Method Article

Método de alto rendimento para observação de fenótipos de motilidade em Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um método rápido e eficiente para identificar fatores genéticos envolvidos em vários tipos de motilidades em Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os comportamentos de motilidade geralmente desempenham um papel significativo na capacidade de uma bactéria de explorar os recursos disponíveis em seu ambiente. Isso é particularmente verdadeiro para o versátil patógeno Pseudomonas aeruginosa, que pode exibir diversos tipos de motilidades, incluindo enxameação e espasmos, que são características patogênicas importantes que contribuem para a colonização da superfície, formação de biofilme e evasão das defesas do hospedeiro. Este manuscrito apresenta um protocolo de motilidade de alto rendimento para estudar os comportamentos de motilidade de P. aeruginosa. O protocolo permite o teste simultâneo de várias cepas de P. aeruginosa a partir de uma biblioteca de mutantes de todo o genoma, por exemplo, para identificar e analisar os fatores genéticos envolvidos em sua motilidade. A abordagem oferece a possibilidade de estudar a motilidade de maneira abrangente e insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes à motilidade de P. aeruginosa . O protocolo descrito aqui também pode ser modificado para acomodar diferentes tipos de ensaios de motilidade, bem como outras espécies bacterianas, fornecendo assim uma plataforma poderosa para avançar na compreensão do comportamento bacteriano em vários contextos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista que pode colonizar diversos ambientes devido à sua notável versatilidade metabólica 1,2. Essa versatilidade é crucial para a transição de um modo planctônico de crescimento para biofilmes, o que contribui para sua capacidade de prosperar em uma ampla gama de nichos, desde a água até o corpo humano 3,4,5. A transição entre esses modos de crescimento é ajudada por uma extensa capacidade de se mover por esses ambientes usando vários tipos de motilidade, incluindo natação, enxameação e espasmos 1,6. Cada tipo de motilidade é mediado por mecanismos e estruturas celulares distintos e permite que P. aeruginosa responda a pistas ambientais 7,8. A motilidade da natação é impulsionada por um único flagelo polar e é usada para se mover através de meios líquidos em direção aos nutrientes, por exemplo9. A motilidade de enxame é um movimento coordenado facilitado pela produção de flagelos e biossurfactantes e permite que as colônias se espalhem por superfícies semissólidas10,11. Finalmente, a motilidade de contração é independente dos flagelos. Em vez disso, a contração é mediada por pili tipo IV (T4P) e usada para se mover sobre as superfícies12,13. A motilidade de contração também contribui para as etapas iniciais da formação de biofilme de P. aeruginosa, fornecendo fixação inicial na superfície. Após a fixação inicial, a contração permite que as bactérias se movam pelas superfícies e criem microcolônias, que podem então se desenvolver em biofilmes maduros 1,4,13.

Tradicionalmente, os ensaios de motilidade bacteriana são realizados individualmente, uma cepa de cada vez, em uma placa de ágar mole ou usando métodos de microscopia 6,14,15. Os meios semi-sólidos têm sido usados há muitos anos no estudo da motilidade bacteriana. Atualmente, essas técnicas ainda são utilizadas para identificar fenótipos de motilidade em bactérias. Por exemplo, tradicionalmente, a motilidade do enxame é observada inoculando 2,5 μL de uma cultura de P. aeruginosa no centro de uma placa de Petri contendo meio M9 na concentração de 0,5% -0,8% de ágar16. A motilidade de contração é geralmente medida observando a disseminação da bactéria na superfície de interface entre o ágar (a 1%) e a base de uma placa de Petri após uma facada inocular P. aeruginosa através do meio de cultura. Um grande halo de expansão de colônias intersticiais é obtido após 48 h de incubação, enquanto cepas sem espasmos não produzem tal zona de expansão de colônias 1,17,18.

Mais recentemente, abordagens de mutagênese de transposons descobriram novos genes envolvidos na motilidade ou formação de biofilme em P. aeruginosa 19,20,21. Por exemplo, novos genes envolvidos na motilidade de contração foram encontrados usando uma biblioteca mutante de transposon de alta densidade em P. aeruginosa19. Outra ferramenta útil em genômica funcional é o uso de coleções mutantes ordenadas 22,23. A coleção Keio24, contendo deleções de um único gene para todos os genes não essenciais em Escherichia coli, é provavelmente a coleção mais conhecida de mutantes e tem sido usada para definir genes que afetam vários fenótipos, desde o crescimento em diferentes meios25 até a morfologia celular26 e mais. Tais coleções também estão disponíveis para Salmonella enterica sorovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29, bem como muitas outras espécies. Essas coleções também são adequadas para estudar a motilidade em todo o genoma, levando ao desenvolvimento de um método de alto rendimento para estudar a motilidade de P. aeruginosa. Aqui, o método foi testado avaliando a contribuição de mutantes de P. aeruginosa para a motilidade de espasmos e enxameação em placas de alta densidade. Este método de alto rendimento pode ser usado para vários fenótipos de motilidade e também é adequado para estudar a motilidade de outras bactérias.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: O fluxo de trabalho geral deste procedimento é descrito na Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. (1) Prepare a quantidade necessária de meios de motilidade com base no tipo de motilidade de interesse nos experimentos. (2) Usando um sistema replicador manual ou automatizado, prepare as placas de estoque de origem para a biblioteca mutante de inserção de transposon de P. aeruginosa da coleção de mutantes na densidade apropriada, com ênfase na precisão e inoculação uniforme em todos os poços das placas. (3) Transfira amostras das placas de origem da coleção de mutantes para as placas de motilidade. (4) Após a incubação, observar e analisar os fenótipos de motilidade e identificar os genes envolvidos na motilidade de interesse usando imagens de alta qualidade. (5) Realizar ensaios tradicionais de motilidade para validar os acertos identificados por meio de experimentos de motilidade de alto rendimento. Criado com BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Placas de enxame - mídia M9Placas de espasmos - LB mediaPlacas de origem - mídia LB
200 mL de uma solução de sais 5x M910 g de NaCl10 g de NaCl
10 mL de glicose a 20%10 g de triptona10 g de triptona
25 mL de ácidos de casamino5 g de Extrato de Levedura5 g de Extrato de Levedura
1 mL de 1M MgSO410 g de ágar15 g de ágar
500 mL de ágar 1%Adicionar dH2O a 1LAdicionar dH2O a 1L
Adicionar dH2O a 1LGentamicina (concentração final de 15 μg/mL)

Tabela 1: Composição do meio para as várias placas usadas no ensaio.

1. Preparação de placas de meio de cultura

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para preparar soluções de estoque e condições de armazenamento. As placas devem ser preenchidas em uma superfície nivelada. Ao secar, as placas devem ser planas na superfície (ou seja, não empilhadas). Isso garante que o meio de cultura na placa seque uniformemente. Qualquer placa uniwell com uma pegada típica pode funcionar, mas placas com dimensões internas maiores (sem paredes internas), como as placas Singer Instruments Plus ou as placas de cultura de tecidos não tratadas de poço único da VWR, facilitam o trabalho com uma densidade mais alta de colônias por placa.

  1. Prepare uma quantidade adequada de mídia para os experimentos de acordo com a receita da Tabela 1. Mantenha o meio a ~45 °C a 50 °C para evitar que o ágar solidifique.
    1. Para placas de origem, prepare placas de 59 LB (caldo de lisogenia) contendo 1,5% de ágar e 15 μg / mL de gentamicina, que é necessária para replicar a biblioteca PA14 completa - 59 x 25 mL = ~ 1500 mL. Prepare outras 15 placas de ágar LB 1,5% e 15 μg / mL de gentamicina para aumentar a biblioteca no formato de densidade 384 - 15 x 25 mL = ~ 400 mL.
    2. Placas de contração: Se estiver trabalhando no formato de densidade 96, prepare 59 placas de contração (LB 1% de ágar). Prepare 15 placas de contração se estiver trabalhando no formato de densidade 384.
    3. Placas de enxame: Prepare 15 (formato de densidade 384) ou 59 (formato de densidade 96) placas de enxame (M9-glicose 0,5% ágar)
  2. Retire a tampa de um prato e despeje 25 mL de mídia por prato. Distribua a mídia uniformemente pela chapa, levantando suavemente todos os cantos da chapa, um de cada vez. Repita este movimento de movimento 2x-3x. Coloque a tampa de volta no prato.
  3. Deixe as placas solidificarem e secarem à temperatura ambiente (RT) durante a noite. Se as placas não forem usadas imediatamente, coloque-as em sacos herméticos e guarde-as em local seco. Eles podem ser armazenados por 3 semanas.

2. Preparação de placas fonte da biblioteca de mutantes do transposon de P. aeruginosa

NOTA: As placas de origem referem-se às placas de LBA-gentamicina contendo uma cópia da biblioteca PA14 que são usadas posteriormente para inocular as placas de motilidade. A biblioteca mutante de transposon de P. aeruginosa (biblioteca PA14) é um conjunto de 59 placas congeladas de 96 poços29. As etapas para preparar as placas de origem para cada formato são descritas a seguir. Este protocolo é adaptável para laboratórios que não têm acesso ao replicador Rotor+. Os pesquisadores podem realizar com sucesso os mesmos procedimentos experimentais usando replicadores manuais, como os replicadores de 96 pinos com mola usados aqui para a replicação das placas congeladas da biblioteca PA14 durante o Dia 1 (consulte a Tabela de Materiais) ou quaisquer outros replicadores de 96 pinos. Os replicadores manuais precisam ser esterilizados e deixados esfriar entre cada uso.

  1. Dia 1: Replicação da biblioteca PA14 das 59 placas congeladas de 96 poços para as placas de origem
    1. Esterilize um replicador de 96 pinos com mola, colocando-o em uma placa quente na temperatura máxima por 8 min. Após a esterilização, deixe o replicador esfriar o suficiente (~10 min) para evitar matar bactérias.
    2. Pegue uma placa de origem. Usando o replicador estéril de 96 pinos, mergulhe cuidadosamente os pinos do replicador em uma placa de 96 poços e, em seguida, transfira as células diretamente para a superfície da placa de origem. Repita até que todas as 59 placas congeladas de 96 poços da biblioteca PA14 sejam replicadas nas placas de origem.
    3. Incubar as placas de origem de densidade 96 a 37 °C durante 16-18 h.
      NOTA: Se estiver usando o método com um formato de densidade 96, essas placas de origem podem ser usadas para inocular as placas de motilidade.
  2. Dia 2: Upscaling do formato de densidade 96 para o formato de densidade 384
    NOTA: O dia 2 pode ser ignorado se estiver trabalhando com densidade de 96.
    1. Após a incubação, deixe as placas (planas sobre uma superfície, não empilhadas) à temperatura ambiente (~1 h) para arrefecer. Se houver condensação nas tampas, remova a condensação usando um pano delicado para evitar que gotículas de água caiam nas placas, o que pode causar contaminação cruzada entre as colônias.
    2. Configure o replicador com os seguintes parâmetros para garantir a transferência precisa da colônia. Ligue o replicador. Na seção Selecione um modo de operação, selecione Selecionar e executar programas armazenados.
    3. Na seção Selecionar placas de origem, selecione PlusPlate 96 Agar. Na seção Selecionar placas alvo, selecione PlusPlate 384 Agar. Na seção Selecionar pads, selecione Pino curto 96.
    4. Na seção Replicar opções do programa, selecione Geral e clique em Reciclar > Nenhum.
    5. Na seção Origem, selecione Deslocamento e clique em Raio Aleatório > Padrão. Na seção Alvo, selecione Fixação e ajuste a pressão para 20%. Deixe todas as outras configurações como padrão.
    6. Insira os RePads de pinos curtos 96 no compartimento apropriado.
    7. Posicione as placas de origem e destino na plataforma designada do replicador. Coloque as placas de origem de densidade 96 (placas 1, 2, 3 e 4) e a nova placa de origem vazia (placas LBA) na plataforma. Usando os parâmetros selecionados, o robô de fixação de matriz microbiana transferirá colônias das placas de densidade 96 para a nova placa de densidade 384. Pressione Executar.
    8. Troque todas as placas na plataforma (as próximas quatro placas de origem de densidade 96 e uma nova placa de origem vazia) e repita até que todas as placas tenham sido aumentadas. Para o último conjunto de placas, use a placa 57, 58, 59 e 1. Cada placa de densidade 384 consistirá em colônias alternadas de quatro placas de densidade 96 (ver Figura 2). Incubar as placas de LBA de densidade 384 a 37 °C durante 16-18 h.
      NOTA: Essas placas de origem de densidade 384 podem ser usadas para inocular a placa de motilidade para realizar o protocolo em densidade 384. Em qualquer etapa após a incubação, as placas podem ser armazenadas a 4 °C por até 3 semanas.

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Figura 2: Upscaling de placas de densidade 96 para placas de densidade 384. Colônias de quatro placas de origem de densidade 96 são transferidas e fundidas em uma única placa de densidade 384. Cada quadrante da placa de densidade 384 corresponde a uma das placas originais de 96 poços (vermelha, azul, amarela e verde), preservando a posição de cada mutante. Criado com BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Experimento de motilidade de alto rendimento

NOTA: O protocolo foi realizado aqui no formato de densidade 384, mas o mesmo protocolo pode ser adaptado para um formato de densidade 96 modificando os parâmetros no replicador para transferir das placas de origem para as placas de motilidade usando a seleção 96 em vez de 384.

  1. Após a incubação, deixe as placas (planas sobre uma superfície, não empilhadas) à temperatura ambiente (~1 h) para arrefecer. Se ocorrer condensação nas tampas, remova-a usando um pano delicado para evitar que gotículas de água caiam nas placas, o que pode causar contaminação cruzada entre as colônias.
  2. Pegue o número apropriado de placas (59 para um formato de densidade 96 ou 15 para um formato de densidade 384) para o ensaio desejado: placas de ágar M9-glicose 0,5% para enxameação, LB e placas de ágar 1% para contração.
  3. Configure o replicador com os seguintes parâmetros para garantir a transferência precisa da colônia.
    1. Ligue o replicador. Na seção Selecione um modo de operação, selecione Selecionar e executar programas armazenados. Na seção Selecionar placas de origem, selecione PlusPlate 384 Agar.
    2. Na seção Selecionar placas alvo, selecione PlusPlate 384 Agar. Na seção Selecionar pads, selecione Pino curto 384. Na seção Replicar opções do programa, selecione Geral > Reciclar > Nenhum.
    3. Em Programas Singer, selecione Replicar muitos.
    4. Na seção Origem, selecione Deslocamento > Raio Aleatório > Padrão. Na seção Alvo, selecione Fixação e ajuste a pressão para 2%. Deixe todas as outras configurações como padrão.
  4. Insira os RePads de pinos curtos 384 no compartimento apropriado.
  5. Posicione as placas de origem e destino na plataforma designada do replicador. Coloque as placas de origem de densidade 384 e as placas de motilidade vazias na plataforma. Pressione Executar Usando os parâmetros selecionados, o robô de fixação de matriz microbiana transferirá colônias das placas de origem de densidade 384 para as placas de motilidade. Cada placa de densidade 384 consistirá em uma cópia de uma placa de origem de densidade 384.
  6. Certifique-se de que a transferência seja uniforme e que todas as colônias estejam adequadamente fixadas na superfície de ágar das placas de motilidade. Coloque as placas de motilidade inoculadas em sacos plásticos. Coloque cuidadosamente os sacos contendo as placas em uma incubadora regulada para 37 °C por 18 h.
    NOTA: As placas são colocadas em sacos para manter a umidade e evitar a secagem irregular. Coloque as placas na incubadora com as tampas voltadas para cima.
  7. Após a incubação, verifique as placas de motilidade quanto ao crescimento uniforme da colônia e ausência de contaminação.
  8. Dia 3: Placas de motilidade de imagem
    NOTA: O Singer Instruments PhenoBooth é usado para capturar imagens de alta resolução das placas de motilidade. Ele usa uma câmera de nível científico e produz imagens de 23 megapixels. Inclui cinco canais de iluminação para capturar imagens de alta resolução de colônias de placas de Petri e placas retangulares. Outros geradores de imagens de alta qualidade também funcionam.
    1. Após o período de incubação, as placas de motilidade estão prontas para o processo de imagem. Ligue o Phenobooth e clique no ícone correspondente ao software Phenobooth.
    2. Uma página Selecionar projeto é aberta; clique em Novo Projeto > Contagem de Colônias. Escolha o Caminho do arquivo desejado para armazenar as imagens no campo Local. No campo Resolução, escolha 5626 x 4220. Clique em OK, o dispositivo agora está pronto para tirar fotos.
    3. Insira a placa no leitor com o lado médio voltado para cima depois de remover a tampa. Certifique-se de que a placa esteja posicionada corretamente antes de fechar o leitor para evitar emperrar a placa.
    4. Defina o parâmetro como luz branca na guia Iluminação. Clique em Visualizar. Ajuste as configurações de exposição na guia de configurações do PhenoBooth para obter os parâmetros ideais para observar fenótipos de motilidade.
    5. Clique em Adquirir; As imagens capturadas aparecerão no lado esquerdo da tela. Quando terminar, feche o software (todas as imagens capturadas serão salvas no arquivo escolhido anteriormente na guia Localização).
      NOTA: O Phenobooth salva imagens no formato JPEG, mas para as etapas de análise downstream, as imagens podem estar no formato TIFF, JPEG ou PNG.

4. Análise dos fenótipos de motilidade

NOTA: A análise das imagens é realizada conforme descrito em detalhes por French et al.30,31. Um script para executar a análise de dados está disponível em31 (ImageJ Macro).

  1. Resumidamente, as imagens são processadas em ImageJ32, que gera um valor para cada colônia na placa de motilidade. Primeiro, converta as imagens para o formato de 8 bits e segmente as colônias e suas áreas de motilidade associadas a partir do plano de fundo usando o comando threshold. Desenhe uma região de interesse (ROI) ao redor de cada colônia e meça a área de motilidade. Isso gera uma tabela contendo um valor de densidade integrado para cada poço, organizado por linhas. Esta tabela pode ser salva como um arquivo CSV para análise posterior.
    1. Execute a macro no ImageJ e abra a pasta que contém as imagens.
    2. Quando solicitado, ajuste a rotação da placa modificando o ângulo da placa usando a opção Visualizar para que a placa fique reta. Quando estiver satisfeito, clique no botão OK .
    3. Em seguida, mova o retângulo ao redor das colônias e use-o para cortar a parte da placa que contém as colônias. Quando estiver pronto, clique no botão OK .
    4. O próximo prompt definirá a grade usada para desenhar o ROI ao redor de cada colônia e medir a área de motilidade. Selecione a densidade de colônia apropriada. Ajuste os vários parâmetros, se necessário, para que cada círculo fique em torno de uma colônia. Quando estiver pronto, ative o botão Ok? e clique no botão OK . Isso medirá a área de motilidade de cada colônia e salvará um arquivo CSV na pasta que contém os dados.
  2. Combine este arquivo CSV com a legenda da placa, também organizada por linhas, para identificar cada área de motilidade com o mutante correspondente. Valores mais baixos de densidade integrada correspondem aos mutantes que não eram móveis ou apresentavam motilidade diminuída.

5. Ensaios tradicionais de motilidade para validação de acertos

NOTA: Depois de observar mutantes com motilidade impactada no protocolo de motilidade de alto rendimento, é importante validar os acertos obtidos individualmente. O protocolo de motilidade individual difere daquele usado para testes de alto rendimento, mas os meios usados são os mesmos.

  1. Ensaio de motilidade de enxame
    NOTA: A motilidade do enxame é realizada conforme descrito em detalhes por Ha et al.16.
    1. Resumidamente, autoclave uma solução de ágar com M9 (ágar 0,5%), glicose, casaminoácidos e MgSO4. Despeje o ágar resfriado e misturado em placas de Petri (25 mL por placa).
    2. Inocular com 2,5 μL de cultura bacteriana durante a noite. Incubar a 37 °C durante 18 h com as pálpebras viradas para cima para observar os fenótipos de motilidade.
  2. Ensaio de motilidade de espasmos
    NOTA: A motilidade de espasmos é realizada conforme descrito em detalhes por Haley et al.33,34.
    1. Resumidamente, autoclave um ágar LB 1% (ver Tabela 1). Despeje o ágar LB 1% resfriado e misturado em placas de Petri (25 mL por placa).
    2. Esfaqueie as bactérias no fundo das placas de contração (1% de ágar). Incubar as placas a 37 °C durante 48 h e depois a RT durante mais 48 h. Remova o ágar da placa e visualize a zona de contração corando a placa de Petri com 1% de violeta cristal.
    3. Fotografe as placas de Petri usando o PhenoBooth com os mesmos parâmetros descritos na etapa 3.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usamos este protocolo para caracterizar o efeito da inativação gênica na motilidade de P. aeruginosa em alto rendimento. Aqui, detalhamos seu uso para estudar a motilidade de enxame e contração em uma coleção de deleção de P. em todo o genoma. aeruginosa cepa PA14 (biblioteca PA14). O protocolo oferece grande versatilidade e facilidade de uso, permitindo modificações em diferentes etapas do protocolo, como o uso de diferentes meios de cultura ou coleções mutan...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo de motilidade de alto rendimento descrito aqui nos permite processar e analisar o fenótipo de motilidade de muitas colônias com precisão e reprodutibilidade. Em comparação com os métodos manuais tradicionais, essa abordagem semiautomatizada aumenta a escalabilidade e o rendimento dos ensaios de motilidade para permitir a avaliação da motilidade bacteriana em todo o genoma. O protocolo foi otimizado para uso com a biblioteca PA14, mas este ensaio pode ser usado com qualquer bi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao laboratório Surette da McMaster University por fornecer uma cópia da biblioteca PA14. Agradecemos ao Dr. Fabrice Jean-Pierre por seus comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (RGPIN-2019-06044) e uma bolsa inicial para novos pesquisadores do Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; # 295613). J.-P.C. possui uma bolsa Chercheur boursier junior 2 do Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 placas de poço    Corning   3701 
Agar Fisher Scientific & nbsp;  BP1423-2 Concentração final de 0,5% para motilidade em enxame ou 1% para motilidade de espasmos, respectivamente.
Ácidos Casamino    Fisher Scientific & nbsp;  223050 Prepare um estoque de 20% em água. O filtro esteriliza com 0,22 e mu; m filtrar e armazenar a 4 °C. Concentração final 0,5% em meio mínimo M9.  
Violeta cristalino Bio Basic   CB0331Prepare uma solução a 1% em água.
D-Glicose   Bio Basic   GB0219 Prepare um estoque de 20% (1,1 M) em água e esterilize por autoclav. Concentração final de 0,2% em M9 médio mínimo.  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
Gentamycina sulfato   Bio Basic   GB0217 Prepare um caldo de 30 mg/ml em água. O filtro esteriliza com 0,22 e mu; M filtrar e armazenar em 4 graus e graus C & ndash; Concentração final nas placas 15 & micro; g/mL..    
Inocular Loop e Agulha Fisher Scientific & nbsp;22363597
M9 Sais Mínimos, 5X & nbsp;Fisher Scientific & nbsp;248510Prepare um estoque de 1M em água e esterilize por autoclave. Concentração final de 1 mM em médio mínimo M9.    
Sulfato de Magnésio (MgSO4)   Fisher Scientific & nbsp;M63-500  Prepare um caldo de MgSO4 de 1 M em água. O filtro esteriliza com 0,22 e mu; Filtro M e armazene em temperatura ambiente. Concentração final  
Biblioteca de Mutantes de Inserção de Transposons PA14    Liberati et al., 2006 (Veja referência 29)59 placas de 96 poços para toda a coleção. Cada poço contém um único mutante em LB com 25% de glicerol.
Placa de Petri 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Instrumentos de Cantor  https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ Dissolva 11,3 g do pó em 200 mL de água purificada. Autoclave em 121 & deg; C por 15 min. 
Seringa de plástico 10 mL Fisher Scientific & nbsp;14955459
Rotor+     Instrumentos de Cantor  https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Densidades de 384 RePads de pino curto  Instrumentos de Cantor    REP-004 
RePads de pino curto 96 densidades    Instrumentos de Cantor    REP-002 
Cloreto de Sódio (NaCl)   Fisher Scientific & nbsp;BP358-212 
Replicador de 96 pinos com molaEnzyScreen   CR1000 
Lâmina cirúrgica de aço inox nº 25 Fisher Scientific & nbsp;08-918-5F
Triptona & nbsp;Oxoid   LP0042B 
Placas UniwellInstrumentos de Cantor    PlusPlates: PLU-003   Tamanho da placa: 54 e multiplicados; 34 e mais vezes; 38 cm - sem paredes internas, que proporcionam dimensões internas maiores.
Placas UniwellVWRPlacas de cultura de tecido em poço único: 75780-348Mesmas dimensões dos PlusPlates.
Extrato de Levedura & nbsp;Fisher Scientific & nbsp;248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

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