Avaliação das propriedades antioxidantes e anti-helmínticas de extratos de Tithonia diversifolia contra ovos de nematóides gastrointestinais usando ensaios in vitro

Resumo

Este estudo avaliou as atividades biológicas de extratos de Tithonia diversifolia usando métodos baseados em radicais e um ensaio de eclosão de ovos in vitro (EHA) para avaliar seus efeitos sobre nematóides gastrointestinais em pequenos ruminantes. A metodologia e os principais achados são descritos, destacando o potencial desses extratos para o controle de parasitas.

Resumo

As doenças parasitárias causadas por nematóides gastrointestinais (GIN) são consideradas importantes fatores limitantes para a produção pecuária em todo o mundo, pois comprometem significativamente o bem-estar animal e aumentam os custos de produção. Durante anos, o controle de parasitas dependeu exclusivamente do uso de drogas sintéticas. A resistência do GIN aos anti-helmínticos comerciais tem sido cada vez mais relatada em todo o mundo. Portanto, surgiram abordagens alternativas para o controle do GIN em animais de produção, incluindo a exploração de plantas com potencial bioativo. Tithonia diversifolia pode ser colhida durante todo o ano, e todas as partes da planta têm sido usadas na medicina popular para uma ampla gama de doenças. Este estudo avaliou as propriedades antioxidantes in vitro da água e dos extratos aquosos de acetona a 70% da parte aérea de T. diversifolia , incluindo folhas, galhos e flores, usando métodos baseados em radicais, e avaliou seu potencial anti-helmíntico por meio de um modelo de parasita, empregando o ensaio de eclosão de ovos (EHA) com extratos aquosos. Além disso, o conteúdo de polifenólicos totais dos extratos foi determinado. Essas descobertas destacam T. diversifolia como uma fonte natural promissora de compostos antioxidantes e anti-helmínticos.

Introdução

As doenças parasitárias causadas por nematóides gastrointestinais (GIN) são consideradas importantes fatores limitantes para a produção pecuária em todo o mundo, pois comprometem significativamente o bem-estar animal e aumentam os custos de produção¹. A relação entre o parasito e o gado é influenciada por vários fatores relacionados ao hospedeiro, nomeadamente as características genéticas de resistência e resiliência dos animais, o estado nutricional dos animais, o nível de parasitismo e a patogenicidade das populações parasitárias envolvidas².

Durante anos, o controle de parasitas dependeu exclusivamente de medicamentos antiparasitários sintéticos. No entanto, o uso prolongado e exclusivo tem levado ao surgimento de resistências, reduzindo sua eficácia e incitando a busca de estratégias alternativas³. A resistência de nematóides a vários anti-helmínticos tem sido cada vez mais descrita em todo o mundo, apresentando um cenário preocupante, especialmente em regiões tropicais⁴. Além disso, os consumidores estão cada vez mais conscientes da necessidade de reduzir os resíduos de medicamentos antiparasitários na carne animal e no meio ambiente⁵. Portanto, surgiram abordagens alternativas para o controle de parasitas nematóides em animais de produção⁶.

Tithonia diversifolia é um arbusto tropical nativo da América Central, possuindo características únicas que o tornam valioso para os sistemas de produção de ruminantes. Pode ser colhida durante todo o ano, e todas as partes da planta têm sido tradicionalmente usadas na medicina popular pelas comunidades indígenas para tratar uma ampla gama de doenças. Topicamente, tem sido aplicado para aliviar dores abdominais, feridas, dermatoses e distúrbios musculares, enquanto a administração oral tem sido empregada para controlar infecções, malária, febre, hepatite e diabetes. Essas diversas aplicações terapêuticas destacam seu amplo potencial medicinal⁷.

O estresse oxidativo desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão de infecções parasitárias, tanto no organismo hospedeiro quanto no organismo parasitário que luta para sobreviver⁸. Por esse motivo, a detecção da atividade antioxidante é crucial para avaliar a atividade biológica de extratos de plantas medicinais com potencial anti-helmíntico. Devido à infecção parasitária, a concentração de antioxidantes no hospedeiro diminui, enquanto a concentração de produtos de oxidação dos componentes celulares aumenta. No caso dos parasitas, a manutenção do equilíbrio oxidativo é essencial para prolongar sua interação com o hospedeiro e se defender contra o estresse oxidativo gerado no organismo hospedeiro⁹.

Evidências do desenvolvimento e rápida disseminação da resistência aos anti-helmínticos levantam preocupações de que os tratamentos comumente usados possam se tornar ineficazes. Portanto, um teste in vitro chamado ensaio de eclosão de ovos (EHA) é usado para avaliar a suscetibilidade ou resistência ao benzimidazol (BZ) em nematóides gastrointestinais. Este teste é comumente usado para avaliar a atividade anti-helmíntica de extratos vegetais em ovos e para comparar sua atividade em função da dose. Uma das principais limitações deste ensaio é a variabilidade na eclosão dos ovos entre os testes. A viabilidade dos ovos é limitada a um máximo de 3 h, exigindo recuperação rápida e início imediato. Apesar disso, a porcentagem de eclosão pode variar. Por esse motivo, fica estabelecido que pelo menos 70% dos ovos devem eclodir no grupo controle para que o resultado seja considerado válido^10,11. É um teste barato, rápido, fácil e reprodutível 12,13,14.

O uso de extratos vegetais para explorar alternativas para o controle do GIN é baseado na presença de metabólitos secundários e seu potencial bioativo. Um dos desafios nessa área de pesquisa é a quantidade e a estabilidade dos metabólitos secundários, pois estes variam de acordo com fatores bióticos e abióticos, bem como devido ao estresse químico induzido pelo processo de extração 15,16,17.

Este estudo levantou a hipótese de que diferenças nas atividades biológicas (efeitos antioxidantes e anti-helmínticos) poderiam ocorrer dependendo do tipo de solvente utilizado para extração, o que poderia influenciar a composição dos polifenóis e, consequentemente, sua bioatividade. O objetivo deste manuscrito foi delinear as etapas tomadas na avaliação de extratos usando um modelo in vitro que pudesse ser facilmente replicado.

Protocolo

O comitê de ética animal do CEMIT aprova todos os experimentos envolvendo manipulação animal. Os animais doadores de óvulos pertencem a fazendas que colaboram com o CEMIT, fornecendo amostras fecais para fins de diagnóstico preventivo. Estes animais são ovinos ou caprinos (sem raça específica), de ambos os sexos, com mais de um ano de idade, e não devem ter sido desparasitados nos 15 dias anteriores à colheita da amostra. Todas as fazendas participantes são informadas sobre o uso das amostras para fins de pesquisa e fornecem seu consentimento para fazer parte do estudo. Para a coleta de ovos, os estabelecimentos próximos são notificados primeiro e, após a permissão, são organizadas visitas de campo para coletar amostras fecais frescas, garantindo o processamento em até três horas. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de material vegetal

1. Selecione um local adequado para coletar as espécies de plantas.
2. Colete pelo menos dois espécimes de Tithonia diversifolia para identificação taxonômica e preparação do herbário.
3. Colete um mínimo de 1000 g de partes aéreas de T. diversifolia .
4. Secar a biomassa recolhida à temperatura ambiente (cerca de 26 °C; ver figura 1).
5. Moa a biomassa seca usando um moedor elétrico.
6. Conservar o material moído no frigorífico a 4 °C.

2. Preparação de extratos

1. Prepare o extrato aquoso:
   1. Misturar 10 g de biomassa seca com 100 ml de água destilada a 100 °C.
   2. Deixar a mistura macerar durante 24 h sob agitação contínua a 120 rpm.
   3. Filtrar o extracto com papel de filtro (Whatman n.º 5 ou equivalente).
   4. Liofilizar o extrato filtrado.
2. Prepare o extrato de acetona:
   1. Misture 10 g de material vegetal seco com acetona aquosa a 70% na proporção de 1:3.
   2. Deixar a mistura macerar durante 24 h sob agitação contínua a 120 rpm.
   3. Filtrar o extracto com papel de filtro (Whatman n.º 5 ou equivalente).
   4. Liofilizar o extrato filtrado.
      NOTA: Armazene os extratos liofilizados a -20 °C para melhor preservação (veja a Figura 2). Certifique-se de que pelo menos 5 g de extratos liofilizados sejam obtidos.

3. Preparação da solução-mãe

1. Para o ensaio antioxidante:
   1. Solubilizar os extratos secos nos solventes correspondentes (água destilada ou acetona aquosa a 70%) até uma concentração final de 10 mg/ml.
2. Para o ensaio de incubação dos ovos:
   1. Diluir 12 mg de extratos liofilizados em 5 mL de água destilada para obter uma solução estoque de 2,4 mg/mL.
   2. Prepare cinco concentrações: 1,2 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,3 mg/mL e 0,15 mg/mL (ver Figura 3).
      NOTA: Ajuste o volume da solução estoque com base no número de poços e placas usados. Por exemplo, se 48 poços forem usados em vez de 12, reduza o volume de acordo; prepare 6 mg em 2,5 ml em vez de 12 mg em 5 ml.

4. Composição fitoquímica

1. Teor fenólico total dos extratos (TPC)
   1. Misture 5 μL das amostras com 100 μL de reagente Folin-Ciocalteu (F-C) diluído a 10× em água destilada em placas plásticas transparentes de 96 poços.
   2. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
   3. Adicionar 100 μL de solução de carbonato de sódio (75 g/L em água).
   4. Incubar em RT por 90 min.
   5. Medir a absorvância a 650 nm.
      NOTA: Expresse o TPC como equivalentes de ácido gálico (GAE). Construa uma curva de calibração usando pelo menos cinco concentrações de ácido gálico.
2. Teor total de flavonóides (TFC)
   1. Misture 50 μL dos extratos com 50 μL de cloreto de alumínio a 2% em metanol em placas plásticas transparentes de 96 poços.
   2. Incubar por 10 min em RT.
   3. Medir a absorvância a 405 nm.
      NOTA: Expresse TFC como equivalentes de quercetina (QE). Construa uma curva de calibração usando pelo menos cinco concentrações de quercetina.
3. Teor total de taninos (TTC)
   1. Misture 10 μL dos extratos com 200 μL de DMACA a 1% em metanol e 100 μL de HCl a 37% em placas plásticas transparentes de 96 poços.
   2. Incubar por 15 min em RT.
   3. Medir a absorvância a 640 nm.
      NOTA: Expresse TTC em termos de mg / mL de catequina.

5. Ensaio antioxidante - ABTS

1. Adicione 0,003514 g de persulfato de potássio e 0,0203 g de ABTS a 5 mL de água destilada.
2. Envolva a solução em papel alumínio e incube a 4 °C no frigorífico durante 12-16 h.
3. Medir a absorvância a 734 nm e ajustá-la a cerca de 0,7 por adição de etanol. Como ponto de partida, misture 5 μL de solução ABTS com 195 μL de etanol.
4. Em placas plásticas transparentes de 96 poços, misture 10 μL dos extratos com 190 μL de solução ABTS.
5. Para o controlo positivo (C⁺), misturar 10 μL de Trolox (determinar a concentração utilizando uma curva padrão baseada na absorvância da amostra) com 190 μL de solução ABTS.
6. Para o controlo negativo (C^-), misturar 10 μl do solvente utilizado para dissolver os extractos (água ou acetona aquosa) com 190 μl de solução ABTS.
7. Incube as placas por 6 min em temperatura ambiente (RT).
8. Medir a absorvância a 734 nm.
   NOTA: A Figura 4 mostra um exemplo de um ensaio ABTS.

6. Procedimentos parasitológicos

1. Colete amostras fecais diretamente do reto de cabras naturalmente infectadas.
   NOTA: Colete amostras fecais diretamente do reto de cabras e ovelhas naturalmente infectadas para garantir o frescor e evitar a contaminação ambiental. Contenha suavemente os animais usando pessoal treinado para minimizar o estresse. Usando luvas descartáveis limpas, insira um dedo lubrificado e enluvado no reto e recupere aproximadamente 5-10 g de material fecal. Coloque as amostras em recipientes de plástico limpos e rotulados e armazene a 4-8 °C. Processar todas as amostras dentro de 3 h após a coleta para preservar a viabilidade dos ovos de helmintos. Siga as diretrizes institucionais de bem-estar animal e obtenha o consentimento informado dos proprietários das fazendas.
2. Identificar as espécies animais associadas a cada amostra.
3. Misture 30 g de cada amostra fecal com 50 mL de solução salina saturada (densidade = 1,2) para preparar os ensaios de coprologia.
4. Use uma lâmina McMaster para contar os ovos.
   1. Homogeneizar 3 g de amostra fecal em 50 mL de solução saturada de NaCl. Filtre a mistura através de gaze, encha as duas câmaras de uma lâmina e deixe repousar por 5 min.
   2. Examine a lâmina ao microscópio com ampliação de 10× e conte os ovos do tipo estrongil. Calcule os ovos por grama (EPG) usando a fórmula: EPG = (contagem de ovos) × 50. Este método padroniza a quantificação de nematóides gastrointestinais em pequenos ruminantes.
5. Exprime a contagem de ovos em ovos por grama (EPG).
6. Selecione amostras fecais com um EPG de pelo menos 800 para preparação de cultura fecal.
7. Obtenha larvas L3 de culturas fecais e identifique seus gêneros ou espécies.
   NOTA: Os ovos de nematóides gastrointestinais são depositados na grama durante o ciclo de vida (ver Figura 5). Pequenos ruminantes de gado geralmente exibem poliparasitismo. A Figura 6 mostra as etapas para a realização da análise coprológica.

7. Testes in vitro - Ensaio de eclosão de ovos (EHA)

1. Colete amostras fecais frescas.
2. Filtre as fezes duas vezes usando gaze estéril.
3. Filtrar a suspensão resultante e transferi-la para um passador.
4. Lave o material na peneira com água destilada.
5. Recolha a suspensão lavada em tubos de 15 ml.
6. Centrifugue as amostras a ~ 4800 × g por 5 min em temperatura ambiente usando uma centrífuga de mesa equipada com um rotor de caçamba oscilante. Centrifugue duas vezes com água destilada e uma vez com solução salina saturada para concentrar os ovos no fundo (ver figura 7 para a morfologia dos ovos).
7. Ressuspenda os ovos em PBS.
8. Ajuste a concentração de ovos para 100 ovos/mL para configuração do ensaio.
9. Preparar o controlo positivo dissolvendo o tiabendazol (TBZ) em PBS a 0,025 mg/ml.
10. Preparar o controlo negativo utilizando a suspensão de ovos em PBS.
11. Use placas multipoços de 48 poços para o ensaio.
12. Preparar um volume final de 250 μL em cada alvéolo, utilizando uma mistura 50/50 (v/v) de extracto e suspensão de ovos.
13. Adicione aproximadamente 100 ovos/mL a cada poço.
14. Testar cada concentração em quadruplicado (quatro réplicas).
15. Conte os ovos em um microscópio invertido com ampliação de 40×.
16. Use apenas placas com uma taxa de eclosão de ≥70%.
17. Contar larvas (L1), ovos não eclodidos (UnE), ovos contendo larvas (LFE) e ovos morulados (ME) para cada concentração.
    NOTA: Um resumo representativo do protocolo de ensaio de eclosão de ovos é mostrado na Figura 8.

8. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas descritivas usando o Excel.
2. Use a análise de variância (ANOVA) unidirecional e os testes t para avaliar as diferenças entre as concentrações em um nível de significância de 0,05.
3. Calcule a concentração efetiva de 50% (EC50) usando a análise Probit com base em dados de concentração transformados em log₁₀ (consulte o Arquivo Suplementar 1).

Resultados

Conteúdo fenólico total (TPC), teor total de flavonóides (TFC) e teor total de taninos (TTC)
Os resultados de TPC, TTC, TFC e ABTS em Tithonia diversifolia são mostrados na Tabela 1. Os valores são expressos em mg de equivalentes de ácido gálico por grama de matéria seca (mg GAE/g MS) para TPC, mg de equivalentes de quercetina por grama de matéria seca (mg QE/g MS) para TFC e mg de equivalentes de catequina por grama de matéria seca (mg CE/g ...

Discussão

Este artigo descreve várias etapas essenciais para o avanço da pesquisa sobre plantas medicinais. Testes in vitro, como o ensaio de eclosão de ovos (EHA), são particularmente atraentes porque podem ser conduzidos em condições controladas de laboratório. O EHA é projetado para avaliar a atividade de extratos vegetais em várias concentrações em ovos de nematóides, comparando os resultados com controles positivos e negativos. Os resultados obtidos oferecem informações valiosas sobr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 15 mL			No local
Placa de 48 furos			No local
Placas de 96 poços	VWR	734-0126
ABTS	Enzimático	A1088.0005	No local
Microscópio óptico acadêmico e microscópio invertido			No local
Acetona	Enzimático	A/0600/17
Cloreto de alumínio	Sigma Aldrich	6911
Reagente DMACA	Sigma Aldrich	49825
Etanol 96%	Enzimático	VR11202
Fezes de animais			Coletado em fazendas próximas à universidade
Folin Ciocalteau	Sigma Aldrich	F9252
Ácido gaulês	Sigma Aldrich	91215
HCl	Sigma Aldrich	258148
Câmera McMaster			No local
Metanol	Enzimático	M/4000/17
PBS			No local
Extratos de plantas			No local
Persulfato de potássio	Sigma Aldrich	216224
Quercetina	Sigma Aldrich	Q4951
Sal			No local
Carbonato de sódio	Sigma Aldrich	1063920500
Thiabendazole			No local
Trolox	Sigma Aldrich	648471	No local
Água			No local
Whatmann nº 5	VWR	WHAT97039654