Method Article

Plug-in Micro-Manager de código aberto para imagens de visualização ao vivo de dipolos fluorescentes

DOI:

10.3791/67755

⸱

March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvemos um plug-in Micro-Manager de código aberto, que permite a observação ao vivo de dipolos fluorescentes em um microscópio de iluminação estruturada. O plug-in suporta a observação da orientação do dipolo 2D e 3D.

Abstract

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A microscopia de polarização de fluorescência (FPM) pode obter imagens da posição e orientação do dipolo dos fluoróforos. Apesar das conquistas da microscopia de polarização de fluorescência de super-resolução, sua dependência da pós-aquisição dificulta a observação em tempo real. A microscopia de iluminação estruturada polarizada (pSIM) oferece imagens de super-resolução de dipolos fluorescentes com velocidade de imagem rápida e é adequada para aplicações de células vivas. Desenvolvemos uma implementação de código aberto para reconstrução em tempo real de imagens de polarização e exibição dos dipolos fluorescentes. Além disso, estendemos o método para obter o mapeamento de orientação 3D (3DOM), ampliando sua utilidade para estudos biológicos complexos. Além disso, apresentamos uma introdução completa à extensão de um microscópio SIM existente em imagens de polarização e fornecemos um guia de configuração detalhado do Micro-Manager 2.0 para controlar o microscópio, permitindo a visualização em tempo real da imagem polarizada. Além disso, fornecemos o código MATLAB para reconstrução completa, abrangendo pSIM e 3DOM. Este guia abrangente tem como objetivo ajudar os iniciantes a dominar rapidamente e iniciar facilmente as operações.

Introduction

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A microscopia de polarização de fluorescência (FPM) surgiu como uma técnica poderosa para obter imagens simultâneas da posição e da orientação do dipolo dos fluoróforos, oferecendo insights profundos sobre imagens biológicas 1,2. Ao facilitar a observação da direção das orientações das biomoléculas, o FPM revela o intrincado arranjo de macromoléculas como actina 3,4,5, microtúbulo5, septina6, filamento de DNA 7-9<....

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Protocol

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1. Extensão de um microscópio de iluminação estruturada existente para imagens de polarização

  1. Prepare um microscópio SIM.
    NOTA: Assumimos que os leitores têm uma certa base na configuração do microscópio e já possuem um microscópio de luz estruturado. Se você não tiver experiência relevante, consulte este artigo, que fornece uma descrição detalhada de como construir um microscópio SIM16. A unidade de controle de polarização de "HWP+WQP+LCVR" pode ser substituída por uma placa de onda de vórtice de pizza em nosso trabalho pSIM5 ou uma placa de meia onda de ....

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Results

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O método pSIM pode ser realizado em microscópios SIM com base na interferência usando feixes de laser polarizados s. A interferência de polarização s é o tipo de SIM mais amplamente utilizado e gera faixas de iluminação de alto contraste. O protótipo acadêmico de uma configuração de microscópio está incluído no trabalho original do pSIM5. Brevemente introduzido na Figura 1, um modulador de luz espacial (SLM) gera a ordem ±1 dos feixes .......

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Discussion

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Em nosso estudo, desenvolvemos um plugin que permite a visualização em tempo real de duas técnicas de imagem de polarização, pSIM e 3DOM. Ambas as tecnologias podem ser executadas em um sistema SIM existente com pequenas modificações. Fornecemos as etapas detalhadas para instalar o microscópio pSIM e 3DOM e configurar o Micro-Manager para controlar o microscópio e demonstrar como obter os resultados de polarização de visualização ao vivo. Os resultados experimentais incluem o filamento d.......

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFC3401100).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm Fluorescente BeadsInvitrogenF8801
4% Solução de formaldeídoInvitrogenR37814
CâmeraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Materiais de base de dentadura (Tipo I Tipo de configuração térmica, líquido)New Century DentalN/A
Dulbecco' s Águia Modificada' s MédioGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Microscópio InvertidoNikonTE2000 E
Soro Fetal BovinoGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersão R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersão 4.0Software do modulador
de luz espacialMicro-Manager 2.0μ Μ anagerVersão 2.0Download Micro-Manager Versão mais recente
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Downloads de software e drivers - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Faloidina-AF568InvitrogenA12380
Fosfato tamponado solução salinaCorning21-040-CV
Poli Metacrilato de MetilaSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Modulador de luz espacialKopinSXGA-12
SYTOX manchade ácido nucleico laranjaInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TripsinaGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

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  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....

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Fluorescence Polarization MicroscopyPolarized Structured IlluminationSuper Resolution ImagingFluorescent DipolesLive Cell ImagingMicro Manager PluginReal Time Reconstruction3D Orientation MappingPolarization ImagingMATLAB Reconstruction Code
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