Uma operação simplificada para o modelo murino de perfuração endovascular de hemorragia subaracnóidea

Resumo

Aqui apresentamos uma operação simplificada para o modelo murino de perfuração endovascular de hemorragia subaracnóidea combinada com pontuação neurológica.

Resumo

O modelo de perfuração endovascular é comumente utilizado como método para simular hemorragia subaracnóidea (HAS) em estudos experimentais. Por mais abrangente e confiável que seja, requer técnicas complicadas. Este protocolo simplifica o modelo com alguns detalhes, combinado com a pontuação neurológica. Usamos uma sutura de náilon para enrolar e puxar a artéria carótida comum (CCA) para bloquear o fluxo sanguíneo temporariamente, além da ligadura tradicional, que oferece um campo operatório claro. A utilização da caneta de eletrocautério para fundir os vasos sanguíneos reduz o risco de sangramento. Além disso, usamos um filamento com uma marca preta para facilitar a determinação da profundidade da punção.

O avanço desimpedido do marcador preto além da bifurcação carotídea, onde a artéria carótida comum (CCA) diverge para a artéria carótida interna (ACI), acompanhado de resistência mínima, indica que o filamento atravessou com sucesso a junção intracraniana da artéria cerebral anterior (ACA) e artéria cerebral média (MCA). Este fenômeno significa o posicionamento do filamento em um ponto crítico de convergência cerebrovascular. Em seguida, avançar ligeiramente o filamento para a frente para perfurar o vaso sanguíneo permite uma operação mais fácil para perfuração endovascular em camundongos, facilitando assim a aplicação do modelo de perfuração endovascular em camundongos geneticamente modificados. Isso pode ser muito crucial para a pesquisa molecular e pesquisa e desenvolvimento farmacêutico.

Introdução

A hemorragia subaracnóidea (HSA), um subtipo grave de acidente vascular cerebral, está ligada a altas taxas de morbidade e mortalidade, afetando especialmente pessoas na casa dos cinquenta. A HAS espontânea é causada principalmente pela ruptura de aneurismas intracranianos, que ocorre predominantemente no círculo de Willis ^1,2. Clinicamente, os pacientes frequentemente apresentam cefaleias trovejantes, disfunção neurológica e rápido declínio da consciência³. Apesar dos avanços nos cuidados neurocríticos, quase 40% dos pacientes morrem dentro de um mês após o sangramento⁴. Várias complicações secundárias podem ocorrer após a HSA aneurismática, o que leva à deterioração neurológica progressiva. No entanto, a fisiopatologia e as características clínicas da HAS ainda são pouco compreendidas.

Assim, para entender melhor os mecanismos subjacentes e melhorar as estratégias terapêuticas, modelos abrangentes e confiáveis em pequenos animais são indispensáveis. Até o momento, vários protocolos para o estabelecimento de modelos de HSA foram apresentados. Por exemplo, uma abordagem envolve a injeção de sangue autólogo na cisterna magna. Outro protocolo modificado envolve duas injeções separadas, uma na cisterna magna e outra na cisterna do quiasma óptico. A injeção de sangue autólogo ganhou ampla adoção devido à sua simplicidade técnica e taxa de mortalidade favorável ^5,6. Para alcançar a possibilidade de usar um animal de laboratório menor e mais barato, Barry et al. descreveram o primeiro modelo de HSA em ratos em 1979 que envolvia a punção da artéria basilar com microeletrodos de tungstênio após a remoção do crânio⁷.

Em 1995, foi apresentado outro modelo de perfuração endovascular, uma versão modificada do modelo Zea-Longa de isquemia cerebral, cuja forma atual mais tarde se mostrou o modelo mais comumente utilizado para o estudo da HAS⁸. Pesquisas anteriores demonstraram que camundongos e humanos possuem uma estrutura vascular intracraniana semelhante, conhecida como círculo de Willis, onde o aneurisma intracraniano ocorre predominantemente⁹. Este método não craniotomia replica os mecanismos de ruptura do aneurisma humano por meio da perfuração precisa da bifurcação da^{ACI 10}. Além disso, o camundongo geneticamente modificado é freqüentemente usado no estudo de mecanismos moleculares. No entanto, devido às suas técnicas complicadas em pequenos animais, o modelo de perfuração endovascular é predominantemente utilizado em ratos ou coelhos, enquanto sua aplicação em camundongos é comparativamente menos comum. Portanto, é de grande importância simplificar o modelo murino de perfuração endovascular e reduzir sua alta taxa de mortalidade.

Aqui, apresentamos uma modificação simplificada do modelo murino de perfuração endovascular, integrando uma versão modificada da escala de avaliação neurológica de^Garcia11. Nossa modificação fornece um modelo fácil, conveniente e confiável para futuros estudos experimentais de HSA.

Protocolo

Camundongos machos C57BL/6 (6-8 semanas de idade), livres de patógenos específicos, foram mantidos em biotério com temperatura regulada e condições de aclimatação, mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas. Os ratos tiveram acesso ilimitado a uma dieta padrão para roedores e água da torneira esterilizada. Um período de aclimatização de 2 semanas foi permitido antes do início dos experimentos. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Longhua e conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Nacional de Ciência e Tecnologia da China para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparação animal

1. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento pré-aquecida a 37 °C e continue a manter essa temperatura até que a cirurgia seja concluída.
2. Anestesiar o rato por inalação de 2-2,5% de isoflurano. Mantenha com 1-1,5% de isoflurano durante a operação a uma taxa de fluxo de 0,4-0,6 L / min.
3. Posicione o mouse na mesa cirúrgica, estabilize sua cabeça, mantenha-o em decúbito dorsal e prenda seus membros com fita adesiva.

2. Indução de HSA

1. Incisar a pele com uma tesoura ao longo do meio da região anterior do pescoço (Figura 1A).
2. Dissecar o tecido conjuntivo e expor a artéria carótida comum esquerda (ACC) e suas bifurcações.
   NOTA: Proteja o nervo vago e as glândulas adjacentes com cautela (Figura 1B).
3. Enrole o CCA com sutura de náilon 6-0 e deixe as duas extremidades livres sem ligadura (Figura 1C).
4. Conecte ambas as extremidades da sutura à fita e puxe suavemente a sutura para baixo e para a direita em um ângulo de 45° em relação ao plano horizontal. Prenda a fita na mesa de operação para bloquear temporariamente o CCA (Figura 1D).
   NOTA: Quando o fluxo sanguíneo dentro do vaso ocluído se torna semelhante a um fio, isso indica uma oclusão bem-sucedida.
5. Ligue a artéria carótida externa (AEC) com uma sutura de náilon (Figura 1E).
   NOTA: O local de cauterização deve estar o mais próximo possível da extremidade superior, com comprimento de aproximadamente 2 mm da bifurcação carotídea.
6. Fundir o ECA distal ao local da ligadura usando uma caneta de eletrocautério (Figura 1F).
7. Puxe o ECA para baixo lentamente até que a artéria carótida interna (ACI) fique exposta. Alinhe o ECA e o ICA em linha reta, garantindo a posição adequada para o próximo procedimento (Figura 1G).
8. Afie a parte superior do filamento. Um ponto de marca no filamento está localizado a 8 mm do topo.
9. Faça uma pequena incisão com tesoura para a inserção do filamento no ECA. Insira o filamento usando uma pinça (Figura 1H).
10. Avance o filamento cuidadosamente com uma pinça até que a marca preta passe completamente pela bifurcação de CCA e ICA. Avance ligeiramente 2 mm para perfurar o vaso sanguíneo (Figura 1I).
    NOTA: Sente-se resistência significativa, o que indica que a bifurcação da artéria cerebral anterior (ACA)-artéria cerebral média (MCA) foi alcançada.
11. Retraia o filamento imediatamente após a perfuração.
12. Funda o ECA usando uma caneta de eletrocautério (Figura 1J).
13. Remova a fita e retire a sutura de náilon do CCA para restaurar o fluxo sanguíneo. Observe a pulsação óbvia do CCA (Figura 1K).
14. Feche a incisão no pescoço com suturas absorvíveis 5-0.

3. Grupo simulado

1. No grupo simulado, realizar a mesma operação cirúrgica, exceto que o filamento é parcialmente avançado na ACI e retirado sem punção¹².

4. Fim do experimento

1. Vinte e quatro horas após a cirurgia, avaliar o desempenho neurológico de acordo com a versão modificada do sistema de pontuação relatado por Sugawara et ^al.11 (do original Garcia et ^al.13). Realize as seis avaliações a seguir de maneira cega: atividade espontânea, movimento de todos os membros, movimento dos membros anteriores, escalada na parede da gaiola de arame, resposta ao toque em ambos os lados do tronco e reação à estimulação de vibrissas. Avalie a função neurológica por meio da tabela de pontuação de comportamento (Tabela 1).
2. Anestesie o camundongo com isoflurano inalado. Coloque o mouse em decúbito dorsal e prenda-o à mesa cirúrgica com fita adesiva, fixando seus membros. Em seguida, use uma tesoura para fazer uma incisão ao longo da linha média do abdômen, cortar a parede abdominal e expor a cavidade torácica. Corte cuidadosamente o esterno para expor o coração.
3. Insira cuidadosamente uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo, certificando-se de que a agulha está estável e não penetra no coração.
4. Comece a perfundir com PBS 1x pré-resfriado (4 ° C) a uma taxa de fluxo apropriada (aproximadamente 10 mL / min) até que o líquido que sai se torne claro e transparente, indicando que o sangue foi totalmente substituído.
5. Quando a perfusão estiver completa, remova a agulha de infusão e interrompa a infusão de fluido. Prossiga com a coleta de tecido cerebral.

5. Manejo pós-operatório

1. Ao fechar a pele, administre uma injeção intramuscular de lornoxicam para aliviar a dor dos camundongos.
2. Durante a cirurgia, aplique pomada ocular de eritromicina em ambos os olhos para melhorar o ressecamento dos olhos.
3. Após a cirurgia, com base na quantidade de perda de sangue durante o processo cirúrgico, injete 0,2-0,4 mL de solução salina no camundongo por via intraperitoneal para reposição de fluidos.
4. Injete penicilina por via intramuscular na dose de 40.000 unidades por dia durante 3 dias consecutivos para prevenir a infecção.
5. Verifique regularmente os animais quanto à respiração espontânea durante as primeiras horas após a cirurgia e monitore duas vezes ao dia para desfechos humanos predefinidos. Eutanasiar os camundongos com CO₂ imediatamente se eles apresentarem problemas respiratórios causados pela cirurgia ou atingirem quaisquer pontos finais, incluindo perda de peso de >20% desde o início, incapacidade sustentada de acessar comida/água ou déficits neurológicos graves.
   NOTA: O animal não é deixado sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e não é devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.

Resultados

Escores neurológicos
Nove camundongos de cada grupo foram avaliados 24 h após a cirurgia usando uma modificação do sistema de pontuação relatado por Sugawara et ^al.11 para avaliar a HAS. A pontuação máxima obtida é 18. Entre eles, n = 9 animais no grupo sham pontuaram 18. No grupo HAS, o escore médio foi de 11 (p < 0,0001) (Figura 2).

Alterações patológicas no cérebro
Coágulos sanguíneos eram visív...

Discussão

Para concluir, este estudo apresenta um modelo murino simplificado e confiável de hemorragia subaracnóidea (HSA) induzida por inserção de filamentos endovasculares, oferecendo uma abordagem conveniente e eficaz. Comparado com o modelo de perfuração endovascular existente, este protocolo é o mesmo na etapa de perfuração: o filamento é introduzido na artéria carótida externa (ECA), avançado através da artéria carótida comum (ACC) e, posteriormente, direcionado para a artéria carótida inter...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57BL/6	Xangai Jiesjie Laboratório Animal Co., LTD
caneta de eletrocautério	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Adequado para uso em pequenas cirurgias superficiais, coagulação de tecidos e cauterização de vegetação.
isoflurância	RWD	R650-IE	Isoflurano é um anestésico geral inalado. Tem um pequeno coeficiente de partição sangue/gás. Quando usado para anestesia animal, pode induzir anestesia suave, rápida e confortável, com uma recuperação rápida, bom relaxamento muscular e nenhum efeito excitatório no sistema nervoso simpático. A taxa metabólica do isoflurano no fígado é baixa, por isso tem pouca toxicidade para o fígado e não há efeitos colaterais óbvios, mesmo com o uso repetido. Para evitar os efeitos adversos dos gases residuais anestésicos no meio ambiente e no pessoal do laboratório, recomenda-se usá-los em conjunto com um sistema de recuperação de gás.
Filamento MACO	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	Usado principalmente para camundongos com peso de 20 a 25 g, a ponta da sutura é derretida em uma forma hemisférica, sem revestimento de polilisina ou silicone, marcada a 9 a 10 mm de distância da ponta, desinfetada e pode ser usada diretamente. Este modelo tem três especificações de embalagem. Recomenda-se realizar um pré-experimento antes do experimento formal para determinar o modelo apropriado.
microscópio	Olympus	BX61VS	Um microscópio vertical totalmente motorizado equipado com o sistema óptico UIS2, projetado para imagens de alta resolução e alta precisão. Os recursos incluem revólver, platina e foco motorizados, bem como recursos de slides virtuais para criar imagens digitais grandes e de alta resolução de espécimes. Adequado para aplicações de pesquisa avançada em patologia, biologia celular, neurociência e ciência dos materiais.
sutura de nylon	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Uma sutura cirúrgica não absorvível feita de materiais biocompatíveis de alta resistência.