Análise abrangente da resposta a medicamentos usando o ensaio FLICK

Resumo

Este protocolo descreve como usar o ensaio FLICK para avaliar as respostas a medicamentos, incluindo instruções detalhadas para usar este ensaio para calcular as taxas de crescimento e mortalidade induzidas por drogas e avaliar o mecanismo de morte celular induzida por drogas.

Resumo

Para entender a eficácia do medicamento, uma necessidade crítica é caracterizar a extensão da morte celular induzida por medicamentos. Os esforços para quantificar o nível de morte celular induzida por drogas são desafiados pela existência de mais de uma dúzia de formas molecularmente distintas de morte regulada, cada uma com seu próprio tempo de ativação e características bioquímicas. Além disso, para alguns subtipos de morte necrótica, as características marcantes são observadas apenas transitoriamente e são rapidamente perdidas devido à ruptura celular. Assim, mesmo ao usar uma combinação de ensaios específicos da via de morte, é um desafio quantificar com precisão a quantidade total de morte celular ou as contribuições relativas de cada subtipo de morte. Outra questão é que muitos ensaios específicos de morte ignoram como as drogas afetam a proliferação celular, tornando difícil interpretar se uma população tratada com drogas está se expandindo ou diminuindo. O ensaio FLICK permite quantificar o nível total de morte celular após estimulação de uma maneira específica para a morte, mas também amplamente agnóstica para o(s) tipo(s) de morte ativado(s). Além disso, o ensaio FLICK retém informações sobre o tamanho total da população e a taxa de proliferação celular. Neste manuscrito, descrevemos o uso básico do ensaio FLICK, como solucionar problemas desse ensaio ao usar diferentes tipos de material biológico e como usar o ensaio FLICK para quantificar as contribuições de cada tipo de morte celular para uma resposta a medicamentos observada.

Introdução

Para medicamentos anticâncer, a avaliação pré-clínica da sensibilidade aos medicamentos geralmente envolve testar como os medicamentos afetam a viabilidade das células em cultura¹. A viabilidade celular após a exposição ao medicamento é um produto de pelo menos dois efeitos separados: inibição da proliferação celular induzida por drogas e ativação da morte celular². Infelizmente, embora a morte celular seja uma característica crítica necessária para respostas duráveis a medicamentos, as abordagens padrão não esclarecem o grau em que um medicamento ativa a morte celular^3....

Protocolo

1. Otimização do tempo de permeabilização para cada linhagem celular de interesse

NOTA: Os volumes e quantidades descritos são para otimizar uma linha celular. Esses valores devem ser ampliados com base no número de linhagens celulares que devem ser testadas.

1. Coloque o número desejado de células em cada poço de uma placa de parede preta com fundo óptico de 96 poços. Adicione 100 μL de meio completo e deixe as células aderirem à placa durante a noite.
   NOTA: O número de células plaqueadas deve ser otimizado levando em consideração a taxa de crescimento das células, densidades ideais e comprimento do ensaio. Os ....

Resultados

Usando este protocolo, exploramos a sensibilidade das células U2OS ao inibidor de HDAC Belinostat. Esses experimentos foram realizados usando 2 μM de SYTOX Green para marcar células mortas (Figura 1A). As leituras cinéticas foram feitas usando um leitor de placa fluorescente em uma configuração de ganho de 130 (Figura 1B). As células foram lisadas em solução de Triton-X a 1,5% em PBS por 2 h no final do ensaio (Figura 1C-D

Discussão

O ensaio FLICK é um método robusto para gerar uma avaliação abrangente do efeito de um medicamento no crescimento e morte de uma população de células. Como esse método não conta diretamente as células, as etapas críticas do protocolo são garantir a linearidade do ensaio e a lise completa durante as etapas de permeabilização do tritão. O tempo correto de permeabilização pode ser identificado visualmente, conforme destacado neste protocolo, ou quantitativamente pela leitura da fluorescênci.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Belinostat	ApexBio	A4612
Camptotecina	ApexBio	A2877
Tubo de centrífuga cônico, 15mL	Fisher Scientific	12-565-269
DMEM	Corning	10017CV	Para semear e drogar células
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	Para semear e drogar células
Microplaca Fisherbrand 96-Well, Tratada com Cultura de Células,	Fisher Scientific	FB012932	Para semear e drogar células (placa de pino)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Microplaca de fundo plano, tratada com cultura de células, transparente de 96 poços	Greiner	655090	Para semear e drogar células
IncuCyte S3	Essen Biosciences		Qualquer microscópio de fase funcionará
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	MATLAB versão R2023b, é necessária uma licença
Leitor de fluorescência de microplacas	Tecan	Spark	Para medir a fluorescência de células mortas
Palbociclib	ApexBio	A8316
PBS	Corning	21-040-CM	Qualquer PBS funciona
Leitor de microplacas multimodo Spark	Tecan	https://www.tecan.com/spark-overview	software SparkControl versão 2.2
Reservatório estéril, 25 mL	Fisher Scientific	13-681-508	Para semear e drogar células
Coloração de ácido nucleico verde Sytox	Thermo Fisher Scientific	S7020	Coloração de DNA para medição de fluorescência de células mortas
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	Para permeabilizar células
U2OS	ATCC	HTB-96	Um exemplo de linha celular usada neste protocolo
Z-VAD-FMK	ApexBio	A1902

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