Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Summary

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Abstract

As culturas de células tridimensionais (3D) fornecem uma representação mais precisa do microambiente in vivo do que as culturas bidimensionais (2D) convencionais, uma vez que promovem interações aprimoradas entre as células e a matriz extracelular. Este estudo teve como objetivo desenvolver uma metodologia eficiente, econômica e reprodutível para gerar estruturas celulares 3D (esferoides/organoides) usando um sistema inovador baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. Um novo selo foi usado para produzir 663 micropoços por poço de uma placa de 6 poços, proporcionando um ambiente ideal para a agregação celular. Células primárias de ilhotas pancreáticas suínas foram semeadas nesses micropoços, onde se agregaram para formar esferóides / organoides. As culturas foram incubadas a 37 °C sob 5% de CO₂, e o meio foi substituído a cada 3 dias. A formação de esferoides foi monitorada periodicamente e amostras foram coletadas para caracterização. O método gerou com sucesso esferoides uniformes e de alta qualidade, reduzindo a variabilidade experimental, minimizando a manipulação e aprimorando as interações celulares. O uso de moldes de micropadrão à base de agarose forneceu um ambiente simplificado e controlado para culturas 3D, oferecendo uma solução padronizada e econômica. Essa metodologia oferece suporte a aplicações para testes de medicamentos e engenharia de tecidos, oferecendo uma plataforma prática e escalável para modelos de cultura de células 3D que podem ser facilmente implementados em vários ambientes de laboratório.

Introduction

Nos últimos 50 anos, inúmeras investigações de biologia celular demonstraram que as culturas bidimensionais (2D) não conseguem replicar com precisão as condições in vivo observadas em modelos animais¹. Estruturalmente, as culturas de células 2D não permitem que as células se organizem tridimensionalmente e repliquem a situação observada em sistemas in vivo . Além disso, as vias de sinalização celular são alteradas em culturas 2D em comparação com culturas tridimensionais (3D), o que provavelmente poderia explicar por que certos tipos de triagem de drogas usando culturas 2D são tão discrepantes². Um avanço significativo nas técnicas de cultura de células surgiu com a introdução de sistemas de cultura 3D. Os sistemas 3D variam consideravelmente em complexidade, dependendo da composição celular e da citoarquitetura. Geralmente, dois tipos de estruturas são gerados, a saber: esferóides e organoides. Os esferoides são descritos como simples aglomerados de células obtidas de tecidos normais ou tumorais, corpos embrióides e linhagens celulares. A formação de estruturas 3D é influenciada por vários fatores, incluindo interações célula-célula e vias de sinalização mediadas por componentes da matriz extracelular (MEC), que fornecem suporte estrutural e pistas bioquímicas. Esses elementos regulam as interações que contribuem para a organização e função do tecido³. O sistema de cultura esferóide foi descrito pela primeira vez no início da década de 1970, usando linhagens celulares de pulmão de hamster chinês V79 como modelo de carcinomas nodulares, crescendo em condições não aderentes e formando esferas perfeitas⁴. Os organoides são descritos como aglomerados de tipos de células específicas de órgãos derivados de células-tronco ou progenitoras, que se auto-organizam por meio de processos, como classificação de células e especificação de linhagem, de maneira espacialmente confinada, espelhando o desenvolvimento in vivo ⁵.

Vários métodos e materiais disponíveis estão disponíveis para cultivar células em condições 3D. Os principais métodos atualmente empregados para gerar culturas 3D são: 1) gotas suspensas; 2) cultura de células rotativas e plásticos de baixa fixação; 3) placas piramidais contendo poços cônicos; 4) andaimes macroporosos; 5) grânulos magnéticos; e 6) hidrogéis livres de andaimes.

Pendurar gotas é o método usado para obter culturas 3D livres de andaimes. Este método apresenta certas limitações, incluindo a necessidade de manuseio extensivo, baixa eficiência de produção, geometria esférica e exposição a altas forças de cisalhamento. Além disso, procedimentos específicos, como substituição de meio ou adição de compostos, podem ser desafiadores e resultar em perda de material. Além disso, relatos da literatura indicam que algumas linhagens celulares não conseguem produzir esferoides compactados ao empregar essa abordagem⁶.

A cultura de células rotativas e os plásticos de baixa fixação são usados para evitar que as células se liguem ao substrato, fazendo com que se agreguem e formem esferoides. Este processo requer frascos específicos e/ou agitação/rotação. Embora esta seja uma das abordagens mais diretas para a produção de esferoides ou organoides em larga escala, ela não é isenta de desvantagens, como a necessidade de equipamentos específicos, baixa longevidade da cultura, variação de tamanho em esferoides, danos mecânicos às células e baixa eficiência⁶.

Placas piramidais contendo poços cônicos são placas disponíveis comercialmente impactando os custos, além do fato de que algumas manipulações podem dificultar a formação de esferoides/organoides⁷.

Andaimes macroporosos também são empregados para cultura 3D; no entanto, um grande obstáculo reside em alcançar uma semeadura celular eficaz e uma distribuição uniforme. Esse problema surge porque os tamanhos dos poros podem ser muito pequenos para a penetração celular ou muito grandes para reter as células com segurança. Para resolver essa questão, várias estratégias têm sido exploradas⁸, que impactam diretamente na complexidade e no custo dessa técnica.

A metodologia de esferas magnéticas gera um pequeno número de esferoides/organoides, tem um custo elevado e pode deixar resíduos de nanopartículas no interior das células⁹.

Entre os sistemas de cultivo de esferoides, estão disponíveis hidrogéis de agarose não adesivos, representando um hidrogel livre de andaimes. Essa abordagem oferece benefícios notáveis, como o controle preciso sobre o tamanho das estruturas 3D e a capacidade de gerar um número substancial dessas estruturas por placa. Nesse método, as células são introduzidas em um hidrogel com poços pré-formados, nos quais afundam e se automontam em esferoides 3D¹⁰.

Neste estudo, apresentamos um dispositivo e metodologia para geração de micropoços de agarose utilizando um molde de micropadrão de forma simples, eficiente, reprodutível e de baixo custo.

A utilização deste selo como molde para geração de micropoços em agarose, auxiliada pela gravidade, visa potencializar a interação celular dentro do micropoço e da organização celular, gerando estruturas 3D (esferoides/organoides) in vitro de forma simples, eficiente, reprodutível e de baixo custo, economizando tempo de pesquisa e recursos laboratoriais.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos de nossa Instituição CEUA-FMUSP: 1699/2021, aprovado em 08 de setembro de 2021 - "Isolamento e Encapsulamento de Ilhotas Pancreáticas Suínas" e faz parte do Projeto Temático do nosso Grupo NUCEL de Terapia Celular e Molecular (www.usp.br/nucel), Processo FAPESP nº 2016/05311-2, intitulado: "Medicina Regenerativa visando a terapia de doenças crônico-degenerativas (câncer e diabetes)".

1. Fabricação do dispositivo de carimbo

NOTA: Este Selo é feito sob medida pelo grupo NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). O dispositivo de carimbo foi desenvolvido usando o software referenciado, amplamente reconhecido por sua precisão e recursos avançados de modelagem tridimensional.

1. Certifique-se de que os protótipos projetados apresentem 663 micropinos dispostos para permitir a geração de um número equivalente de culturas tridimensionais, como esferoides ou organoides. Para garantir a estabilidade do carimbo nas superfícies da bandeja T6, posicione cinco pontos de apoio estrategicamente ao longo da circunferência do dispositivo.
2. Certifique-se de que os micropinos tenham um design cônico com dimensões ajustáveis, variando de 1 a 3 mm de comprimento. O diâmetro da base do cone varia entre 0,7 e 1,5 mm, enquanto o ângulo de conicidade varia de 5° a 10°.
3. Certifique-se de que a estrutura de "parada" do dispositivo, que define a profundidade dos micropinos, tenha um comprimento ajustável de 10 a 19 mm e um diâmetro de 20 a 40 mm, com micropinos uniformemente distribuídos em sua superfície.
4. Além disso, projete o dispositivo para ter uma alça ergonômica, adequada para operação com uma mão, para aumentar a praticidade e a precisão durante o uso.
   NOTA: Para facilitar a produção em larga escala do dispositivo, é fornecido o arquivo digital em formato .stl, sendo essencial para o processo de impressão 3D.
5. Basta cortá-lo usando o software apropriado e imprimi-lo com uma impressora 3D compatível. Use as seguintes dimensões de impressão: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, garantindo um equilíbrio ideal entre funcionalidade e qualidade estrutural.
6. Para a fabricação do dispositivo, use uma impressora 3D fotocurável, que é compatível com a resina polimérica curável por UV que deve ter alta resolução e acabamento superficial uniforme, características essenciais para o desempenho ideal do dispositivo.
7. Corte o modelo digital para impressão usando um software compatível com a impressora 3D selecionada.

2. Preparação de micropoços de agarose

1. Prepare a solução de agarose.
   1. Pese o pó de agarose puro e dissolva-o em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para atingir uma concentração final de 1-2% (p / v).
   2. Aqueça a solução no micro-ondas ou em banho-maria até dissolver totalmente, garantindo que fique homogênea e transparente.
      NOTA: Evite superaquecimento ou reaquecimento excessivo, pois isso pode degradar a agarose. Não prepare grandes volumes de solução-mãe.
   3. Deixe a solução esfriar até ~ 40 ° C, a temperatura ideal para pipetagem.
2. Prepare o carimbo feito sob medida.
   1. Lave o carimbo com uma esponja de cerdas macias e água destilada para remover os resíduos.
   2. Exponha o carimbo limpo à luz UV por 5 a 10 minutos para garantir a esterilidade.
3. Forme os micropoços.
   1. Despeje/pipete ~3 mL da solução de agarose a 40 °C em cada poço de uma placa de 6 poços, garantindo uma profundidade uniforme de 2-3 mm.
   2. Posicione o selo feito sob medida no centro do poço enquanto a agarose ainda está quente.
      NOTA: O carimbo possui apoios laterais que garantem alinhamento e estabilidade, eliminando a necessidade de suporte manual. Cada selo cria ~ 663 micropoços (~ 2 mm de altura) por poço. Certifique-se de que não haja bolhas nos micropinos; Se formarem bolhas, mova suavemente o carimbo para eliminá-las.
   3. Deixe a agarose solidificar por 5-10 min em temperatura ambiente sem mover a placa.
      NOTA: Não perturbe a agarose durante a solidificação para evitar variações na estrutura do micropoço.
   4. Remova o carimbo com movimentos suaves para frente e para trás para liberar o vácuo sem danificar os micropoços.
      NOTA: Este movimento facilita a entrada de ar, permitindo a remoção suave do carimbo sem deformar o gel. Os micropoços devem permanecer intactos.
   5. Lave os micropoços 3x com solução PBS para remover resíduos.
   6. Exponha a placa à luz UV por 10 min para eliminar a contaminação microbiana.
   7. Adicionar 3 ml de meio de cultura e incubar a placa numa incubadora de CO₂ a 37 °C durante a noite.
      NOTA: Esta incubação verifica a ausência de contaminação antes da semeadura celular.

3. Semeadura celular em micropoços

1. Prepare a suspensão celular.
   1. Colete as células por tripsinização ou outro método de dissociação para obter uma suspensão homogênea.
   2. Conte as células e ajuste a concentração de acordo com o número desejado por micropoço.
      NOTA: Para semear 5.000 células por micropoço em 663 micropoços, prepare uma suspensão contendo pelo menos 3.315 × 10⁶ células no total. Otimize a concentração celular para evitar necrose central e garantir a difusão adequada de nutrientes e oxigênio.
2. Semeie as células.
   1. Pipete ~ 3 mL da suspensão de células preparadas sobre os micropoços, garantindo uma distribuição uniforme girando suavemente a placa.
   2. Deixe as células assentarem por gravidade (~ 10-15 min) ou execute centrifugação suave a 100 × g por 5 min.
      NOTA: A centrifugação pode ser usada para garantir que as células se concentrem nos micropoços.
   3. Transferir a placa para uma incubadora de CO₂ a 37 °C com uma atmosfera humidificada.

4. Manutenção de culturas de células 3D

1. Substitua o meio de cultura.
   1. Troque o meio a cada 2-3 dias, removendo 50% do meio antigo e adicionando meio novo.
      NOTA: Certifique-se de que os micropoços permaneçam submersos durante todo o período de cultura para evitar a desidratação.
2. Monitore a formação de culturas 3D.
   1. Continue cultivando até que as estruturas 3D estejam totalmente formadas e compactas (por exemplo, 2-3 dias para culturas primárias de ilhotas pancreáticas).
      NOTA: Para culturas que requerem um tempo de formação mais longo, realize trocas parciais do meio a cada 2-3 dias.

5. Coleta e caracterização de estruturas 3D

1. Colete os esferóides / organoides.
   1. Remova o meio antigo e colete as estruturas 3D por meio de pipetagem vigorosa usando uma ponta de pipeta de diâmetro largo ou cortada para evitar compressão ou desagregação.
      NOTA: A pipetagem vigorosa deve ser controlada para desalojar os agregados sem deformá-los.
2. Prepare-se para a análise.
   1. Use os esferoides/organoides coletados imediatamente ou corrija-os para análise futura.
      NOTA: A associação e estabilidade dos esferoides dependem do tipo de célula, tempo de formação e condições de cultura. Tome cuidado é essencial para evitar a dissociação.

Results

A cultura de células utilizada neste estudo foi derivada de ilhotas pancreáticas suínas. A preparação de ilhotas usada neste estudo tinha uma pureza de 80 ± 5% com base na coloração com ditizona e viabilidade de células de ilhotas de >80% com base na detecção de diacetato de fluoresceína em células vivas ou iodeto de propídio em células mortas (o método fluorescente vivo / morto). Certifique-se de que a preparação das ilhotas pancreáticas suínas seja pelo menos 80% pura (por exemplo, por coloração com ditizona) e >...

Discussion

Embora existam vários protocolos de cultura 3D na literatura, um estudo conduzido por Wassmer et ^al.13 testou várias metodologias para gerar estruturas 3D usando ilhotas pancreáticas. Os autores observaram que ilhotas nativas e esferoides auto-agregados exibiam considerável heterogeneidade em relação ao tamanho e forma e eram maiores do que aqueles obtidos usando outros métodos. Com base em suas descobertas, eles concluíram que os esferóides podem ser gerados usan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microondas 31L	Electrolux	78965840 6699 9 Equipamento	utilizado para aquecer a solução de agarose, facilitando a sua dissolução e garantindo uma maior homogeneidade. Permite que a solução atinja o estado líquido ideal para a formação dos poços.
3D			de resina polimérica curável
por UV - Creality Halot One	Creality	N/A	usada para imprimir o dispositivo de carimbo
Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	Para formar o gel, dissolva 1 a 2% em tampão fosfato salino (PBS) ou meio apropriado.
Autodesk Fusion 360			Modelagem 3D
BB15 CO2 Incubadora	Thermo Fisher	51023121	Equipamento usado para incubar células cultivadas em um ambiente adequado e controlado.
Chitubox	Chitubox	N/A	Software utilizado para fatiar a peça para impressão
Gabinete de Segurança Biológica Classe II	Grupo VECO	N/A	Garante um ambiente estéril para a realização da cultura celular dentro dos parâmetros e protocolos estabelecidos.
Meio de cultura	USBiológico/Ciências da Vida	C5900-03A	Contém aditivos para o cultivo celular adequado.
Placas de cultura (P6)	SARSTEDT	1023221	Usado para moldar a agarose e cultivar as células.
Erlenmeyer Flask (25 mL)	Laborglas	91 216 14	Um recipiente usado para dissolver 1– 2% de agarose em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou outro meio adequado, normalmente aquecido no micro-ondas.
Tubo de Centrífuga de Poliestireno Falcon 15 mL	Corning	352099	Usado para manter as células em suspensão e realizar possíveis diluições.
Soro fetal bovino (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Aditivo para meio de cultura.
Solução PBS (tampão fosfato salino)	Feito em laboratório	N / A	diluído 1x com água ultrapura MiliQ. Utilizado para dissolver agarose de 1 a 2% e para lavar poços já produzidos.
Frasco de reagente com tampa azul - Schott	Laborglas	21801545	Utilizado para preparar e armazenar meio de cultura.
Grupo N	/A	dispositivo de carimbo	- Este link fornece acesso ao arquivo .stl do dispositivo de carimbo. Basta cortá-lo usando o software apropriado e imprimi-lo com uma impressora 3D compatível. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
Frasco de cultura tratado com filtro 25 cm²	Corning	430639	Usado para o cultivo e manutenção de células aderentes.
Tripsina	Merck	07-07-9002	Para dissociação de células antes da semeadura.
Luz ultravioleta (UV)	N / A	N / A	Usado para esterilizar o selo e as placas.