O artigo descreve um protocolo para reconstituir a microbiota de leite doado pasteurizado usando a microbiota do leite materno em ambientes práticos do mundo real. Demonstra crescimento bacteriano efetivo e modulação do microbioma, apoiando a aplicação viável desse procedimento dentro dos cuidados de rotina de uma maternidade e seu banco de leite humano associado.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Reconstituição individualizada da microbiota do leite humano: uma abordagem viável em ambientes do mundo real
Neste artigo
Resumo
Resumo
O leite materno (MOM) é o recurso nutricional mais completo para recém-nascidos. Nos casos em que as mães não conseguem produzir leite suficiente ou não podem amamentar, a alternativa preferida é o leite humano doado pasteurizado (PDM), que é rotineiramente fornecido por bancos de leite humano. O PDM oferece uma gama superior de elementos nutricionais e imunológicos em comparação com qualquer fórmula disponível comercialmente. No entanto, para garantir a biossegurança, o PDM passa por pasteurização, processo que inativa a microbiota comensal e reduz certos compostos bioativos. Este estudo apresenta um protocolo projetado para restaurar a microbiota do PDM usando MOM como fonte microbiana, adaptando a abordagem a um ambiente clínico do mundo real.
O protocolo foi implementado em um ensaio clínico realizado em uma maternidade e seu banco de leite humano associado, com o objetivo de fornecer leite doado personalizado para bebês prematuros cujas mães não conseguem produzir leite suficiente. A metodologia envolve a inoculação do PDM com 10% de MOM, seguida de incubação a 37 °C por 4 h. A análise microbiológica demonstrou crescimento bacteriano bem-sucedido no leite inoculado (IM) após a incubação, com o perfil da microbiota do leite reconstituído (MR) muito semelhante ao do MOM, indicando uma restauração eficaz da microbiota. Esses resultados sugerem que o protocolo de reconstituição é viável para implementação na assistência neonatal, com potencial para melhorar a qualidade nutricional e imunológica do PDM, auxiliando na saúde e no desenvolvimento de recém-nascidos não amamentados.
Introdução
O leite materno é amplamente reconhecido como a melhor fonte de nutrição para recém-nascidos, fornecendo não apenas macro e micronutrientes essenciais, mas também uma complexa variedade de elementos, incluindo vários metabólitos e componentes do sistema imunológico, como anticorpos, citocinas e células1. Além disso, as propriedades benéficas do leite materno também surgem de uma comunidade de microrganismos comensais. Todos esses elementos do leite materno desempenham um papel crucial no desenvolvimento do recém-nascido. A comunidade de microrganismos, conhecida como microbiota, é influenciada por uma combinação de fatores como dieta, estilo de vida materno, tipo de parto e idade gestacional, fazendo com que cada leite tenha uma microbiota com características particulares2. Os mecanismos pelos quais a microbiota do leite materno beneficia o desenvolvimento neonatal vão desde a proteção da superfície entérica por meio da colonização por bactérias comensais até a promoção da maturação do sistema imunológico por meio da produção de metabólitos que interagem com as células imunes no intestino3. Por esse motivo, o perfil individualizado de microrganismos no leite materno o torna uma forma de medicina personalizada para recém-nascidos4.
A presença de uma microbiota saudável pode ajudar a proteger o recém-nascido contra a colonização por microrganismos potencialmente patogênicos, ocupando o nicho ecológico e apoiando a nutrição, especialmente para prematuros, que são mais vulneráveis a esses impactos externos por estarem em ambiente hospitalar e terem um sistema imunológico imaturo. Além disso, as mães que dão à luz prematuramente muitas vezes têm dificuldade em produzir leite em quantidades suficientes para seus recém-nascidos. A produção de leite é tipicamente menor quanto mais jovem a idade gestacional5. Nesses casos, a melhor opção para a alimentação do recém-nascido é o leite doado pasteurizado fornecido pelos Bancos de Leite Humano (BLH)6.
O Brasil possui a maior e mais extensa rede de BLHs do mundo7. Essa rede coleta, prepara e distribui mais de 160.000 L de leite humano doado pasteurizado (PDM) em todo o país, sem custo para os pais, por meio do Sistema Único de Saúde, gerenciado pelo Ministério da Saúde7. A pasteurização é essencial para garantir a biossegurança do leite doado destinado aos recém-nascidos. Esse processo geralmente é realizado pelo método Holder, que envolve a imersão de um recipiente de leite materno cru de doadora em banho-maria a 62,5 °C por 30 min 6,8. O PDM resultante é então armazenado sob refrigeração até que esteja pronto para consumo. No entanto, a pasteurização reduz a viabilidade da microbiota comensal do leite e diminui a biodisponibilidade de vários componentes bioativos. Isso ocorre porque o processo de pasteurização é padronizado para evitar a transmissão de microrganismos patogênicos para o recém-nascido. Nesse contexto, em 2017, Cacho e colegas descreveram a possibilidade de reconstituir a microbiota comensal do próprio leite materno, inoculando-o em várias proporções no PDM9. Suas descobertas demonstraram que o uso de uma concentração de 10% do leite materno (MOM) é a concentração ideal para manter a composição original do perfil do microbioma MOM. Essa abordagem reduz o risco de crescimento excessivo de bactérias específicas, que, embora tipicamente comensais, podem se tornar prejudiciais se estiverem desproporcionalmente presentes no leite reconstituído. Especificamente, o estudo observou que uma diluição de 1:10 (10% MOM + 90% PDM), incubada por 4 h, resultou em uma carga bacteriana bem equilibrada - aproximadamente 60% daquela encontrada em MOM não diluída - indicando uma abordagem mais segura e eficaz. Em contraste, diluições mais altas, como 3:10, levaram ao crescimento bacteriano excessivo, destacando a necessidade crítica de concentrações e condições controladas para garantir a segurança.
Neste artigo, demonstramos que esse procedimento de reconstituição da microbiota do leite materno no PDM pode ser realizado em situações do mundo real dentro dos cuidados de rotina de uma maternidade e seu banco de leite humano associado.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este protocolo foi realizado como parte dos procedimentos de um ensaio clínico conduzido por nosso grupo de pesquisa (Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos, ReBEC RBR-729kr8x), e recebeu aprovação do Comitê de Ética (processo CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) e o consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes da randomização e coleta da amostra.
O procedimento de reconstituição da microbiota do leite é feito em três etapas:
1. Obtenção de leite cru materno
NOTA: O procedimento para obtenção de leite pode ser encontrado em outro artigo10,11.
- Antes do procedimento, obtenha o consentimento informado da mãe de acordo com o comitê de ética e certifique-se de explicar tudo o que será feito à mãe, abordando quaisquer dúvidas, preocupações, medos e ansiedades sobre o procedimento para manter a mãe relaxada.
- Fazer com que a mãe extraia leite usando uma bomba tira leite elétrica em um recipiente esterilizado sob a supervisão da enfermeira responsável pela unidade, seguindo os padrões de higiene locais estabelecidos em cada maternidade.
- Após a coleta, rotule o recipiente contendo o leite com as informações da mãe, data e hora da coleta. Mantenha o leite materno (MOM) a uma temperatura de -4 °C ou inferior por até 12 h.
2. Descongelamento do leite pasteurizado de doador (PDM)
NOTA: Os BLHs possuem estoque próprio de PDM, congelado a temperatura abaixo de -4 °C por um período máximo de até 6 meses, e o procedimento é bem descrito na literatura em outros lugares 12,13,14.
- Descongele o leite cru ou PDM armazenado em recipientes de vidro esterilizado com tampas de plástico em banho-maria a 40 °C, garantindo a manutenção da temperatura e um menor tempo de processamento.
NOTA: Não descongele o PDM à temperatura ambiente ou à temperatura de refrigeração (dentro do frigorífico), pois os tempos de descongelação nestes casos são prolongados, o que promove a exposição e o crescimento microbiano. - Remova as garrafas de leite humano do banho-maria antes que o leite na garrafa atinja uma temperatura acima de 5 °C.
3. Inoculação de PDM com MOM para reconstituição do microbioma
NOTA: A proporção volumétrica padrão para o processo de inoculação de PDM com MOM é de 90%: 10% (v/v). As etapas do procedimento são as seguintes:
- Instrua o técnico a usar jaleco, máscara, touca e luvas.
- Limpe a superfície de trabalho com uma solução de limpeza de superfície seguindo o protocolo institucional local.
- Organize os materiais a serem utilizados e prepare o equipamento. Pré-aqueça a incubadora (banho-maria) com água a 37 °C.
- Planeje o volume final de leite inoculado a ser usado e selecione um recipiente de tamanho apropriado. Coloque o recipiente com MOM fresco e o PDM na forma líquida na superfície de trabalho.
- Colete uma alíquota de até 1 mL do MOM usando equipamento estéril para sequenciamento subsequente de 16S e contagem bacteriana. Armazenar a alíquota num criotubo isento de DNase/RNase a -80 °C.
- Transfira o volume restante, equivalente a 10% do volume final desejado de leite, usando um instrumento volumétrico estéril (por exemplo, seringa, pipeta) para um recipiente próprio para alimentos para ser imerso em banho-maria a 37 °C.
- Colete uma alíquota de 1 mL do PDM usando equipamento estéril para sequenciamento 16S subsequente e contagem bacteriana. Armazenar a alíquota num criotubo isento de DNase/RNase a -80 °C.
- Transferir uma quantidade de PDM equivalente a 90% do volume final desejado de leite usando instrumento volumétrico estéril (por exemplo, seringa, pipeta) para o recipiente com o MOM da etapa anterior, formando agora o leite materno inoculado (IM).
- Feche o recipiente com uma tampa que evite que qualquer líquido externo contamine o interior da garrafa e mergulhe-o no banho-maria a 37 °C por 4 h para permitir que os microrganismos inoculados no leite se multipliquem.
- Após 4 h, retire o recipiente com o IM fermentado do banho-maria, agora chamado de leite reconstituído (RM).
- Reserve uma alíquota de até 1 mL usando equipamento estéril para sequenciamento 16S subsequente e contagem bacteriana. Armazenar a alíquota num criotubo isento de DNase/RNase a -80 °C.
- Transfira o volume restante para um recipiente higienizado para alimentar os recém-nascidos.
4. Validação do método por cultura bacteriana em placas
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis para evitar contaminação e garantir a precisão das diluições. O crescimento bacteriano pode ser estimado usando métodos descritos em outroartigo 9,15.
- Prepare diluições seriadas de cada amostra de leite (PDM, MOM, IM, RM) em solução salina estéril nas concentrações de 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 . Misture bem cada diluição para garantir uma distribuição bacteriana uniforme.
- Pipete e espalhe 100 μL de cada amostra diluída em placas de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) e Mannitol Salt Agar (MSA) em triplicatas, usando um laço Drigalski estéril ou espalhador de vidro. Certifique-se de que o volume esteja uniformemente espalhado na placa de ágar.
- Incube placas de ágar MRS em um frasco anaeróbico contendo para criar um ambiente com baixo teor de oxigênio para o crescimento de bactérias do ácido lático.
- Incubar placas de ágar sal de manitol (MSA) aeróbicas para apoiar o crescimento de espécies de Staphylococcus.
- Incubar as placas a 37 ± 2 °C durante 48-72 h.
- Selecione a diluição com um número contável de colônias bacterianas (25-250 colônias) em cada tipo de ágar
- Contar as colónias visíveis em cada uma das três placas replicadas para a diluição seleccionada.
- Calcular a contagem média de colónias a partir de placas triplicadas para a diluição seleccionada nos meios MRS e MSA.
- Determine o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por mL para cada amostra usando a fórmula a seguir e converta para uma escala logarítmica de base 10 (log10) para facilitar a interpretação. Prossiga com a análise estatística dos resultados.
Número de UFC/ml = Número de colónias × factor de diluição total/volume plaqueado em ml
5. Análise do microbioma do leite
NOTA: A análise do microbioma do leite pode ser realizada de acordo com os métodos e pipeline descritos em outro lugar16. Uma captura de tela do script R usado nesta análise é apresentada na Figura Suplementar S1.
- Centrifugar 500 μL da amostra durante 15 s a 180 × g para sedimentar as células e as partículas.
- Colete 350 μL do sobrenadante e use-o para extração de DNA.
- Quantificar o ADN extraído utilizando um espectrofotómetro.
- Amplificar as regiões V3 e V4 do RNA ribossômico 16S usando 20 ng de DNA e primers 357F / 805R (ver Tabela de Materiais) 17 .
- Use esferas magnéticas para purificar os amplicons resultantes e quantificar os amplicons com código de barras usando um fluorímetro de DNA.
- Sequencie os amplicons no modo de extremidade emparelhada de 250 bp.
- Processe as sequências resultantes executando o corte de qualidade e a remoção do adaptador18. Use o modo de extremidade emparelhada (PE) com pontuação Phred33 e defina um comprimento mínimo de leitura de 200 bp para garantir leituras de alta qualidade.
- Importe dados de sequência de extremidade emparelhada para o QIIME 219 usando um formato de arquivo de manifesto e o comando: qiime tools import.
- Processe as sequências importadas com DADA2 para remoção de ruído, desreplicação e quimera usando o comando: qiime dada2 denoise-paired. Esta etapa gera sequências representativas de alta qualidade e uma tabela de recursos.
- Filtre recursos e sequências para reter apenas aqueles com representação suficiente usando os comandos: qiime feature-table filter-features e qiime feature-table filter-seqs.
- Prepare um banco de dados de referência extraindo regiões amplificadas pelos primers (V3-V4) usando: qiime feature-classifier extract-reads.
- Use o algoritmo VSEARCH para classificação taxonômica com o banco de dados de referência Silva em um limite de identidade de 97% executando o comando:
qiime classificador de recursos classificar-consenso-vsearch - Integre atribuições taxonômicas com a tabela de recursos usando ferramentas BIOM: biom add-metadata.
- Realizar análises estatísticas conforme descrito em outro artigo 20,21.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Análise do crescimento bacteriano por cultura em placas
Os testes microbiológicos realizados para validar o método de inoculação do PDM com o MOM, conforme proposto por Cacho et al.9, demonstraram que, com base na contagem de UFC/mL, não houve diferenças significativas entre as amostras de leite inoculadas antes e após a incubação de 4 h. No entanto, diferenças no número de colônias foram observadas nesses dois momentos, indicando crescimento bacteriano durante a incubação em M...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Apresentamos aqui um protocolo a ser aplicado em maternidades associadas a um banco de leite humano, com o objetivo de proporcionar ao PDM a reconstituição da microbiota láctea de uma mãe específica que, por motivos diversos, não consegue fornecer leite suficiente ao seu recém-nascido. O protocolo é simples e essencialmente baseado em duas etapas. A primeira envolve a aplicação de procedimentos rotineiramente realizados em bancos de leite humano para a coleta adequada e posterior pasteur...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Programa de Pesquisas para o SUS, PPSUS/2020, Ministério da Saúde do Brasil; Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina, Processo: 2021TR000506; Programa de Pesquisa Universal, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério de Ciência e Tecnologia do Brasil, Processo: 420996/2023-0; Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022 - 2024, Processo: 120815/2023-0. Agradecemos também aos voluntários por fornecerem amostras.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba elétrica para leite materno | Horigen | XN-2219M2 | Bomba macia dual plus |
| Pyrex garrafas de mídia | Corning | CLS1395100 | Recipientes de vidro com tampas de plástico |
| 1000 µ Pipeta L Labmate pro | Corning HTL SA | 5666 | Pipetador de volume variável |
| Frasco criogênico | Corning | CLS431417 | Frascos de 2 mL sem DNase/RNase |
| Tubos de centrífuga de 15 mL Corning | CLS431470 | Tubos de 15 mL sem DNase/RNase | |
| Banho-maria | EcoSonics | Q3.0/40A | |
| Man– Rogosa– Sharpe (MRS) | Difco | 288210 | Meio de crescimento de bactérias lácticas |
| Ágar Sal de Manitol (MSA) | Himedia | MH118 | Staphylococcus Meio de crescimento |
| Anaeróbico | Jar Permution | Crie um ambiente de baixo oxigênio para o crescimento de bactérias lácticas | |
| Extraa Kit - DNA e RNA | Loccus | MPTA-PV16-B Y | Kit de extração de DNA |
| Nanodrop | Promega | E6150 | Quantus DNA |
| GoTaqG2 | Promega | M7841 | Sistema de amplicação de PCR |
| Quórmetro | Promega | E5150 | Kit de quantificação de DNA / RNA |
| MiSeq System | Illumina Inc. | M-GL-00006 v4.0 | Equipamento de sequenciamento |
| Kit de reagentes MiSeq v2 (300 ciclos) | Illumina Inc. | MS-102-2002 | Kits e reagentes de sequenciamento |
| Nome do software | |||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic | Ferramenta de corte de leitura para dados Illumina NGS | |
| QIIME 2 | https://docs.qiime2.org/2024.10/ | Pacote de análise de microbioma | |
| Nome do primer | Sequência do primer | ||
| 16S_357F | TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG | ||
| 16S_805R | GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC |
Referências
- Szyller, H., et al. Bioactive components of human milk and their impact on child's health and development, Literature Review. Nutrients. 16 (10), 1487(2024).
- Fernández, L., Rodríguez, J. M. Human milk microbiota: Origin and potential uses. Nestle Nutr Inst Workshop Ser. 94, 75-85 (2020).
- Fernández, L., Ruiz, L., Jara, J., Orgaz, B., Rodríguez, J. M. Strategies for the preservation, restoration and modulation of the human milk microbiota. Implications for human milk banks and neonatal intensive care units. Front Microbiol. 9, 2676(2018).
- Meier, P. P. More evidence: Mothers' own milk is personalized medicine for very low birthweight infants. Cell Rep Med. 3 (8), 100710(2022).
- Fewtrell, M. S., et al. Predictors of expressed breast milk volume in mothers expressing milk for their preterm infant. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 101 (6), F502-F506 (2016).
- Abrams, S. A., et al. Donor human milk for the high-risk infant: Preparation, safety, and usage options in the United States. Pediatrics. 139 (1), e20163440(2017).
- Brasil é referência em doação de leite materno. , Serviços e Informações do Brasil. At https://www.gov.br/pt-br/noticias/saude-e-vigilancia-sanitaria/2020/02/brasil-e-referencia-em-doacao-de-leite-materno (2024).
- Landers, S., Updegrove, K. Bacteriological screening of donor human milk before and after holder pasteurization. Breastfeed Med. 5 (3), 117-121 (2010).
- Cacho, N. T., et al. Personalization of the microbiota of donor human milk with mother's own milk. Front Microbiol. 8, 1470(2017).
- Pumping breast milk. , Centers for Disease Control and Prevention - CDC. https://www.cdc.gov/nutrition/infantandtoddlernutrition/breastfeeding/pumping-breast-milk.html (2023).
- Expressing and storing breast milk. , NHS UK. https://www.nhs.uk/conditions/baby/breastfeeding-and-bottle-feeding/breastfeeding/expressing-breast-milk/ (2020).
- Arslanoglu, S., et al. Recommendations for the establishment and operation of a donor human milk bank. Nutr Rev. 81 (Supplement_1), 1-28 (2023).
- Moro, G. E., et al. Processing of donor human milk: Update and recommendations from the European Milk Bank Association (EMBA). Front Pediatr. 7, 49(2019).
- Landers, S., Hartmann, B. T. Donor human milk banking and the emergence of milk sharing. Pediatr Clin North Am. 60 (1), 247-260 (2013).
- Stachelska, M. A. Identification of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus strains present in artisanal raw cow milk cheese using real-time PCR and classic plate count methods. Pol J Microbiol. 66 (4), 491-499 (2017).
- Ruiz, L., et al. Comparison of two approaches for the metataxonomic analysis of the human milk microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 11, 622550(2021).
- Lopez Leyva, L., Brereton, N. J. B., Koski, K. G. Emerging frontiers in human milk microbiome research and suggested primers for 16S rRNA gene analysis. Comp Struct Biotechnol J. 19, 121-133 (2021).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible iInteractive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), e61217(2013).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2024).
- Torrez Lamberti, M. F., et al. Metabolomic profile of personalized donor human milk. Molecules. 25 (24), 5783(2020).
- Mallardi, D., et al. Inoculation of mother's own milk could personalize pasteurized donor human milk used for feeding preterm infants. J Transl Med. 19 (1), 420(2021).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
