu como uma técnica poderosa para obter imagens simultâneas da posição e da orientação do dipolo dos fluoróforos, oferecendo insights profundos sobre imagens biológicas 1,2. Ao facilitar a observação da direção das orientações das biomoléculas, o FPM revela o intrincado arranjo de macromoléculas como actina 3,4,5, microtúbulo5, septina6, filamento de DNA 7-9, complexo de poros nucleares10 e proteínas de membrana11. Seus recursos de alta velocidade, não invasivos e compatíveis com células vivas permitem o rastreamento da dinâmica de rotação molecular com alta resolução temporal11,12. Quando integrado com sondas de bioforça, o FPM não apenas mapeia as magnitudes de força na resolução subcelular, mas também mede as direções das forças, avançando assim nossa compreensão dos processos biomecânicos, revelando a direção das forças13.

Nas últimas décadas, a microscopia de polarização de fluorescência de super-resolução passou por uma rápida evolução. Um avanço notável neste campo é a microscopia de localização de orientação de molécula única, também denominada SMOLM, que pode localizar a posição e a orientação dos fluoróforos, permitindo assim a localização multidimensional. A medição de polarização no SMOLM pode ser realizada usando modulação de excitação de polarização7, detecção polarizada multicanal3 ou função de propagação de ponto sensível à polarização projetada (PSF) 14 . Apesar do SMOLM atingir resolução espacial da ordem de dezenas de nanômetros e medir a polarização de moléculas individuais, ele sofre com o tempo de imagem prolongado. Isso se deve aos ciclos repetitivos de piscar e localização de fluoróforos, que representam um desafio para imagens de taxa de vídeo e aplicações de células vivas.

Em contraste, a microscopia de iluminação estruturada polarizada (pSIM) oferece uma resolução espacial de aproximadamente até 100 nm, juntamente com a aquisição de informações de polarização com o mesmo conjunto de dados SIM. Notavelmente, o pSIM pode atingir velocidades de imagem de taxa de vídeo e é altamente compatível com imagens de células vivas, sem requisitos rigorosos em moléculas fluorescentes. Recentemente, o pSIM revelou com sucesso a estrutura do anel de actina no esqueleto periódico associado à membrana (MPS) 5 e permitiu o mapeamento de super-resolução de forças biológicas13 .

No entanto, o pSIM requer reconstrução de imagem pós-aquisição, o que impede a visualização em tempo real dos resultados da polarização. Esse atraso dificulta a observação imediata do fenômeno biológico, impedindo que os pesquisadores capturem rapidamente os fenômenos biológicos de interesse e façam ajustes em tempo real nas amostras e nas condições de imagem. Para resolver essa limitação, desenvolvemos uma implementação de código aberto que facilita a aquisição de imagens e a reconstrução e exibição em tempo real dos resultados de polarização, com base na plataforma ImageJ e Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Além disso, embora o pSIM tenha se limitado a fornecer informações de polarização 2D no plano, recentemente estendemos seus recursos para obter mapeamento de orientação 3D usando quase o mesmo equipamento15, denominado mapeamento de orientação 3D (3DOM). Este software de código aberto também fornece o controle, reconstrução e visualização do 3DOM. Os módulos de reconstrução e visualização também são compatíveis com o aplicativo de rastreamento de orientação de molécula única. Todas essas funcionalidades aumentam a utilidade da imagem de polarização em estudos biológicos complexos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Extensão de um microscópio de iluminação estruturada existente para imagens de polarização

  1. Prepare um microscópio SIM.
    NOTA: Assumimos que os leitores têm uma certa base na configuração do microscópio e já possuem um microscópio de luz estruturado. Se você não tiver experiência relevante, consulte este artigo, que fornece uma descrição detalhada de como construir um microscópio SIM16. A unidade de controle de polarização de "HWP+WQP+LCVR" pode ser substituída por uma placa de onda de vórtice de pizza em nosso trabalho pSIM5 ou uma placa de meia onda de pizza17.
  2. Meça as taxas de extinção de polarização de três direções carregando diferentes padrões no modulador de luz espacial (SLM). Coloque e gire um polarizador logo após a objetiva e use um medidor de potência para medir a potência do laser. Para pSIM, gire a placa de onda para manter a polarização s de três direções com taxa de extinção > 10.
  3. Para 3DOM, gire o HWP2 para manter a polarização p de seis direções. Substitua a máscara espacial do SIM pela máscara espacial 3DOM para permitir a passagem de feixes de 1 ordem de seis direções (consulte a Figura 1B).
    NOTA: a polarização s é necessária no pSIM enquanto a polarização p é necessária no 3DOM. A configuração detalhada está incluída em outro lugar para pSIM5 e 3DOM15.

2. Configuração do Micro-Manager

  1. Baixe a versão Micro-Manager 2.0 do site oficial, instale o software seguindo as instruções.
  2. Prepare os drivers de dispositivo e o software correspondentes para se conectar com êxito ao sistema Micro-Manager. Neste sistema de microscópio, use o Micro-Manager para controlar a câmera, o estágio de translação, o laser, a placa DAQ e o microscópio.
    NOTA: Os instrumentos suportados estão listados em https://micro-manager.org/Device_Support. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os instrumentos a serem conectados. Instale drivers ou software oficial/de suporte e conecte o instrumento ao computador usando um cabo USB.
  3. Adicione os instrumentos ao Micro-Manager usando o Assistente de Configuração de Hardware.
    1. Abra o software e selecione Nenhum na lista suspensa inicial.
    2. Selecionar dispositivos | Assistente de configuração de hardware... | Crie uma nova configuração e clique em Avançar para entrar na página de configuração.
    3. Localize o plug-in Câmera/Laser/Platina/DAQ/microscópio na lista suspensa de hardware e clique em Adicionar | ESTÁ BEM | A seguir.
    4. Vá para Selecionar dispositivos padrão e escolha a configuração do obturador automático. Defina a câmera padrão, o obturador padrão e o estágio de foco padrão. Clique em Avançar até que Salvar configuração e sair seja alcançado e salve o nome do arquivo de configuração. Clique em Concluir.
  4. Configurações comuns de modelo
    1. Salve um modelo para o modo ao vivo e o modo de snap do SIM.
    2. Defina o tempo de exposição e o modo de disparo da seguinte forma: escolha Grupo '+' em Definições de configuração, nomeie o nome do grupo como 'Modo', selecione Modo de exposição e disparo, clique em OK.
    3. Escolha Predefinição '+' para adicionar predefinições diferentes para o grupo 'Modo'. Nomeie uma predefinição 'ao vivo' para configurações de exposição do modo ao vivo e outra 'SIM' para o modo SIM. Por exemplo, no modo 'ao vivo', defina o tempo de exposição para 15 ms, enquanto para o modo de snap do SIM, defina 10 ms para o tempo de exposição e o modo de disparo é Padrão (Sobreposição).
      NOTA: Um arquivo de configuração (MMConfig_psim_demo.cfg) está incluído em nosso repositório de código, que pode ser carregado diretamente pelo Micro-Manager 2.0.

3. Calibração do sistema com esferas fluorescentes

  1. Mergulhe as lamínulas em etanol a 75%, lave as lamínulas 3x com água deionizada (ddH2O) e seque-as.
  2. Vortex as esferas fluorescentes de 100 nm (diluídas a 1:1.000 com solução salina tamponada com fosfato [PBS]) e pipetar a suspensão diretamente nas lamínulas. Incube por 5-10 min em um ambiente escuro e, em seguida, lave suavemente com PBS.
  3. Adicione 20 μL de meio de montagem na lâmina do microscópio e posicione a lamínula sobre ela, certificando-se de evitar bolhas. Mantenha a temperatura a 4 °C e mantenha a lâmina no escuro, para que a lâmina com esferas fluorescentes de 100 nm esteja preparada para a calibração do sistema.
  4. Para pSIM, adquira três imagens das três fases diferentes de esferas fluorescentes. Um código MATLAB personalizado (Bead_calib.m) pega as imagens como entrada e gera duas imagens de calibração (calib1.tif, calib2.tif) para análise posterior.
    NOTA: Conforme demonstrado anteriormente5, o experimento pSIM pode ser realizado na maioria dos sistemas comerciais. Em microscópios SIM construídos em casa ou comerciais, a calibração do sistema é necessária para eliminar o erro de medição de dipolos fluorescentes, causado pela iluminação não uniforme durante três direções de padrão. O experimento de calibração assume a polarização isotrópica de esferas fluorescentes e requer apenas as imagens brutas durante a aquisição do SIM. O procedimento de calibração detalhado está incluído em nosso trabalho original5. A saída de duas imagens de calibração calib1.tif e calib2.tif é necessária para a reconstrução do pSIM, que indica a energia de iluminação pixel a pixel da direção 2 do padrão; 3 refere-se à direção do padrão 1.

4. Preparação da amostra: actina em células fixas

  1. Mergulhe as lamínulas em etanol a 75%, lave as lamínulas 3x com ddH2O. Coloque as lamínulas em uma placa de cultura de células de seis poços.
  2. Cultura de células U2OS (linhagem celular ATCC HTB-96) em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de Soro Fetal Bovino (FBS) a 37 °C e 5% de CO2 em lamínulas até atingirem aproximadamente 75% de confluência.
  3. Lave suavemente as células 3x com PBS. Para fixação celular, aplique paraformaldeído a 4% por 15 min em temperatura ambiente. Após a fixação, lave as células 3x novamente com PBS.
  4. Para aumentar a permeabilidade da membrana, trate as células com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 5 min e, em seguida, lave as células 3x com PBS.
  5. Dissolva a faloidina fluorescente com 150 μL de DMSO para solução estoque (66μM). Prepare a solução de trabalho do corante de faloidina diluindo 5 μL da solução estoque em 995 μL de PBS. Incube as células no escuro com a solução de trabalho do corante Faloidina à temperatura ambiente por ~ 1 h. Lave as células por 3 x 3 min com PBS.
  6. Adicione 20 μL de meio de montagem na lâmina do microscópio. Coloque cuidadosamente a lamínula na lâmina sem bolhas. Guarde a lâmina a 4 °C e guarde-a em local escuro.

5. Preparação da amostra: λ-DNA in vitro

  1. Dissolva 0,5 g de Polimetilmetacrilato em 10 mL de materiais de base de prótese. Após a dissolução completa, aplique uniformemente a solução na superfície da lâmina e espere que ela evapore para formar um filme.
  2. Diluir 0,3 μL de λ-DNA e 32 μL de 1.000x SYTOX Orange Nucleic Acid Stain em 968 μL de PBS. Adicione 1 μL da solução preparada à lâmina e deixe secar.
  3. Sele a lamínula na lâmina com o suporte para proteger e preservar a amostra. Armazene a lâmina a 4 °C em um ambiente escuro.

6. Exames de imagem

  1. Coloque a lamínula no suporte de amostra e ajuste ao plano focal no modo ao vivo. Selecione um ROI de 512 x 512 pixels e ajuste o tempo de exposição e a intensidade do laser.
  2. Abra o software de controle independente do modulador de luz espacial e escolha o caminho de sequência de padrão de iluminação apropriado para pSIM / 3DOM ou modo ao vivo.
    NOTA: Para pSIM, o padrão de iluminação inclui três ângulos de polarização diferentes e três fases diferentes. Para 3DOM, o padrão de iluminação inclui seis ângulos de polarização diferentes.
  3. Selecione o modo de captura do SIM , selecione Multi-D Acq., escolha Pontos de tempo e defina a contagem (9 ou 6 imagens para pSIM ou 3DOM) e o intervalo (0 ms) na janela aberta. Clique em Adquirir!
  4. Clique em TriggerSLM.bsh (um arquivo de configuração está incluído em nosso repositório de código), o cartão de aquisição MyDaq ativa o modulador de luz espacial para tirar as fotos.

7. Plug-in de visualização ao vivo de pSIM e 3DOM

  1. Configure a FakeCamera e o caminho de acesso à imagem: carregue o script (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) clicando em Dispositivos | Carregar configuração de hardware.... Configurar o diretório local de imagens em Dispositivos | Navegador de propriedades de dispositivos... | Máscara de caminho da câmera (Figura 2A-C).
    NOTA: A parte de aquisição do script depende da configuração do hardware, por isso fornecemos uma versão (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) usando o dispositivo FakeCamera para ler imagens locais no disco rígido para demonstração. Os usuários podem fazer alterações em nossa versão. Lembre-se de alterar o caminho de leitura da imagem (máscara Camera-Path).
  2. Defina o Painel de Acesso Rápido clicando em Ferramentas | Painel de Acesso Rápido | Crie um novo painel. Clique no ícone Configurações no canto inferior esquerdo, droga 'Run Script' para a parte superior, que pode carregar o 'psim.bsh' e '3DOM.bsh' (Figura 2D) .
    NOTA: O sistema Quick Access Panel permite que os usuários criem janelas personalizadas e acessem facilmente os controles no Micro-Manager, que são necessários com mais frequência. 'Ao vivo', 'Snap' ou outros canais também podem ser adicionados, conforme mostrado na Figura 2D.
  3. Tomando o pSIM como exemplo, execute a reconstrução da imagem de polarização em tempo real clicando em 'psim.bsh'; observe as imagens reconstruídas em tempo real com resultados de polarização (Figura 2E). Lembre-se de alterar o caminho das imagens de calibração no arquivo 'psim.bsh' (calibPath = " caminho para o arquivo de imagens de calibração").
    NOTA: O plug-in live-view é um script beanshell (psim.bsh e 3DOM.bsh), que pode ser executado no Painel de Scripts. O plug-in adquire nove imagens para pSIM ou seis imagens para 3DOM e calcula os resultados do mapeamento de orientação com base nas imagens de campo amplo. As imagens de mapeamento de orientação são exibidas para fornecer informações de polarização em tempo real, o que facilita a inspeção imediata, apesar de sua baixa resolução.

8. Análise de dados com reconstrução de super-resolução

  1. Instale o MATLAB R2019b a partir do website (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Abra o software; para a reconstrução do pSIM, obtenha-se nove imagens, consistindo em três fases diferentes para cada um dos três ângulos de orientação. Certifique-se de que os nomes das nove imagens sejam de '1.tif' a '9.tif', coloque-os no arquivo chamado 'Input' e execute o programa chamado 'PSIM.m'. Observe a imagem de campo amplo reconstruída, a imagem SIM e a imagem pSIM com a roda de cores.
    NOTA: A reconstrução do pSIM precisa de duas etapas: uma etapa do SIM e uma etapa de PM. Os dados são analisados por um programa MATLAB personalizado para facilitar a depuração. Obtenha o código de reconstrução da pasta 'reconsr' no GitHub.
  3. Para 3DOM, capture seis figuras diferentes de direções de polarização. Mescle as seis imagens, nomeie o arquivo resultante como 'Raw_data.tif' e execute o programa chamado 'Recon_3DOM.m'. Observe a imagem de campo amplo reconstruída e a imagem 3DOM com resultados azimutais e os resultados do ângulo polar.
    NOTA: Durante o processo de reconstrução, pode ocorrer um erro'--'função ou variável 'bfopen' não é reconhecida'. 'bfopen' é uma função na biblioteca de bio-formatos e é comumente usada para abrir e ler arquivos de imagem. Insira addpath ('path_to_bioformats_toolbox') na janela de comando do MATLAB. Substitua 'path_to_bioformats_toolbox' pelo caminho real da pasta da biblioteca. Também adicionamos a dependência Bio-Formats ao repositório GitHub.

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Results

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O método pSIM pode ser realizado em microscópios SIM com base na interferência usando feixes de laser polarizados s. A interferência de polarização s é o tipo de SIM mais amplamente utilizado e gera faixas de iluminação de alto contraste. O protótipo acadêmico de uma configuração de microscópio está incluído no trabalho original do pSIM5. Brevemente introduzido na Figura 1, um modulador de luz espacial (SLM) gera a ordem ±1 dos feixes ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em nosso estudo, desenvolvemos um plugin que permite a visualização em tempo real de duas técnicas de imagem de polarização, pSIM e 3DOM. Ambas as tecnologias podem ser executadas em um sistema SIM existente com pequenas modificações. Fornecemos as etapas detalhadas para instalar o microscópio pSIM e 3DOM e configurar o Micro-Manager para controlar o microscópio e demonstrar como obter os resultados de polarização de visualização ao vivo. Os resultados experimentais incluem o filamento d...

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFC3401100).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm Fluorescente BeadsInvitrogenF8801
4% Solução de formaldeídoInvitrogenR37814
CâmeraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Materiais de base de dentadura (Tipo I Tipo de configuração térmica, líquido)New Century DentalN/A
Dulbecco' s Águia Modificada' s MédioGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Microscópio InvertidoNikonTE2000 E
Soro Fetal BovinoGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersão R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersão 4.0Software do modulador
de luz espacialMicro-Manager 2.0μ Μ anagerVersão 2.0Download Micro-Manager Versão mais recente
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Downloads de software e drivers - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Faloidina-AF568InvitrogenA12380
Fosfato tamponado solução salinaCorning21-040-CV
Poli Metacrilato de MetilaSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Modulador de luz espacialKopinSXGA-12
SYTOX manchade ácido nucleico laranjaInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TripsinaGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

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