Artigo de método

Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

DOI:

10.3791/67780

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27 de dezembro de 2024

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1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, demonstramos como as células epiteliais cultivadas com fibroblastos no sistema de duas camadas baseado em membrana nanofibrosa podem aderir e crescer de forma estável na membrana.

Resumo

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Os obstáculos técnicos em uma cultura de células epiteliais incluem desdiferenciação e perda de função. Os métodos biomiméticos de cultura de células tridimensionais (3D) podem aumentar a eficiência da cultura de células. Este estudo apresenta um sistema avançado de cultura de duas camadas destinado a cultivar células epiteliais como camadas semelhantes a tecidos com a cultura de fibroblastos em um ambiente 3D. As membranas nanofibrosas (NMs) de álcool polivinílico (PVA) e poli(ε-caprolactona) (PCL) foram fabricadas por eletrofiação e utilizadas como matriz extracelular fisiologicamente relevante para o cultivo de células epiteliais e fibroblastos, respectivamente. Nos poços de inserção superiores, as células epiteliais pulmonares foram cultivadas no NM do PVA e, nas câmaras inferiores, os fibroblastos foram cultivados no NM do LCP. Essa configuração elimina o contato direto célula-célula e facilita o exame da sinalização parácrina mediada por fatores solúveis. A microscopia confocal foi empregada para analisar a distribuição, o padrão de crescimento e a expressão de proteínas intracelulares, incluindo zona occludens em células epiteliais. As técnicas de empilhamento Z permitiram reconstruções 3D detalhadas, fornecendo informações precisas sobre a integridade das junções apertadas e a organização espacial dentro da camada epitelial. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) avaliou as características morfológicas dos tipos celulares nas membranas nanofibrosas. A imagem de MEV revelou estruturas intrincadas da superfície celular e interações com as nanofibras, oferecendo uma perspectiva abrangente sobre a arquitetura celular e a interação celular com a estrutura nanofibrosa. O ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) é um método simples para medir as taxas de crescimento de células epiteliais e fibroblastos ao longo do tempo. Ele fornece os comportamentos proliferativos e os potenciais efeitos sinérgicos da cocultura dessas células. Esses achados destacam a eficácia de um sistema de co-cultura de inserção simples para cultura simultânea de fibroblastos e células epiteliais, o que é crucial em vários contextos fisiológicos e farmacológicos, incluindo regeneração de tecido epitelial, microambiente tumoral com células endoteliais, imunes e outras células do estroma, ensaio de toxicidade e teste de atividade de drogas.

Introdução

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Ao longo das décadas, a clássica cultura de monocamada bidimensional (2D) tem sido essencial para a compreensão de infecções, farmacologia e toxicologia 1,2. No entanto, é importante considerar a complexidade, as interações dinâmicas entre as multicomposições e a arquitetura tridimensional (3D) do microambiente tecidual. Assim, a cultura de células 2D tem limitações em mimetizar estruturas semelhantes a tecidos 3,4. Por exemplo, há uma falta de sinalização célula a célula e célula a matriz extracelular (ECM), que é essencial na diferenciação celular, proliferação e funções celulares no microambiente vivo. Por essas razões, os sistemas de culturas de células 3D foram desenvolvidos5. As células em cultura 3D crescem e interagem com a matriz extracelular circundante em três dimensões. Além disso, uma abordagem de cocultura 3D, composta por mais de um tipo de célula, foi desenvolvida para preencher a lacuna entre os modelos simplistas de tipo de célula única in vitro e as interações celulares dinâmicas que ocorrem in vivo6. Os sistemas de cocultura 3D ganharam popularidade no estudo da comunicação célula-célula e das interações célula-matriz extracelular (ECM) 7,8,9,10. Os sistemas atuais de cocultura 3D têm várias formas e podem ser separados em cocultura direta e indireta 8,9. Na cocultura direta, várias funções celulares em células cultivadas podem ser afetadas principalmente pelo contato direto, em vez de efeitos parácrinos. Em comparação, a cocultura indireta tem uma vantagem maior na investigação da interação parácrina usando barreiras ou camadas para separar diferentes tipos de células.

Vários materiais e métodos são utilizados para fabricar scaffolds biomiméticos imitando a ECM usando substâncias biocompatíveis e biodegradáveis10. A estrutura de andaime nanofibroso mimetiza a configuração da ECM nativa em tecidos biológicos, fornecendo uma arquitetura 3D para cultura de células11,12. As membranas nanofibrosas (MNs) eletrofiadas têm sido utilizadas na cocultura direta e indireta de diferentes tipos de células 13,14,15.

As células epiteliais formam uma barreira física dos órgãos principais, enquanto os fibroblastos são células predominantes do estroma que medeiam a remodelação da MEC e regulam o epitélio vizinho 6,16,17. As células epiteliais e os fibroblastos interagem com a laminina na membrana basal e a fibronectina na matriz intersticial, respectivamente, por meio de receptores de integrina na superfície celular18. Quando as células epiteliais são cultivadas em MNs de poli (álcool vinílico) (PVA) com diâmetros de 150 - 250 nm e microporos, elas formam multicamadas em vez de agregados celulares e esferoides, e seus padrões de crescimento são semelhantes aos das células no tecido epitelial19. Em comparação, os NMs de poli(caprolactona) (PCL) com diâmetros de 400-1.500 nm e microporos de 10-50 μm fornecem uma dimensionalidade espacial semelhante à matriz intersticial para o crescimento de fibroblastos cultivados13,14. Devido à sua biocompatibilidade, as membranas de PVA e PCL são polímeros comumente usados na engenharia de tecidos20,21.

Este estudo apresenta um sistema avançado de cultura de duas camadas usando NMs eletrofiados porosos para cultivar células epiteliais como camadas semelhantes a tecidos e fibroblastos dentro de uma estrutura 3D. O protocolo pode ser dividido em cinco etapas principais: fabricação de nanofibras, pós-reticulação de fibras e avaliação de qualidade, preparação de poços de cultura ligados à membrana, semeadura de células e cocultura 3D e ensaios de células cultivadas em 3D.

Protocolo

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1. Fabricação de nanofibras de PVA estáveis à água

  1. Pese 0,02 g de poli (ácido acrílico) (PAA) e 1 g de PVA e, em seguida, adicione-os em um frasco de vidro limpo contendo uma barra magnética. Adicione 7,8 mL de água destilada à garrafa, coloque a garrafa em um agitador de pratos e ajuste a temperatura para 84 °C, a velocidade para 500 rpm e o tempo para 12 h.
  2. Deixe o frasco esfriar até a temperatura ambiente antes de adicionar 0,2 mL de glutaraldeído (GA). Coloque a garrafa no agitador de placas e ajuste a velocidade para 500 rpm, o tempo para 30 min e a temperatura para a temperatura ambiente.
  3. Use uma seringa de 5 mL para eletrofiação, separe os êmbolos dos barris e limpe pequenos detritos de plástico dentro dos barris e da ponta dos êmbolos.
  4. Use agulhas para bloquear o fluxo de líquido e, em seguida, despeje a solução de PVA em cada barril (volume: 2,5-3 mL cada). Monte os êmbolos e remova as agulhas.
    NOTA: Pode haver uma bolha na solução, então espere até que a bolha desapareça. Isso leva de 10 a 30 minutos.
  5. Monte uma nova agulha de metal de 27 G e coloque-a na máquina de eletrofiação.
  6. Enrole bem o coletor com papel alumínio.
  7. Deixe o painel injetor retornar à posição original. Use as seguintes configurações para a máquina: (cada bomba) volume de injeção: 2 mL, taxa de injeção: 6 μL/min, velocidade do rolo: 100 rpm, distância da ponta ao coletor: 14 cm. Verifique o fluxo de líquido para cada bomba.
  8. Opere a máquina com um potencial elétrico de aproximadamente 12 kV.
  9. Certifique-se de que a umidade seja de 40 a 50% no início e de 25 a 30% no final do processo. Use um umidificador quando a umidade diminuir e coloque pratos contendo água destilada dentro da máquina no dia anterior à eletrofiação para aumentar a umidade.
    NOTA: Este é um fator crítico na fabricação bem-sucedida de nanofibras de PVA.
  10. Verifique o fluxo regularmente. Se a agulha estiver bloqueada, pare temporariamente a máquina. Use um lenço de laboratório para remover a gota e espere até que a nova gota apareça. Caso contrário, troque a agulha e continue operando a máquina.
  11. O processo de fabricação de nanofibras de PVA leva ~ 6 h para ser concluído. Após o término do processo de eletrofiação, retire a folha contendo o tapete de fibra do coletor e armazene o tapete de nanofibra no dessecante sob vácuo.

2. Tratamento de uma membrana nanofibrosa de PVA com vapor de ácido clorídrico (HCl) e avaliação da qualidade da fibra

NOTA: A estabilidade hídrica dos NMs de PVA é bem preservada após a reação de pós-reticulação pelo vapor de HCl. Este processo é otimizado para espessura, tamanho de poro e rugosidade adequados dos NMs. O PVA é um polímero muito hidrofílico e as nanofibras de PVA eletrofiadas são instáveis em contato com a água e em condições úmidas. Os NMs de PVA devem ser tratados com vapor de HCl logo após a fabricação do polímero de PVA.

  1. Corte um tapete de nanofibra em pedaços do tamanho desejado para a inserção do poço trans.
  2. Prepare um pequeno prato contendo 1,5 mL de HCl puro. Coloque o prato contendo HCl e pedaços de nanofibra dentro de uma câmara de vácuo e feche a tampa.
    NOTA: O vapor de HCl é usado como agente de pós-reticulação para tornar a nanofibra estável à água.
  3. Abra a válvula conectada à bomba de vácuo, aguarde 10 s até que a fumaça de HCl suba e, em seguida, feche a válvula. Trate as membranas com HCl fume durante 2 min.
  4. Após o tratamento com vapor de HCl, adicione algumas gotas de água destilada (DW) às membranas, coloque-as em uma lâmina de vidro e remova a membrana da folha. Após a secagem ao ar por 20 min, as membranas aderem naturalmente à lâmina.
  5. Cubra as membranas com fita de carbono com uma fina camada de ouro usando um revestidor automático. Obtenha imagens de microscópio eletrônico de varredura (SEM).
  6. Após a reticulação de NMs de PVA com HCl, lave-os 3x com 1x PBS e verifique o pH após mergulhá-los em meio de cultura para confirmar a ausência de HCl residual.

3. Fabricação de nanofibras PCL e avaliação da qualidade das nanofibras

  1. Pesar 1,5 g de PCL e adicioná-lo a um frasco de vidro limpo. Adicione 8,5 mL de clorofórmio ao frasco, coloque o frasco em um agitador de placas e dissolva o PCL em clorofórmio por 12 h em temperatura ambiente.
  2. Repita as etapas 1.3 a 1.9, exceto as etapas 1.7 e 1.8, defina a taxa de injeção em 8 μL/min e a tensão em 17.5 kV.
    NOTA: A fabricação do PCL leva ~ 3,5 h para ser concluída.
  3. Corte um pequeno pedaço da membrana e cubra os pedaços pelo processo de pulverização automática por 5 min. Obtenha imagens SEM.

4. Montagem de duas camadas de membranas em um poço trans

NOTA: Neste protocolo, utilizamos uma placa de 24 poços e seu respectivo poço de inserção. O PVA NM é fixado ao poço de inserção, enquanto o PCL NM é fixado ao poço inferior.

  1. Corte um tapete de nanofibra em pedaços redondos, com um diâmetro de 10 mm e 13 mm para NMs de PVA e PCL, respectivamente.
  2. Use polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 como agente adesivo para prender as membranas ao inserto e à câmara. Antes de usar, misture Sylgard 184 Base (parte A) e Agente de Cura (parte B) em um copo plástico em uma proporção de massa de 10:1. Use uma lâmina de vidro limpa para misturar a solução PDMS vigorosamente por 2-3 min até que toda a mistura esteja cheia de bolhas. Deixe a bolha se formar e desaparecer por 10 min antes de usar; enquanto isso, deixe o slide aquecer a 100 °C.
  3. Espalhe o PDMS em uma lâmina de vidro e mergulhe a borda inferior do inserto levemente no PDMS. Mantenha a pastilha bem de cabeça para baixo no aquecedor de lâminas para que o PDMS endureça (~10-15 min). Verifique cuidadosamente com uma ponta de 200 μL para certificar-se de que o PDMS não está pegajoso.
  4. Trate as peças de PVA NM conforme descrito nas etapas 2.2 a 2.4.
  5. Pressione suavemente o inserto bem na peça PVA NM de modo que a parte inferior do inserto fique bem voltada para o lado de nanofibra da peça de membrana. Adicione uma gota de água destilada no centro do poço e use uma pinça para remover o papel alumínio. Coloque bem o inserto em uma nova placa de 24 poços e deixe a membrana secar.
  6. Ao prender a peça PCL NM no poço inferior, certifique-se de mergulhar a ponta de 200 μL na mistura PDMS e pontilhar com precisão nos quatro cantos e no centro.
  7. Coloque a placa no aquecedor de lâminas e deixe o PDMS endurecer por 5-7 min para garantir a qualidade da montagem.
  8. Coloque a peça PCL NM no poço contendo PDMS, com o lado de nanofibra da membrana preso ao PDMS. Use uma pequena escova limpa para pressionar levemente o lado da folha da peça da membrana para uma fixação completa. Adicione 0,2 mL de etanol a 70% ao poço para remover facilmente a folha.
  9. Esterilize o inserto e o poço inferior na configuração do poço trans sob luz ultravioleta durante a noite.
    NOTA: O PDMS misto pode ser armazenado a -20 °C para uso posterior. CUIDADO: A placa fixada à membrana nanofibrosa PCL pode ser armazenada seca, mas deve ser molhada com etanol a 70% antes do uso.
  10. No dia seguinte, lave bem a inserção e o fundo adicionando 200 μL e 500 μL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS), respectivamente, por 3 x 10 min. A inserção e o fundo estão prontos para uso.

5. Semeadura celular e montagem de duas camadas para o modelo de cocultura

NOTA: As células MLE-12 foram cultivadas em 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina. As células NIH3T3 foram cultivadas em 1x DMEM com glicose alta com 10% de FBS e 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina.

  1. Manter as células numa placa de cultura de 150 mm. Quando estiverem 70-80% confluentes, lave as células com 10 mL de 1x PBS e tripsinize-as com 2 mL de solução pré-aquecida de tripsina/EDTA a 0,05% por 3 min a 37 °C.
  2. Bata suavemente no prato para desalojar as células do fundo e, em seguida, adicione 8 mL de meio de cultura completo a cada tipo de célula para neutralizar a enzima tripsina. Transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 50 ml, centrifugar a 400 × g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Pinte as células com o Cell-Tracker para observar a distribuição das células semeadas no NM (consulte a seção 6 para obter mais detalhes).
  3. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio DMEM/F12 completo. Determine o número de células e ajuste para 6 × 106 células MLE-12 / mL e 8 ×10 5 células NIH3T3 / mL.
    NOTA: O meio DMEM/F12 completo é usado para cocultura com células MLE-12 e NIH3T3.
  4. Encha o poço inferior com 500 μL de meio DMEM/F12 completo (o poço sem PCL). Transfira a inserção anexada à membrana nanofibrosa de PVA para o poço trans e adicione 50 μL de suspensão de células MLE-12. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.
  5. Simultaneamente, preencha o poço inferior anexado à membrana nanofibrosa PCL com 500 μL de suspensão de células NIH3T3 e incube as células a 37 ° C e 5% de CO2.
  6. Após 2 h, monte o inserto contendo células MLE-12 e o poço inferior contendo células NIH3T3 na configuração do poço trans. Este é o modelo de cocultura com células MLE-12 como camada superior e células NIH3T3 como camada inferior. Cocultura das células nas membranas de duas camadas pelo tempo desejado.

6. Ensaio de distribuição celular

  1. Prepare 5 μM de solução vermelha e verde Cell-Tracker em um volume total de 2 mL de meio DMEM / F12 completo.
  2. Após a tripsinização, misture as células MLE-12 com a solução vermelha Cell-Tracker previamente preparada e o NIH3T3 com a solução verde Cell-Tracker. Incube as células a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min para garantir a rotulagem celular ideal. Adicione 8 mL de meio DMEM/F12 completo às amostras e centrifugue a 400 × g por 5 min.
    NOTA: O Cell Tracker não pode afetar a viabilidade e proliferação celular. Portanto, as células coradas com Cell-Tracker podem ser cultivadas até a confluência. A intensidade de fluorescência nas células coradas pode reduzir 4-5 dias após a cultura.
  3. Repita as etapas 5.3 a 5.6.
  4. Enquanto observa sob um microscópio confocal, transfira o poço do inserto da placa de 24 poços para uma placa de 12 poços.
    NOTA: Isso minimiza a distância entre a lente objetiva e as células, permitindo a observação da morfologia celular.

7. Observações confocais de células cocultivadas em 3D

NOTA: A ligação das células epiteliais a um NM de PVA é fraca em comparação com a dos fibroblastos a um NM de PCL. Descarte o meio antigo manualmente por aspiração de pipeta e adicione um novo meio ou solução suavemente à parede dos poços. Durante o processo de coloração, tente não deixar as membranas secarem.

NOTA: A fixação celular pode ser melhorada revestindo laminina ou incorporando peptídeos de motivos de ligação à integrina em nanofibras de PVA19.

  1. Transfira o inserto para uma nova placa de 24 poços. Descarte a mídia antiga e adicione 150 μL de uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4%. Incubar por 15 min em temperatura ambiente.
  2. Remova a solução de PFA a 4% e lave as células aderidas com 150 μL de PBS 1x.
  3. Para bloqueio e permeabilização, adicione 150 μL de soro de cabra normal a 5% e Triton X-100 a 0,2% diluído em 1x PBS e incube por 30 min em temperatura ambiente.
  4. Prepare o anti-zona occludens conjugado com Alexa Fluor 594 Ab (1:400) e Phalloidin-iFlour 488 (1:1.000) diluindo-os em reagente diluente de anticorpos. Remova a solução de bloqueio, adicione 150 μL da solução de fluoróforo por poço e incube por 1 h em temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare as soluções de anticorpos com a máxima precisão, pois isso afetará diretamente a qualidade dos resultados. Evite a exposição à luz.
  5. Descarte a solução de anticorpos e lave as células com 150 μL de PBS 1x por 10 min.
  6. Adicione 150 μL de Hoechst 33342 diluído em 1x PBS (1:1.000) e incube por 10 min; Evite a exposição à luz.
  7. Remova a solução Hoechst 33342 e lave as células aderidas com 150 μL de 1x PBS por 10 min.
  8. Prepare uma lâmina de vidro limpa e adicione uma quantidade precisa de gel de montagem aquoso. Use uma pinça com pontas pontiagudas para destacar delicadamente as membranas da borda circundante. Coloque as membranas no gel de montagem, garantindo que o lado que contém as células esteja voltado para cima. Adicione uma quantidade precisa de gel de montagem e cubra com uma corrediça de cobertura. Sele as lâminas com esmalte, garantindo uma vedação precisa e completa.
  9. Observe as células sob um microscópio confocal usando as seguintes configurações de imagem: Controle de potência do laser: 405 Intensidade 10; Controle de potência do laser: 488 Intensidade 10; Controle de potência do laser: 561 Intensidade 10; Sensibilidade do detector: 420LP (valor 600); Sensibilidade do detector: 525/50 (valor 700); Sensibilidade do detector: 561LP (valor 750).

8. Ensaio de ligação celular a nanofibras

  1. Descarte a mídia antiga e lave as células com 150 μL de PBS 1x.
  2. Fixe as células com 150 μL de GA a 3% diluído em 1x PBS por 1 h em temperatura ambiente.
  3. Lave as células com 150 μL de 1x PBS em 10 min.
  4. Fixe as células secundariamente adicionando 150 μL de tetróxido de ósmio a 1% (OsO4) diluído em 1x PBS por 1 h.
    CUIDADO: OsO4 e seu vapor são prejudiciais. Deve ser usado em uma capela de exaustão.
  5. Descarte a solução e lave as células com 300 μL de PBS 1x por 2 x 10 min.
  6. Desidrate as células com etanol graduado de 50%, 70%, 90% e 95% a 100%, por 10 min em cada etapa. Execute a última etapa de desidratação adicionando etanol 100% fresco por 10 min.
  7. Seque completamente as células e membranas ao ar. Use uma pinça com as pontas pontiagudas para destacar as membranas e coloque as membranas no suporte da amostra usando uma torneira de dois lados. Execute a pulverização catódica de íons por 5 minutos antes de observar as células sob MEV com ampliação de 2.000x.

9. Ensaio de crescimento celular

NOTA: Neste protocolo, o ensaio CCK-8 é usado para quantificar a taxa de crescimento celular seguindo as instruções do fabricante.

  1. Prepare a mistura CCK-8 misturando 9 partes de DMEM/F12 pré-aquecido (em volume) com 1 parte do reagente CCK-8. Depois de remover o meio de cultura antigo, adicione 150 μL da mistura CCK-8 ao poço contendo células.
  2. Transfira o inserto para a nova placa de 24 poços para separá-lo do poço inferior contendo as células. Incubar as células durante 45 min a 37 °C e 5% de CO2.
  3. Recolha o sobrenadante e transfira-o para um tubo de 1,5 ml. Centrifugue a 1.800 × g por 3 min.
  4. Adicione 100 μL do sobrenadante do tubo de microcentrífuga à placa de 96 poços. Ler densidade óptica (OD) a 450 nm.

Resultados

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Este protocolo descreve as etapas críticas para a cocultura de células epiteliais pulmonares MLE-12 e fibroblastos NIH3T3, construindo um modelo de duas camadas baseado em membrana nanofibrosa (Figura 1). Este modelo é adequado para imagens de células vivas, imuno-histoquímica e análise quantitativa de endpoint de células cocultivadas. Outros tipos de células também podem ser utilizados otimizando a densidade celular e as condições de crescimento.

O MEV mostra a distribuição uniforme das nanofibras de PVA fabricadas sem qualquer formação de grânulos (Figura 2A). O diâmetro das nanofibras de PVA variou de 150 nm a 230 nm (180 ± 25 nm, média ± desvio padrão (DP)). As nanofibras em NMs de PCL eletrofiadas foram orientadas aleatoriamente e estruturalmente semelhantes ao colágeno (Figura 2B). A maioria das fibras em NMs de LCP tinha um diâmetro entre 300 nm e 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Assim, a membrana nanofibrosa de PVA tinha tamanhos de poros menores do que a membrana nanofibrosa de PCL.

Antes da semeadura, as células MLE-12 e NIH3T3 foram coradas com Cell-Tracker vermelho e verde, respectivamente, e foram monitoradas durante todo o processo de cocultura. Conforme mostrado na Figura 3, a distribuição espacial das células MLE-12 na câmara de inserção e das células NIH3T3 na câmara inferior pôde ser observada distintamente. A análise de empilhamento de foco revelou que as células NIH3T3 foram dispersas e detectadas em profundidades variadas (102 ± 20 μm), enquanto as células MLE-12 formaram camadas com espessura de 80 ± 10 μm. O MEV mostra a ligação das células às membranas. As células NIH3T3 infiltram-se na membrana nanofibrosa do PCL e estendem-se ao longo dos eixos das nanofibras, enquanto as células MLE-12 aderiram à superfície da membrana nanofibrosa do PVA e exibiram uma agregação (Figura 4). Em seguida, examinamos a organização do citoesqueleto das células NIH3T3 e MLE-12 por coloração com actina. As células NIH3T3 cultivadas na membrana nanofibrosa PCL mostram uma distribuição de projéteis de filamentos de actina semelhantes a células no tecido, e a coloração de actina em células MLE-12 cultivadas em membrana nanofibrosa de PVA mostra agregados redondos sem espalhamento celular (Figura 5).

A distribuição e o padrão de crescimento das células MLE-12 em monocultura e cocultura foram comparados. As células coradas com vermelho Cell-Tracker em monocultura nos NMs de PVA formaram agregados, mas as células em condição de cocultura mantiveram uma distribuição uniforme na membrana ( Figura 6A ). Em uma análise 3D de imagens de microscopia confocal, o padrão de crescimento de células MLE-12 cocultivadas nos NMs de PVA mostra adesão em camadas de células cultivadas à membrana com densidade celular mais confluente, em comparação com células cultivadas na ausência de fibroblastos (Figura 6B). Além disso, a adesão célula a célula e a expressão de oclusina zonal (ZO)-1 nas superfícies celulares (seta indicada), mas não de agregados celulares, foram mais evidentes na condição de cocultura do que na cultura sem fibroblastos (Figura 6C).

A proliferação de células nas membranas foi medida usando o ensaio CCK-8. A proliferação celular NIH3T3 e MLE-12 aumentou com o tempo (Figura 7). No entanto, taxas de crescimento de células mais baixas foram observadas nas membranas do que em uma placa de cultura (dados não mostrados). As células NIH3T3 e MLE-12 cocultivadas em NMs mostram uma taxa de crescimento estável em comparação com as células monocultivadas em uma placa de cultura.

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Figura 1: Esquema para ilustrar o método de co-cultura de fibroblastos NIH3T3 e células epiteliais MLE-12 no sistema de duas camadas baseado em andaimes. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Estrutura das nanofibras de PVA e PCL. (A) AS membranas nanofibrosas de PVA e (B) PCL foram produzidas por eletrofiação. A estrutura e o diâmetro das nanofibras são medidos por MEV das superfícies da membrana. Barras de escala = 1 μm (A), 10 μm (B). Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Em um sistema de cocultura, a distribuição espacial de células NIH3T3 na membrana nanofibrosa PCL e células MLE-12 na membrana nanofibrosa PVA. As células NIH3T3 (4 × 105) foram coradas com Cell-Tracker Green, e as células MLE-12 (3 × 105) foram coradas com Cell-Tracker Red. As células semeadas foram cultivadas por 24 h e observadas usando uma imagem de empilhamento Z de um microscópio confocal. Os números são indicados em μm; As setas mostram dimensões com X (largura), Y (comprimento), Z (profundidade). Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Adesão e morfologia de células NIH3T3 na membrana nanofibrosa PCL e células MLE-12 na membrana nanofibrosa PVA. As células foram cultivadas nas membranas por 24 h e observadas usando MEV com aumento de 2.000x. Barras de escala = 15 μm. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Fibras de estresse de actina em células NIH3T3 na membrana nanofibrosa PCL e células MLE-12 na membrana nanofibrosa PVA. Células NIH3T3 (4 × 105) e células MLE-12 (3 × 105 células) foram semeadas nas membranas nanofibrosas PCL e PVA, respectivamente. Após 48 h de cultura, as células foram coradas com faloidina-iFlour 488 e observadas por microscopia confocal. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona); FITC = isotiocianato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Padrão de crescimento de células MLE-12 cocultivadas na membrana nanofibrosa de PVA. (A) Células MLE-12 coradas de vermelho Cell-Tracker (3 × 105 células) foram semeadas na membrana nanofibrosa de PVA e cultivadas isoladamente (células -NIH3T3) e com células NIH3T3 em um sistema de duas camadas (+células NIH3T3) por 48 h. (B) Células MLE-12 monocultivadas e cocultivadas por 48 h foram coradas com Hoechst 33342 (azul) e Phalloidin-iFlour 488 e observadas usando um microscópio confocal. As imagens 3D são mostradas usando a função de superfície do software Imaris. (C) As células MLE-12 foram cultivadas por 48 h e marcadas com fluorescência com Phalloidin-iFlour 488 e anticorpo anti-ZO-1 (vermelho). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Taxa de crescimento das células em um sistema de cocultura de duas camadas. As células NIH3T3 (4 × 105) e as células MLE-12 (3 × 105) são cocultivadas pelo tempo indicado. O crescimento celular no inserto e no fundo é medido usando o ensaio CCK-8. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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A transição da cultura 2D para os modelos de cultura 3D representa um avanço significativo no desenvolvimento de modelos de cocultura in vitro . Um modelo de cultura 3D deve imitar o microambiente do tecido no qual as células podem proliferar, agregar e se diferenciar22. O uso de modelos de cocultura 3D baseados em andaimes aumenta a replicação da arquitetura do tecido. Neste estudo, um sistema trans-well baseado em NM fornece cocultura 3D indireta de dois tipos de células. O LPC NM com poros dilatados na câmara inferior permite a infiltração celular e mimetiza a matriz intersticial. Este andaime suporta o crescimento e a organização espacial dos fibroblastos. O uso de uma membrana nanofibrosa de PVA na câmara superior permite a formação de células epiteliais MLE-12 na camada. O diâmetro e o tamanho dos poros da membrana nanofibrosa do PVA a tornam um substrato ideal para apoiar a adesão e o crescimento de células epiteliais, que mimetiza as células epiteliais na membrana basal nos tecidos epiteliais19.

Proteínas adesivas às células, como fibronectina e laminina, são proteínas-chave na MEC, que conectam as células às fibrilas de colágeno23. As células epiteliais interagem com a laminina por meio de receptores de integrina em sua superfície18. As células MLE-12 semeadas nos NMs de PVA aderiram e cresceram tridimensionalmente na membrana. No entanto, a ligação das células epiteliais ao PVA poroso NM foi baixa, resultando em agregação porque elas não possuem motivos biológicos específicos interagindo com as células cultivadas. Em nosso sistema de cocultura, o contato direto célula-célula entre as células NIH3T3 e MLE-12 está ausente e a comunicação ocorre exclusivamente por meio de sinalização parácrina. A presença de células NIH3T3 cocultivadas pode estabilizar a ligação de células MLE-12 à membrana durante todo o período de cultura. Essa estabilização pode ser atribuída à secreção de fatores solúveis pelos fibroblastos, incluindo colágeno, fibronectina, laminina e vários fatores de crescimento24. Em comparação, em um modelo tumoral com cocultura direta de fibroblastos e células cancerígenas em um andaime nanofibroso PCL, os fibroblastos alteram as propriedades da MEC por meio da remodelação da matriz25.

As células epiteliais repousam sobre uma membrana basal que atua como suporte de crescimento e camada seletivamente permeável. Várias estratégias tecnológicas, incluindo a tecnologia organoide, estão sendo desenvolvidas atualmente para criar modelos complexos 3D de tecidos epiteliais26. No entanto, a estrutura organoide dificulta o uso de ensaios convencionais27. Além disso, a microscopia convencional para coleta de dados experimentais é complicada pelo fato de que os organoides são cultivados enquanto incorporados em uma matriz de hidrogel 3D27. Neste estudo, a câmara de inserção foi separada da câmara baixa para facilitar a observação precisa das células epiteliais cultivadas em PVA NM. Além disso, os organoides 3D são produzidos pela diferenciação de células-tronco. Assim, a cultura de células-tronco leva muito tempo e é um procedimento complexo em comparação com um sistema de cocultura, e a heterogeneidade dos organoides é relatada28.

Em comparação com a monocultura, a cocultura de células epiteliais e fibroblastos melhora a adesão ao andaime e mantém o crescimento e a função estáveis das células epiteliais cultivadas. Além disso, materiais suplementares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, não são necessários no meio de cultura devido aos fatores solúveis secretados por fibroblastos cocultivados. Apesar das vantagens do uso de andaimes nanofibrosos na cocultura celular, fornecendo suporte estrutural, eles não podem fornecer células de cultura circundantes de ECM em comparação com hidrogéis biocompatíveis29. Assim, essa limitação pode ser alcançada usando células em NM com hidrogéis em camadas.

Em conclusão, um sistema de co-cultura de inserção simples para cultura simultânea de fibroblastos e células epiteliais é crucial em vários contextos fisiológicos e farmacológicos, incluindo regeneração do tecido epitelial, microambiente tumoral, ensaio de toxicidade e teste de atividade do medicamento. Um sistema de cocultura 3D baseado em membrana nanofibrosa será instrumentado e projetado para estudos de triagem de absorção e transporte de medicamentos de alto rendimento.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por uma doação do Projeto de P&D de Tecnologia de Saúde da Coreia por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria de Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar da República da Coreia (HR16C0001); o Projeto de Aprimoramento da Capacidade de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da bolsa do Instituto de Ciências Básicas da Coreia (Centro Nacional de Instalações e Equipamentos de Pesquisa) financiada pelo Ministério da Educação (2019R1A6C1010003); e subsídios da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiados pelo governo coreano (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% de tripsina / EDTAWelgeneLS015-01
100x penicilina / estreptomicinaGibco10378016
20x soluçãoPBS LPSCBP007A
4% de paraformaldeídoBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 conjugado ZO-1 anticorpoInvitrogen339194
diluente de anticorpos OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 kit de ensaioDonginbioCCK-3000
Placa de cultura de células (150x20)SPL20151
CellTracker Verde CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Vermelho CMTPXInvitrogenC34552
ClorofórmioSamchunC0584
Tubo cônicoSPL50050
Vidro de coberturaCorningCLS2980245
DMEM alta glicoseWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Dessecador bases com flange plana, roscaDWK Life Sciences 7.022 260
Tampa do dessecador de vidro DURAN e Torneira DaihanScienceSM.2444061
Torneira Duran, com Eixo de PTFEDWK Life Sciences 
Máquina de eletrofiaçãoNanoNCESR200RD
Álcool etílico, PureSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Módulo de Scanner Confocal a Laser de Fluorescência K1-fluoNanoscope Systems
Gel/mountBiomeda Corp.M01
Solução de glutaraldeídoSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Bico de metal 27GNanoNC
EsmalteNatureza república
Soro de cabra normalVector LaboratoriesS-1000
Tetróxido de ósmioSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Trava de Syringe_Lure de Plástico (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poli(ácido acrílico)Sigma Aldrich323667
Poli(álcool vinílico)Sigma Aldrich341584
PolicaprolactonaSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Microscopia Eletrônica de VarreduraSECSNE-4500M
Vidro deslizanteMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 conjuntoonisciênciaOMNI.05255
Synergy H1 Leitor MultimodoBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Referências

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