Extraindo o módulo de Young de membranas basais pulmonares murinas nativas de mapas de força derivados de microscopia de força atômica

Resumo

Este protocolo visualiza como preparar criossecções de tecido pulmonar murino, realizar experimentos de mapa de força de microscopia de força atômica e analisar os dados para determinar o módulo de Young da membrana basal pulmonar murina nativa.

Resumo

A microscopia de força atômica (AFM) permite a caracterização das propriedades mecânicas de uma amostra com uma resolução espacial de várias dezenas de nanômetros. Como as células de mamíferos sentem e reagem à mecânica de seu microambiente imediato, a caracterização das propriedades biomecânicas de tecidos com alta resolução espacial é crucial para a compreensão de vários processos de desenvolvimento, homeostáticos e patológicos. A membrana basal (MO), uma subestrutura de matriz extracelular (MEC) fina de aproximadamente 100 a 400 nm, desempenha um papel significativo na progressão do tumor e na formação de metástases. Embora a determinação do módulo de Young de uma subestrutura de ECM tão fina seja um desafio, os dados biomecânicos da MO fornecem novos insights fundamentais sobre como a MO afeta o comportamento celular e, além disso, oferecem um valioso potencial diagnóstico. Aqui, apresentamos um protocolo visualizado para avaliar a mecânica da MO no tecido pulmonar murino, que é um dos principais órgãos propensos a metástases. Descrevemos um fluxo de trabalho eficiente para determinar o módulo de Young da MO, que está localizado entre as camadas de células endoteliais e epiteliais no tecido pulmonar. As instruções passo a passo compreendem congelamento de tecido pulmonar murino, criossecção, e registro do mapa de força AFM em seções de tecido. Adicionalmente, nós fornecemos um procedimento semiautomático da análise de dados usando o CANTER que processa a caixa de ferramentas, um software fácil de usar desenvolvido em-casa da análise de dados do AFM. Essa ferramenta permite o carregamento automático de mapas de força registrados, conversão de curvas de força versus piezoextensão em curvas de força versus recuo, cálculo dos módulos de Young e geração de mapas de módulo de Young. Por fim, mostra como determinar e isolar os valores do módulo de Young derivados da MO pulmonar por meio do uso de uma ferramenta de filtragem espacial.

Introdução

Os mapas de força AFM surgiram como uma técnica amplamente utilizada para determinar as propriedades nanomecânicas de uma gama diversificada de amostras biológicas com resolução espacial nanométrica e sensibilidade à força piconewton 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Uma pesquisa pioneira sobre a aplicação de medições de AFM a amostras biológicas sob condições fisiológicas foi conduzida por P. Hansma e colegas 13,14,15,16,17,18,19,20. Posteriormente, as medições de força AFM foram empregadas para avaliar as propriedades mecânicas de moléculas individuais²¹, células vivas e seu citoesqueleto 9,10,22,23,24,25,26, tecidos e seções de tecido 6,8,11,27,28^, 29,30,31, bem como hidrogéis biológicos ^3,4,32. Em nossa pesquisa, usamos o AFM para examinar as propriedades mecânicas das ligações biológicas e químicas 18,33,34,35,36,37 e para medir as características nanomecânicas de células individuais 38,39,40. Além disso, medidas da cartilagem da placa de crescimento⁸ demonstraram que a arquitetura do colágeno e o módulo de Young da matriz extracelular (MEC) direcionam a divisão dos condrócitos e, consequentemente, a direção de crescimento da placa de crescimento murina durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, investigamos as alterações associadas à degeneração da cartilagem e osteoartrite na cartilagem articular 2,41,42,43,44,45,46,47.

Nos últimos anos, numerosas investigações de AFM examinaram as propriedades mecânicas do tecido pulmonar saudável e patológico 48,49,50,51,52. No entanto, essas investigações examinaram principalmente a mecânica geral dos tecidos, não se concentrando em componentes específicos do tecido, como a MO. A MO constitui uma fina camada (100 nm - 400 nm em humanos) de uma estrutura especializada em ECM que reveste a maioria dos órgãos e estruturas teciduais de mamíferos, como neurônios, músculos, tecidos adipocitários e vasos sanguíneos. Descobrimos que as propriedades mecânicas da MO pulmonar murina desempenham um papel fundamental durante a formação da metástase, de forma que uma MO mais suave se correlaciona com uma maior probabilidade de sobrevida em pacientes com câncer de mama e rim⁵³. Além disso, esta investigação revelou que a proteína secretada da matriz extracelular netrina-4 diminui o módulo de Young da MO por meio de uma interação estequiométrica 1:1 com a laminina γ1, um componente-chave presente em quase todas as redes de laminina dentro dos BMs⁴⁰.

Aqui, apresentamos a visualização de nosso protocolo desenvolvido para determinar o módulo de Young (_{E MO)} da MO pulmonar murina fina de 100 a 200 nm. O módulo de Young do BM é uma medida de sua rigidez e é definido como a razão entre a tensão (força por unidade de área) versus a deformação axial resultante (deslocamento) durante uma deformação elástica linear⁵⁴, neste caso, uma pequena compressão do BM pela ponta do AFM de recuo. Em uma experiência do AFM, a força e o deslocamento (profundidade do recuo) podem ser obtidos da deflexão do modilhão do AFM e da posição do modilhão, e o módulo de Young (a tensão-tensão-relação) pode ser extraído da força resultante contra a curva do recuo usando um modelo elástico apropriado, que responda para a geometria da ponta de recuo (neste caso, um modelo alterado⁵⁵ de Hertz). As principais etapas são mostradas na Figura 1. Inicialmente, este protocolo delineia a metodologia para preparar e incorporar amostras de tecido pulmonar murino no composto OCT (ver etapa 1), facilitando assim o procedimento de criossecção subsequente (etapa 2) que permite a determinação da rigidez do BM utilizando mapas de força AFM. A técnica de crioseccionamento aqui apresentada, que utiliza fita adesiva unilateral e dupla face, permite a secção do tecido pulmonar sem a necessidade de fixação e sem descongelamento da secção. O procedimento detalhado do AFM para coletar dados adequados para avaliar a rigidez do BM é descrito na terceira seção do protocolo. Na próxima seção do protocolo, explicamos como os volumes de força gerados podem ser analisados automaticamente (etapa 4.1) usando um software baseado em MATLAB desenvolvido internamente, o CANTER Processing Toolbox⁵⁶. Nesta etapa, o módulo de Young é extraído de cada curva de força-indentação registrada ajustando um modelo de Hertz modificado, que é corrigido para a geometria do penetrador, neste caso, uma pirâmide de quatro lados⁵⁵. Finalmente, descrevemos nas etapas 4.2 e 4.3 como aplicar a Ferramenta de Filtragem Espacial e a Ferramenta de Filtragem R² da caixa de ferramentas desenvolvida para extrair os valores do módulo de Young específicos para a membrana basal (MO) do conjunto abrangente de valores do módulo de Young obtidos no mapa de força contendo todos os compartimentos de tecido da parede alveolar.

Protocolo

Todos os procedimentos para o manuseio de amostras de animais foram aprovados pelo Conselho de Experimentação Animal do Ministério do Meio Ambiente e Alimentação da Dinamarca (número de permissão 2017-15-0201-01265) de acordo com a Lei Dinamarquesa de Bem-Estar Animal. Para demonstrar este protocolo, usamos um camundongo C57BL/6 macho com 13 semanas de idade.

CUIDADO: No protocolo a seguir, várias etapas requerem o manuseio de amostras de tecido. Sempre use luvas adequadas e jaleco de laboratório ao manusear amostras biológicas.

1. Preparação da amostra

1. Coloque um pulmão de rato recém-colhido em um molde de base descartável de 15 x 15 x 5 mm. Utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 0,9 mm, injete cuidadosamente uma proporção de 1:1 (volume-volume) de meio de temperatura de corte ideal (OCT) para solução salina tamponada com fosfato (PBS) na amostra enquanto simultaneamente retrai a agulha. Conduza a injeção à temperatura ambiente enquanto segura a amostra firmemente com uma pequena pinça cirúrgica. A injeção é considerada completa quando a amostra fica inchada e uma quantidade perceptível de exsudação é observada.
2. Encha o OCT puro no molde até que a amostra esteja totalmente imersa. Para garantir o congelamento completo de todo o pulmão, armazenar a amostra a uma temperatura de -80 °C por pelo menos 4 h.
   NOTA: Neste ponto, a amostra pode ser armazenada por pelo menos 2 anos a -80 °C. Com base nas especificações do fabricante para a OCT, o tempo de armazenamento do tecido embutido é superior a 10 anos. Geralmente, é recomendado embrulhar amostras que precisam ser armazenadas por períodos superiores a 4 meses em um filme transparente para evitar que a umidade seja absorvida pela amostra.

2. Crioseccionamento de amostra de pulmão incorporada

1. Regule a temperatura da câmara do criótomo para -17 °C, pois esta é a temperatura de corte ideal para amostras de tecido pulmonar. Defina a temperatura da unidade do estágio de corte para -22 °C, se este recurso estiver disponível. Isso serve para garantir que a temperatura ideal de corte seja mantida na superfície da amostra durante todo o processo de seccionamento.
2. Prepare 40 lâminas de microscópio usando fita adesiva dupla face que é cuidadosamente colocada no meio da lâmina de vidro antes de rolar um tubo de centrífuga de 15 mL sobre a fita para garantir uma adesão firme e sem bolhas. Certifique-se de que o comprimento da fita adesiva dupla face seja aproximadamente equivalente à largura do bloco OCT que contém a amostra. As lâminas de microscópio com borda fosca permitem a rotulagem com um lápis contendo informações da amostra e o número da seção.
3. Insira as lâminas de microscópio preparadas em uma caixa de lâminas. Em seguida, coloque a caixa que contém as lâminas dentro da câmara criotomiana para resfriá-las.
   NOTA: O resfriamento das lâminas evita a ocorrência de um ciclo de congelamento e descongelamento ao pegar as seções, o que comprometeria as propriedades mecânicas da amostra.
4. Prepare várias fitas adesivas de um lado, cada uma medindo aproximadamente o mesmo tamanho do bloco de amostra congelado.
5. Encher os dois anéis interiores do porta-amostras com meio OCT. Posicione a amostra dentro do meio OCT no porta-amostras, certificando-se de que esteja o mais nivelado possível. Em seguida, colocar o porta-amostras durante cerca de 10 minutos na câmara criotomámica até que o meio OCT se solidifique completamente e a amostra esteja firmemente presa ao suporte.
6. Instale o suporte com a amostra na unidade de estágio de corte do criotomo. Ajuste todos os componentes essenciais do criotomo, como a inclinação do estágio de corte e a posição da lâmina, de acordo com o manual do usuário do dispositivo para estabelecer um plano de corte alinhado paralelamente à superfície do bloco OCT.
7. Efectuar o corte inicial da amostra ajustando a espessura de corte para 50 μm e iniciar o corte até atingir o local desejado dentro da amostra (geralmente cerca de 500 μm dentro da amostra pulmonar a partir da sua superfície) para a colheita de lâminas de tecido. Ajustar a espessura de corte do criótomo para 15 μm, que corresponde à espessura desejada das secções de tecido.
   CUIDADO: É crucial ter cuidado ao empregar um instrumento de corte, como um criotomo. Para garantir a segurança pessoal, siga as diretrizes de segurança do fabricante e mantenha os dedos afastados da lâmina.
8. Prenda um pedaço de fita adesiva unilateral à amostra aplicando pressão firme com o polegar. De antemão, certifique-se de que o polegar foi resfriado segurando-o contra a parede da câmara do criótomo por alguns segundos.
   NOTA: A fita deve ser aplicada firmemente à amostra, pois qualquer falta de adesão pode resultar no desprendimento da fita do tecido durante o seccionamento.
9. Produzir uma secção de tecido de 15 μm com o criótomo. Use uma escova para direcionar a seção e evitar que a fita adesiva se solte da amostra durante o procedimento de corte. É essencial para uma superfície lisa da seção de tecido que o ritmo de corte permaneça lento e consistente.
10. A seção criada na etapa anterior agora está plana no bloco da lâmina com a fita voltada para cima. Use uma das lâminas de microscópio resfriadas com a fita dupla-face da caixa de lâminas e pressione-a firmemente na seção para pegá-la. Em seguida, coloque a lâmina do microscópio, agora carregando a seção, de volta na caixa da lâmina.
    NOTA: Ao manusear a lâmina do microscópio e a seção, certifique-se de mantê-los sempre dentro da câmara criotomâmica para evitar que a seção descongele durante o procedimento de corte.
11. Repita as três etapas anteriores até que o número necessário de seções, ou seja, 40, tenha sido reunido.
12. Quando terminar, coloque a tampa na caixa deslizante e transfira-a sobre gelo seco para um freezer a -20 °C. Por fim, limpe o criotomo desinfetando todos os itens usados e acendendo a luz ultravioleta na câmara criotomo.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado neste momento. Armazene as amostras a uma temperatura de -20 °C até que as medições de AFM sejam realizadas. O tempo de armazenamento recomendado para as seções e o meio OCT não deve exceder 6 semanas. Além desse período, as seções e o meio OCT podem exibir alterações semelhantes à queima do congelador como resultado de sua área de superfície substancial e propensão a absorver umidade.

3. Mapas de força AFM de uma seção pulmonar

NOTA: Para este protocolo, o JPK NanoWizard 4XP (AFM) e o estágio motorizado da Bruker combinados com o DMi8 (microscópio óptico invertido) da Leica foram usados para registrar as curvas de força-deslocamento das seções pulmonares.

1. Configurando o AFM
   1. Ligue todos os dispositivos necessários da configuração do AFM (por exemplo, computador, controlador AFM, mesa de isolamento de vibração, microscópio óptico, etc.).
   2. Inicie o software de controle AFM. Na visão geral Escolher experimento , selecione o modo QI Advanced Imaging . Além disso, especifique o local onde os dados do experimento e os arquivos de calibração devem ser armazenados.
      NOTA: Se você não possui a extensão QI Advanced Imaging , utilize o modo de mapeamento de força do modo de contato como uma opção alternativa.
   3. Selecione um cantilever com uma constante de mola adequada para o tipo específico de amostra que está sendo observada. Para as amostras de tecido pulmonar mole, recomenda-se o MLCT Cantilever F da Bruker com ponta piramidal e constante nominal de mola de 0,6 N/m. Se um chip contiver vários cantilevers (como o MLCT), remova os cantilevers mais longos do chip usando uma pinça sob um microscópio estéreo para garantir que apenas o cantilever usado para a medição entre em contato com a amostra.
      NOTA: Outros cantilevers em contato com a amostra além daquele usado para a medição podem levar a um movimento indesejado da amostra durante o experimento ou até mesmo a um desprendimento da amostra da fita subjacente.
      CUIDADO: Evite entrar em contato com o cantilever utilizado para medição com a pinça na etapa atual ou subsequente.
   4. Realize a instalação do chip no suporte do cantilever. Insira o suporte na cabeça do AFM. Posicione a cabeça do AFM na fase da amostra, que é situada no microscópio ótico invertido. Alinhe o caminho da alavanca óptica conforme as instruções do manual do usuário. O alinhamento adequado do caminho da alavanca óptica é obtido quando o feixe de laser é inicialmente colocado na extremidade frontal do balanço de medição e, posteriormente, o feixe de laser refletido atinge o centro do fotodiodo segmentado.
2. Calibração do cantilever usando o método de ruído térmico⁵⁷
   NOTA: A calibração do cantilever inclui a determinação de sua sensibilidade de alavanca óptica invertida (InvOLS) e constante de mola. A calibração individual de cada cantilever usado é necessária porque a constante nominal da mola normalmente fornecida para cantilevers é geralmente apenas uma aproximação aproximada. Em experimentos em que as propriedades mecânicas de uma amostra são determinadas a partir de curvas de força registradas, como a descrita neste protocolo, é essencial determinar diretamente o InvOLS por meio de um método baseado em contato em um substrato rígido. Métodos alternativos que determinam o InvOLS, como derivá-lo da geometria do cantilever, podem fornecer apenas uma aproximação aproximada e não são adequados para o tipo de aplicação descrito aqui. Alternativamente, se forem usados cantilevers onde o fornecedor fornece a constante exata da mola, o InvOLS pode ser determinado por um procedimento descrito por Schiller et al.⁵⁸.
   1. Coloque uma lâmina de microscópio no estágio de amostra do AFM. A lâmina do microscópio serve como substrato rígido para a determinação baseada em contato do InvOLS.
   2. Após ter colocado a cabeça do AFM na fase da amostra, abaixe a cabeça usando os motores deslizantes até que a diferença restante entre o suporte do modilhão e a lâmina do microscópio seja somente aproximadamente 1 - 2 milímetros. Aplique PBS na lateral do suporte cantilever, permitindo que ele flua para baixo e forme um menisco fluido no espaço entre o suporte e a lâmina do microscópio usando uma seringa de 1 mL com uma agulha longa (0.9 mm x 70 mm).
      NOTA: Certifique-se de que o mesmo líquido, como tampão ou meio, que é utilizado para as medições de volume de força da amostra também seja empregado para o processo de calibração.
   3. Para realizar uma calibração baseada em contato no software, navegue até a página Adquirir dados e selecione a opção Exibição avançada . Acesse o Gerenciador de Calibração usando o botão do menu de hambúrguer localizado no canto superior direito. Nessa interface, selecione Baseado em contato como o Método e escolha o cantilever MLCT F no menu suspenso como o nome do cantilever. Além disso, defina o Ponto de ajuste para 1 V e o Número de varreduras para 10 nos campos de entrada correspondentes.
   4. Na página Adquirir dados , no painel de controle esquerdo, insira um ponto de ajuste de 1 V para o procedimento de aproximação automática. Clique no botão Seta Azul para Baixo localizado no canto superior esquerdo da interface do usuário para iniciar a aproximação automática. Quando a aproximação terminar e o cantilever estiver em contato com a lâmina do microscópio, clique no botão Calibrar na janela do Gerenciador de Calibração .
      NOTA: O InvOLS e a constante de mola cantilever são então determinados automaticamente pelo registro de 10 curvas de força, bem como a densidade espectral de potência térmica (PSD), que é usada para determinar a constante de mola com o método de ruído térmico⁵⁷. Após o término do procedimento de calibração automática, verifique visualmente se a curva ajustada descreve corretamente o modo normal (primeiro pico) do PSD registrado do cantilever e se a constante de mola determinada tem a mesma ordem de grandeza que a constante nominal da mola fornecida pelo fabricante do cantilever. Se não for esse o caso, a faixa de ajuste deve ser ajustada manualmente para garantir que o ajuste converge e representa o primeiro pico do espectro de potência térmica.
   5. Após a conclusão da calibração, feche a janela do Gerenciador de calibração . Depois de fechar o Gerenciador de calibração, um arquivo de calibração (arquivo *.tnd ascii) no diretório pré-selecionado (consulte a etapa 3.1.2) é gerado contendo os resultados de calibração determinados, que são posteriormente necessários para a análise de dados. Documente os valores de calibração para referência futura durante o processo de análise de dados, por exemplo, no caderno de laboratório.
      CUIDADO: A partir desta etapa, evite alterar a posição do laser no cantilever, ajustar o espelho na cabeça do AFM ou realocar o suporte do cantilever. A modificação desses elementos afetará o InvOLS e tornará os valores de calibração inválidos. Para compensar a deriva térmica, ajuste a posição do fotodiodo segmentado da cabeça do AFM.
3. Análise de uma parede alveolar em uma seção pulmonar
   1. Recupere a lâmina de amostra para avaliar do freezer. Deixar a amostra descongelar à temperatura ambiente durante cerca de 1 minuto até que todo o meio OCT esteja límpido. Posteriormente, adicione algumas gotículas de PBS à seção de tecido pulmonar para reidratá-la.
   2. Coloque a lâmina do microscópio que contém a seção do tecido pulmonar no estágio de amostra. Instale a cabeça do AFM de volta no estágio de amostra e abaixe a cabeça até que o cantilever seja posicionado aproximadamente 1 mm acima da amostra. Adicione um pouco de PBS adicional na lateral do suporte cantilever usando uma seringa de 1 mL combinada com uma agulha de 0.9 mm x 70 mm até formar um menisco líquido entre a seção de tecido e o suporte cantilever.
   3. Navegue até o Gerenciador de configurações clicando no botão com o ícone de chave inglesa no canto superior direito da interface do usuário. No Gerenciador de configurações, ajuste as seguintes configurações gerais. Na seção Configurações de aproximação , defina a altura alvo para 4 μm. Em seguida, na seção Configurações do modo atual , prossiga para as configurações avançadas de feedback e defina o multiplicador como 1. Por fim, na subseção Configurações de força , que também está localizada na seção Configurações do modo atual , selecione a opção Piezo retraído no menu suspenso Modo no final .
   4. Use o microscópio óptico invertido para identificar e navegar até uma parede alveolar intacta. Uma parede intacta é caracterizada na imagem de campo claro por bordas escuras e lisas. (ver Figura 2A-B).
      NOTA: Importar a imagem do claro-campo no software de controle do AFM, quando disponível, pode ajudar em navegar o modilhão a uma parede alveolar particular e em capturar exatamente um mapa da força ou de QI sobre ele. No software JPK SPM, essa função é chamada de sobreposição direta.
   5. Defina os parâmetros para as curvas de indentação de força no painel de controle esquerdo com base no AFM usado, no cantilever empregado e na amostra observada. Para o NanoWizard 4XP e o MLCT Cantilever F da Bruker, recomendamos os seguintes parâmetros: Setpoint = 5 nN; comprimento z = 8 μm; Velocidade z = 300 μm/s.
      NOTA: O comprimento z recomendado de 8 μm é bastante grande. Isso é atribuído às características do tecido pulmonar. Dado que o tecido pulmonar é tipicamente bastante mole, a profundidade de indentação pode atingir até 4 μm em certos pontos, mesmo com um ponto de ajuste relativamente modesto de 5 nN. Para garantir que a linha de base, onde a ponta não está em contato com a amostra, seja responsável por pelo menos cerca de metade da curva de força-indentação, recomenda-se que o comprimento total da curva seja ajustado para 8 μm. Isso simplificará significativamente a análise da curva posteriormente. Para outros bio-AFMs, esses parâmetros também devem ser aplicáveis, embora a nomenclatura de certos parâmetros, como o ponto de ajuste, que determina a força máxima de indentação, possa variar entre diferentes fabricantes. Se o sistema do AFM é incapaz de conseguir a velocidade vertical alta dada aqui, é necessário diminuir a velocidade de z de acordo com a recomendação de seu fabricante do AFM.
      CUIDADO: Para garantir a comparabilidade dos resultados, é essencial empregar velocidades idênticas de aproximação z em todos os experimentos.
   6. Defina a localização e o tamanho do mapa de força de visão geral inicial, garantindo que ele englobe toda a parede alveolar, estendendo-se de um lado do ar ao outro. Para amostras de tecido pulmonar murino, um tamanho entre 20 μm x 20 μm e 30 μm x 30 μm é geralmente suficiente. Independentemente do tamanho específico do mapa, defina o número de pixels (que correspondem ao número de curvas de força registradas) como 50 x 50. Isso leva à geração de 2.500 curvas de indentação de força para cada mapa, o que fornece a resolução necessária para identificar o BM no canal de inclinação do mapa de força. (ver Figura 2C-D).
   7. Depois de registrar o mapa de visão geral, examine o canal de altura e inclinação do mapa de força. Se o canal de altura indicar que a parede alveolar está intacta (ver Figura 2D) e se for possível distinguir a MC no canal de inclinação como uma linha brilhante claramente definida (ver Figura 2C,E) situada entre duas camadas do epitélio e do endotélio, capturar um mapa de força mais focado com um tamanho de 3 μm x 3 μm ou 4 μm x 4 μm na MO. Mantenha os pixels em 50 x 50 curvas.
      NOTA: Este procedimento leva a uma resolução de mapa mais alta e permite registrar um número maior de valores de módulo de Young, particularmente para o BM (ver Figura 2E-F). Além disso, isso permite uma diferenciação mais precisa entre a MO e os tecidos circundantes, aumentando a precisão do processo de filtragem espacial subsequente. Se os canais do mapa geral mostrarem uma parede colapsada ou rompida, artefatos devido ao cantilever tocar a amostra não apenas com a ponta, ou nenhum BM identificável no canal de talude, navegue para outra parede na seção de tecido até que uma parede com uma avaliação livre de artefatos do BM possa ser identificada.
      Repita os passos anteriores (3.3.6 e 3.3.7) em outras seções da mesma amostra pulmonar até que o número desejado de paredes alveolares tenha sido avaliado. Pelo menos quatro paredes são recomendadas para cada espécime pulmonar para obter resultados robustos⁵⁹.
   8. Quando a medição estiver concluída, limpe todos os equipamentos e materiais que entraram em contato com a amostra e o PBS. Se a amostra não for mais necessária, descarte-a em um recipiente de lixo de vidro autoclavável. Salve todos os dados gravados e desligue o software de controle AFM e o computador. Por fim, desligue todos os dispositivos elétricos utilizados.
      NOTA: Neste ponto, o protocolo pode ser pausado. Os dados experimentais são salvos e podem ser analisados posteriormente.

4. Análise dos dados

1. Análise de curvas de força-indentação
   NOTA: Um manual detalhado do aplicativo Análise de curva de força pode ser encontrado aqui: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
   1. Inicie o CANTER Processing Toolbox⁵⁶ no MATLAB e abra o aplicativo Análise de curva de força .
      NOTA: A caixa de ferramentas pode ser baixada do repositório GitHub seguindo este link: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. O arquivo README.md, que compreende um guia abrangente sobre como instalar o software e iniciá-lo usando o MATLAB, está disponível no repositório GitHub. Mais informações sobre cada aplicativo incluído na Caixa de Ferramentas podem ser encontradas no wiki correspondente em https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki.
   2. Carregue o mapa de força de alta resolução (3 μm x 3 μm ou 4 μm x 4 μm) clicando no botão Selecionar arquivo , navegando até o local onde o mapa de força está salvo, clicando duas vezes nele e, em seguida, clicando no botão Carregar dados na interface do usuário do aplicativo.
   3. Uma janela pop-up é exibida, solicitando os valores de calibração (InvOLS e constante de mola) que foram determinados (consulte a etapa 3.2) para o cantilever usado para registrar o mapa de força selecionado na etapa anterior do protocolo. Insira os valores de calibração nos respectivos campos de edição. Se eles não tiverem sido documentados durante a etapa 3.2.4, consulte o arquivo de calibração gerado automaticamente, que também contém os valores de calibração. Mantenha a opção padrão yes para a questão de saber se a separação entre ponta e amostra deve ser calculada. Em seguida, clique no botão Enviar para prosseguir.
   4. Uma segunda janela pop-up é exibida, permitindo selecionar a geometria do penetrador e a razão de Poisson para a amostra recuada. Para os cantiléveres MLCT usados, selecione Pirâmide de quatro lados como geometria da ponta e insira 17,5° para o meio ângulo em relação à aresta (ambos são os valores padrão). Use o coeficiente de Poisson padrão de 0,5, que representa um material incompressível. Para continuar com o procedimento de carregamento do mapa QI, clique no botão Enviar .
      NOTA: Durante o procedimento de carregamento, as curvas de deflexão-deslocamento registradas (dados brutos do AFM) são convertidas em curvas de força-indentação com base nos valores de calibração fornecidos. Para uma compreensão abrangente das etapas de transformação individuais e das equações associadas, consulte as informações suplementares de Hartmann et ^al.59.
   5. Após a conclusão do processo de carregamento, a curva de força inicial do mapa de força será exibida na tela. Certifique-se de que o modo de correção de linha de base Deslocamento + Inclinação esteja selecionado. Este modo detecta automaticamente a linha de base da curva de indução de força e corrige a inclinação e o deslocamento vertical para zero. Além disso, selecione via modelo Hertz como o algoritmo para o Localizador de Ponto de Contato e use um valor de 20% no campo de edição designado para esta opção. Este algoritmo é particularmente adequado para detectar o ponto de contato em curvas de força-indentação que foram registradas em amostras de tecidos moles. Por fim, defina a profundidade de ajuste no campo de edição correspondente para 1,5 μm.
      NOTA: Para garantir que a rigidez da lâmina do microscópio não afete o módulo de Young resultante, recomenda-se definir a profundidade máxima de ajuste para um valor que não seja superior a 10% da espessura da seção do tecido⁶⁰. Para mais detalhes sobre os algoritmos de correção, consulte as informações suplementares de Hartmann et ^al.59.
      CUIDADO: Use a mesma profundidade de ajuste em todos os experimentos para garantir que os resultados sejam comparáveis.
   6. Para aplicar o ajuste do modelo Hertz modificado a todas as curvas de força-recuo do mapa QI, clique no botão Manter e Aplicar a todos . Uma janela de diálogo é aberta perguntando se cada curva de força deve ou não ser exibida durante a análise. Ao não exibir as curvas, a velocidade de processamento é ligeiramente acelerada.
   7. Após a conclusão da última análise da curva de força, uma janela é exibida, perguntando se os resultados do ajuste devem ser salvos. Para salvar os resultados em ambos. tsv (valores separados por tabulação) e .xlsx (Excel), clique em Sim e insira um nome para os arquivos de resultado. Além disso, é salvo um arquivo de texto com a extensão de arquivo *.meta_data, que contém todos os detalhes sobre a análise das curvas, como os valores de calibração utilizados, modelo de ajuste escolhido, algoritmo de detecção de ponto de contato selecionado, faixa de ajuste e outras informações relevantes.
   8. Feche o aplicativo Análise de curva de força clicando no ícone de cruz no canto superior direito da janela principal.
2. Filtragem espacial dos resultados do mapa QI
   NOTA: A etapa de filtragem espacial garante que apenas os valores do módulo de Young dos mapas QI originados do BM sejam levados em consideração para qualquer análise posterior. Um manual detalhado para a Ferramenta de Filtragem de Resultados pode ser encontrado aqui: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
   1. Selecione a Ferramenta de Filtragem de Resultados na lista de aplicativos na janela de seleção de aplicativos do CANTER Processing Toolbox e inicie o aplicativo clicando no botão Iniciar Aplicativo .
   2. Para carregar os resultados do ajuste, clique em Abrir na barra de menu superior da interface do usuário da Ferramenta de Filtragem de Resultados . Na janela pop-up subsequente, localize o primeiro botão Set situado na guia JPK Maps e escolha o arquivo .tsv que contém os resultados da análise da curva de força (consulte a etapa 4.1.6). Clique no segundo botão Definir e localize o arquivo de mapa QI que corresponde ao arquivo .tsv já selecionado. Em seguida, clique em Enviar para carregar os dados do mapa e forçar os resultados da análise da curva.
   3. Selecione a opção Emodul no menu suspenso superior Canal exibido para exibir os resultados obtidos do módulo de Young como uma imagem de mapa. Além disso, escolha a opção Emodul (se ainda não estiver selecionada) no menu suspenso Canal de dados localizado abaixo do gráfico de histograma para visualizar a distribuição dos valores do módulo de Young carregados do mapa QI.
   4. Clique no botão de seta de fluxo de manipulação , situado no centro da interface do usuário, e certifique-se de que ele aponte para o lado direito. Defina o botão de alternância do filtro de imagem para a posição Ligado no painel de filtro localizado acima dos eixos do histograma. Selecione a opção Mão livre no menu suspenso Filtrar geometria e clique no botão Adicionar .
   5. Na imagem do canal superior, desenhe a máscara de filtro circulando o BM enquanto mantém pressionada a tecla esquerda do mouse. A MO é identificável no mapa do módulo de Young como uma estrutura brilhante (altos valores do módulo de Young) em comparação com o tecido mole vizinho (ver Figura 3A). Quando terminar de desenhar a máscara, solte a tecla esquerda do mouse e clique duas vezes na máscara a ser aplicada ao mapa. O gráfico do histograma à direita agora mostra apenas os valores do módulo de Young para as regiões do mapa que estão destacadas em verde (a cor padrão; veja a Figura 3C-D).
   6. Para criar um novo arquivo de resultado .tsv contendo apenas os valores de módulo de Young mascarados, clique na barra de menu superior da interface do usuário em Salvar > Salvar histograma > Salvar dados. Como alternativa, clique com o botão direito do mouse em uma área vazia dos eixos de plotagem do histograma e selecione Salvar dados no menu de contexto.
   7. Clique em Selecionar tudo na janela pop-up perguntando quais resultados gravar no arquivo .tsv. Em seguida, confirme a seleção clicando no botão OK . Depois, insira um nome para o arquivo .tsv na caixa de diálogo de salvamento, escolha o local de salvamento desejado e, finalmente, clique em OK para salvar os resultados filtrados.
   8. Feche a Ferramenta de Filtragem de Resultados clicando no ícone de cruz no canto superior direito do aplicativo.
3. R² filtragem dos resultados
   NOTA: Esta etapa do protocolo garante que apenas os resultados do módulo de Young sejam considerados onde o modelo Hertz modificado mostrou uma boa concordância com a curva de força-indentação à qual foi ajustado. Um manual detalhado para a ferramenta de filtragem R² pode ser encontrado aqui: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
   1. Inicie a Ferramenta de Filtragem R² selecionando-a na lista de aplicações da janela de seleção de aplicações da Caixa de Ferramentas de Processamento CANTER e clicando em Iniciar Aplicação.
   2. Navegue até a barra de menu superior da interface do usuário e clique em Abrir arquivo .tsv. Na caixa de diálogo de carregamento do arquivo subsequente, localize o arquivo .tsv que contém os resultados do módulo de Young do BM salvo durante a etapa anterior 4.2.5 e selecione-o clicando duas vezes.
   3. Uma caixa de diálogo é exibida apresentando uma lista das colunas de dados contidas no arquivo .tsv. Selecione Emodul como a coluna que contém os dados do módulo de Young. Posteriormente, em uma caixa de diálogo separada da caixa de listagem solicitando os dados R², selecionar rsquare_fit. Uma vez concluído o procedimento de carregamento, os dados do módulo de Young carregados são exibidos na forma de um histograma no canto superior esquerdo da tela, enquanto a distribuição de dados R² é representada no gráfico no canto superior direito.
   4. Insira 0,96 no campo de edição localizado no centro da interface gráfica do usuário. Clique no botão Filtrar Dados para aplicar o filtro R² usando o valor inserido. Essa ação manterá apenas os resultados que têm um valor R² de 0,96 ou superior. As distribuições filtradas dos resultados do módulo de Young e os valores R² correspondentes são exibidos na metade inferior da interface do usuário.
   5. Selecione Salvar dados filtrados na barra de menus superior para criar um novo arquivo .tsv que inclua apenas os resultados que atendam ao critério de filtro R² definido de > 0,96. Os dados salvos agora podem ser exibidos como um histograma, por exemplo, usando a Ferramenta de Plotagem de Histograma, que visualiza a distribuição do módulo de Young para a MO pulmonar sondada (ver Figura 4A).

Resultados

Após a identificação e medição de uma parede alveolar intacta, o resultado primário deste protocolo são os valores filtrados do módulo de Young da MO. É importante notar que não é possível encontrar uma parede alveolar adequada para medição de AFM em todas as seções de tecido. Em nossas observações experimentais, aproximadamente 75% das criossecções derivadas de espécimes de pulmão murino exibiram uma parede alveolar quantificável. Para determinar com precisão a distribuição espacial do módulo de Young em uma MO pulmonar, aconselhamos o emprego de mapas de força abrangendo 3 μm x 3 μm ou 4 μm x 4 μm. Essa abordagem garante resolução suficiente para examinar BMs pulmonares de camundongos, que normalmente medem 100 nm - 200 nm de espessura. Portanto, a abordagem experimental envolve a captura de curvas de força 50 x 50 para cada mapa de força, resultando em um total de 2.500 curvas de força. Dentro do mapa de força, as curvas de força são espaçadas uniformemente. Isso implica que, além do módulo de Young da MO, as estruturas teciduais ao redor da MO são sondadas mesmo nos pequenos mapas de força. Portanto, para determinar com precisão e seletivamente o módulo de Young exclusivamente da MO pulmonar, implementamos um processo de filtragem em duas etapas neste protocolo.

A etapa inicial de filtragem da filtragem espacial operador-dependente seleciona os resultados de ajuste da curva de força originados da MO pulmonar murina, compreendendo aproximadamente 10% a 25% dos valores totais dos resultados contidos no mapa de força analisado. Após essa filtragem espacial inicial, aproximadamente 250 a 625 resultados de ajuste são retidos para análise posterior. A próxima etapa de filtragem garante que apenas os resultados relacionados ao BM originados de curvas de força adequadamente descritas pelo modelo de Hertz modificado sejam incluídos. Portanto, o coeficiente de determinação (R²) do ajuste do modelo Hertz modificado é usado como critério de filtro. Nossa experiência empírica sugere que manter resultados com valores de R² superiores a 0,96 é adequado para resultados de ajuste obtidos pela adesão a esse protocolo. É importante notar que o valor R² é significativamente influenciado pela qualidade (suavidade) e comprimento da linha de base da curva de força, pela determinação do ponto de contato e pela convergência do modelo ajustado. Após a aplicação de ambos os procedimentos de filtragem, aproximadamente 100 a 500 valores do módulo de Young normalmente permanecem para a MO de uma única parede alveolar.

A distribuição desses valores restantes do módulo de Young a partir da MO pode ser visualizada usando um histograma (Figura 4A). É importante notar que os valores do módulo de Young resultantes da MO pulmonar seguem uma distribuição log-normal, que é comumente observada para variáveis aleatórias que só podem atingir valores positivos⁶¹. Isso é visualizado pelo gráfico QQ na Figura 4B. Consequentemente, uma distribuição normal (gaussiana) pode ser ajustada à distribuição dos valores do módulo de Young (E) transformado em log. Aqui, o logaritmo natural (ln) foi usado para transformar os valores de E . A posição de pico da distribuição (μ) e o desvio padrão (σ) foram extraídos desse ajuste e posteriormente retransformados para obter o módulo de Young representativo, denotado como E_BM, usando a seguinte equação:

Observe que, após a retransformação, o intervalo de desvio padrão não é mais simétrico em torno do valor de pico. As arestas negativas (σ_-) e positivas (σ₊) do intervalo de desvio padrão podem ser calculadas usando as seguintes expressões:

Essas equações são uma consequência do fato de que a função exponencial é a função inversa do logaritmo natural⁶².

Após retransformar o valor de pico μ = 9,31 e o desvio padrão σ = 0,18 determinado a partir do histograma na Figura 4A, o valor representativo do módulo de Young é E_BM = 11,05 kPa com um intervalo de desvio padrão de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternativamente, uma distribuição log-normal pode ser ajustada ao histograma dos valores do módulo de Young (E) não transformados para determinar os parâmetros característicos da distribuição.

Recomenda-se que pelo menos quatro paredes por camundongo sejam analisadas para obter um resultado representativo robusto, como mostramos em detalhes em Hartmann et ^al.59. Para determinar o módulo de Young E_BM representativo para um camundongo, os valores transformados em log de todas as quatro paredes foram plotados em um histograma combinado e μ e σ foram determinados ajustando uma distribuição normal. Posteriormente, μ e σ são retransformados conforme descrito anteriormente para recuperar E_BM e o intervalo de desvio padrão para o mouse em questão.

Figura 1: Visão geral das principais etapas do protocolo para determinar o módulo de Young de uma membrana basal pulmonar murina. A etapa inicial envolve a obtenção e preparação de pulmões murinos, seguida de incorporá-los. Assim, o pulmão é injetado com uma combinação de meio OCT e PBS e, em seguida, completamente imerso no composto OCT. Em seguida, cortes de tecido pulmonar de 15 μm de espessura são obtidos por meio de crioseccionamento com criotomo. Neste protocolo, detalhamos o processo de emprego de fitas adesivas de um e dois lados para fixar as amostras no lugar durante o processo de corte. Posteriormente, os valores do módulo de Young do BM são determinados através de medições de mapa de força AFM nas seções de tecido. Após a conclusão do processo de análise da curva de força, a filtragem espacial e R² é aplicada para isolar os resultados do módulo de Young da estrutura de interesse, especificamente o BM (mostrado em verde no mapa de força e quantificado na distribuição do módulo de Young transformada em log). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um experimento exemplar do AFM do mapa da força conduzido em uma seção murina do tecido pulmonar. (A) Imagem da visão geral da microscopia do Brilhante-campo de uma seção murina do tecido pulmonar, permitindo a identificação de paredes alveolares intactas apropriadas situadas entre dois alvéolos. No lado direito da imagem, o cantilever triangular-dado forma F de MLCT do AFM é visível. (B) Vista ampliada de uma parede selecionada dentro da seção de tecido. (C) Inclinação e (D) canal de altura de um mapa geral de 15 x 15 μm contendo curvas de força de 50 x 50 da parede alveolar. No canal de inclinação, o MC pode ser identificado como uma linha brilhante (seta branca), indicando uma estrutura de rigidez aumentada dentro da parede. O canal de altura confirma a integridade da parede, não mostrando evidências de ruptura. Após a identificação do BM no mapa geral de 15 x 15 μm, um mapa menor de 4 x 4 μm (E: canal de inclinação, F: canal de altura) com curvas de força de 50 x 50 é registrado. Barras de escala: (A) 200 μm e (B-D) 25 μm. As escalas das cores das imagens mostradas do AFM são (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (imagem geral) e 2,42 - 8,37 nN/μm (imagem menor), (F) 0 - 3,38 μm (imagem geral) e 0 - 1,99 μm (imagem menor), de escuro a claro. Escalas de cores lineares foram usadas para todas as imagens AFM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visualização do procedimento de filtragem espacial. (A) O mapa do módulo de Young resultante da análise da curva de força, conforme mostrado na Ferramenta de Filtragem de Resultados para permitir a filtragem espacial dos resultados. A MO é identificável como uma faixa brilhante (altos valores do módulo de Young) cercada por compartimentos de tecido mais moles. (B) Histograma dos valores do módulo de Young correspondentes ao mapa não filtrado (A). Após a aplicação (C) da máscara de filtro espacial (área verde), (D) o histograma compreende exclusivamente os valores do módulo de Young da região destacada em verde, que foi identificada como BM. Observe que os valores suaves residuais observáveis no lado esquerdo do histograma podem ser atribuídos a ajustes mal convergentes, que serão eliminados na etapa de filtragem R² subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Distribuição do módulo de Young de uma MO pulmonar murina recebida seguindo este protocolo. (A) Histograma log-normalizado dos valores do módulo de Young da MO resultante (N = 325). Ajustando uma distribuição normal (linha sólida preta), o valor médio μ = 9,31 com um desvio padrão de σ = 0,18 é determinado. Após a retransformação, isso corresponde a um módulo de Young da MO de E_BM = 11,05 kPa com um intervalo de desvio padrão assimétrico de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ Gráfico dos quantis dos valores do módulo de BM Young logaritmizados versus os quantis de uma distribuição normal padrão. Este gráfico demonstra que, com exceção de alguns valores nas caudas esquerda e direita da distribuição, os valores do módulo de Young resultantes são principalmente distribuídos log-normal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

As características mecânicas dos BMs têm recebido considerável interesse devido à sua influência em várias funções celulares, como brotamento tumoral, diferenciação celular, movimento celular e acessibilidade da cromatina 53,63,64,65,66,67,68. Consequentemente, existe uma lacuna não atendida na capacidade de avaliar a mecânica da MO de maneira consistente e mensurável. Este protocolo visa permitir que os usuários do AFM determinem o módulo de Young de BMs pulmonares das amostras saudáveis ou patológicas do pulmão murino obtidas dos ratos selvagens ou geneticamente modificados. A interface gráfica de usuário amigável baseada no aplicativo MATLAB CANTER Processing Toolbox⁵⁶ facilita a análise a jusante dos dados AFM. Espera-se que este protocolo seja útil para outros pesquisadores que conduzem estudos que possam levar a avanços no diagnóstico clínico, gerenciamento ou novas estratégias de tratamento para distúrbios pulmonares.

As etapas críticas do protocolo incluem garantir que, durante a criosecção da amostra pulmonar, as seções de tecido não descongelem em nenhum momento para evitar alterações nas propriedades mecânicas devido aos ciclos de congelamento e descongelamento. Portanto, é essencial usar apenas lâminas de microscópio pré-resfriadas para coletar as seções e manuseá-las apenas dentro da câmara do criotomo. A etapa mais crucial durante o registro de mapas de força em uma parede alveolar é utilizar a imagem de inclinação gerada, que fornece uma visão geral qualitativa da distribuição de rigidez da área sondada, para identificar um local de medição apropriado da MO. A filtragem espacial dos valores do módulo de Young obtidos constitui uma etapa crítica no protocolo e é uma característica fundamental da caixa de ferramentas de processamento CANTER. Esta etapa de filtragem permite ao pesquisador identificar o BM, que está situado entre duas camadas celulares mais macias, por meio de sua pegada mais rígida distinta e extrair os valores correspondentes do módulo de Young do BM para análise posterior.

Este fluxo de trabalho de análise avançada revelou que os camundongos nocaute netrin-4 exibiram um módulo de Young substancialmente (cerca de duas vezes) maior em sua membrana basal pulmonar em comparação com os camundongos da ninhada do tipo selvagem⁵³. Assim, o presente protocolo facilita a análise comparativa de diversas condições ou grupos.

Além do AFM, existem inúmeras metodologias para examinar as propriedades mecânicas dos biomateriais, abrangendo pinças ópticas ou magnéticas 69,70,71 em nível molecular, técnicas de micro-indentação ^72,73 em escala intermediária e testes de compressão confinados ou não confinados^74,75 em nível macroscópico. Especificamente, a miografia de pressão, o teste de tração^76,77 e a reologia⁷⁸ foram empregados para avaliar a rigidez da MO de amostras vasculares e matrizes de MO reconstituídas. No entanto, técnicas como miografia de pressão e teste de tração só podem avaliar as características mecânicas de tecidos completos ou estruturas de tecidos inteiros, como vasos sanguíneos inteiros, que incluem várias camadas de células e elementos estruturais. Como resultado, ao usar esses métodos para avaliar a biomecânica da MO, as propriedades mecânicas da não MO, como os componentes celulares, são sempre sobrepostas aos resultados da MO, dificultando o isolamento das propriedades específicas da própria MO.

Neste protocolo, a característica de interesse (BM) é extraída por meio da filtragem espacial dos resultados do mapa de força. Uma limitação dessa abordagem é o requisito de que a característica de interesse seja discernível e identificável como um padrão distinto nos mapas de módulo de Young obtidos ou em qualquer outro canal de mapa disponível. Por exemplo, a MO no tecido alveolar é identificável apenas devido à sua estrutura interconectada, que exibe um módulo de Young significativamente maior em comparação com as células circundantes. Consequentemente, o BM se manifesta como uma faixa brilhante contínua nos mapas de módulo de Young obtidos. No entanto, outras estruturas biológicas exibem propriedades mecânicas que não são suficientemente distintas daquelas do tecido circundante para permitir a filtragem espacial nos resultados do mapa. Embora o protocolo possa ser combinado com outros métodos para identificar estruturas nos mapas de força registrados, como a coloração por imunofluorescência, essa abordagem pode produzir resultados difíceis de interpretar. Essa complicação pode ocorrer porque os procedimentos de coloração podem alterar as propriedades mecânicas dos tecidos. Consequentemente, qualquer processamento ou coloração do tecido antes das medições de AFM deve ser realizado somente quando nenhum método alternativo estiver disponível para identificar a característica de interesse. Além disso, é importante realizar experimentos de controle apropriados comparando as propriedades biomecânicas de amostras coradas e não coradas.

O protocolo introduz um método para identificar estruturas-alvo com base no contraste do módulo de Young. Consequentemente, pode ser aplicado em tecidos com uma MO anatômica semelhante à do pulmão, incluindo a glândula tireoide, cólon e próstata. (ver Figura de dados estendida em Hartmann et ^al.59). Embora inicialmente desenvolvido para analisar a mecânica do BM, este protocolo e o CANTER Processing Toolbox⁵⁶ são versáteis o suficiente para examinar qualquer região mecanicamente distinta e conectada dentro dos mapas de força do AFM (consulte as instruções em www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). Esta aplicabilidade larga faz esta ferramenta valiosa em todo o campo do AFM e apoia o foco crescente na mecanobiologia na comunidade científica mais larga.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL	B Braun	9166017V	Injekt-F
Seringa de 10 mL	B Braun	4606108V	Injekt Luer Solo
15 mL Falcon tubo	Sarstedt	62.554.002	com tampa de rosca
Cantilever - MLCT	Bruker AFM Probes	3444	AFM cantilever com uma ponta piramidal em forma de lâminas
criotomóides	Leica Biosystems	14035843496	Lâminas descartáveis de baixo perfil DB80LX
Suporte de amostra de criotomo	Leica Biosystems	14047740044	Disco de amostra 30
Cyotome	Leica Biosystems	CM1950	Leica Cryostat
Direct Overlay Extension	Extensão do software Bruker		para o software JPK SPM que permite importar a imagem óptica do microscópio invertido para o Data Viewer do software SPM.
Molde de base descartável	Science Services	SA62534-15	Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
Fita dupla face	tesa Film	56661-00002	Fita de filme fotográfico
Suporte de cantilever de mola fixa	Microscópio
- Leica DMi8	Leica Microsystems
JPK Palco motorizado	Bruker
JPK NanoWizard 4XP BioScience	Bruker
JPK SPM Software	Bruker
K5 CMOS Microscópio Kamera	Leica Microsystems
MATLAB	Mathworks		Versão R2024a ou superior
MATLAB - Caixa de Ferramentas de Ajuste de Curva	Mathworks
MATLAB - Caixa de Ferramentas de Processamento de Imagem	Mathworks
MATLAB - Caixa de Ferramentas de Processamento de Sinais	Mathworks
MATLAB - Caixa de Ferramentas de Estatística e Aprendizado de Máquina	Mathworks
	Carl Roth	H869.1	Lâminas de microscópio simples para calibração de cantilever
Lâminas de microscópio - borda fosca	Carl Roth	H870.1	Lâminas de microscópio com borda fosca para crioseccionamento
Agulha e oslash; 0,9 mm e vezes; 25 mm	B Braun	4657500	OCT injeção  na amostra de pulmão
Agulha ø 0,9 mm e vezes; 70 milímetros	B Braun	4665791	agulha longa para aplicar PBS sob o composto do OCT do AFM
Sakura	Finetek	4583	Tissue-Tek O.C.T.
Fosfato composto protegido solução salina	Bio& Venda	a solução BS.L1825	PBS sem Ca2+, Mg2+, 500 mL
QI Advanced Imaging Extension	Extensão do software Bruker		para o software JPK SPM que fornece para cada pixel de imagem gravada toda a curva de força subjacente.
Bisturi	B Braun	5518083	Tesoura Cirúrgica Descartável para Bisturi
	Kaut-Bullinger	M681700	Tesoura Precisa 13 cm
Fita de face única	tesa Film	57330-00000	fita cristalina, 33 m x 19 mm
Caixa de slides	GWL Storing Systems	K50W	Slidebox para 50 lâminas
Microscópio estéreo - Stemi DR1663	Pinças Zeiss
- Vomm SS-SA-ESD	Eleshop	ELE002121