Aqui apresentamos um protocolo básico para a indução do acasalamento de P. blakesleeanus .
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Artigo de método
Cruzamentos sexuais com o mucoromiceto Phycomyces blakesleeanus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Phycomyces blakesleeanus, um fungo filamentoso dentro do filo Mucoromycota, distingue-se por sua notável capacidade de percepção ambiental e respostas adaptativas. Embora trabalhos anteriores tenham mostrado que os estímulos ambientais, incluindo gravidade, luz, umidade e disponibilidade de nutrientes, influenciam sua dinâmica de crescimento e estratégias reprodutivas, os mecanismos subjacentes continuam sendo uma área focal de pesquisa. Sinais ambientais desencadeiam a reprodução sexuada ou assexuada. A reprodução sexuada começa com a sinalização de feromônios, que desencadeia a quimioatração das hifas, levando a transições morfológicas seriais que culminam na formação de um zigosporo.
Em um ambiente de laboratório, cruzamentos de P. blakesleeanus resultam em micélios complementares submetidos ao ciclo sexual em diferentes estágios. Nosso trabalho visa testar se pistas ambientais podem desencadear o acasalamento através dos micélios de P. blakesleeanus. Cruzamentos de P. blakesleeanus cultivados em meios com limitação de nutrientes serão submetidos a ágar com limitação de nutrientes para desencadear uma resposta sexual de acordo com a privação de nutrientes. O desencadeamento bem-sucedido do acasalamento em P. blakesleeanus facilitará estudos futuros que requerem uma grande quantidade de micélios de reprodução sexual em estágios específicos. O resultado desta pesquisa aumentará ainda mais nossa compreensão de como os mecanismos reprodutivos de P. blakesleeanus são influenciados por fatores ambientais, contribuindo para a base de conhecimento mais ampla sobre a reprodução sexuada de fungos filamentosos.
Introdução
A indução do acasalamento em sistemas fúngicos em condições de laboratório avançou na compreensão da genética eucariótica, biologia celular, biologia evolutiva e biotecnologia. Os fungos dikaryan, em particular o Ascomycota, apresentam o conhecimento mais extenso sobre a indução do acasalamento em um ambiente de laboratório1. Curiosamente, o primeiro fungo em que a reprodução sexuada foi proposta, Syzygites megalocarpus, não é membro de Ascomycota, mas sim membro do filo Mucoromycota2. O filo Mucoromycota é um grupo divergente inicial anteriormente classificado como "Zygomycota"....
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Protocolo
1. Preparação de mídia
- Suspenda o ágar fubá em pó (CMA) ou o ágar batata dextrose (PDA) em água deionizada. Para 100% CMA ou PDA, siga as instruções do fabricante e suspenda 17 g de CMA em 1 L de água deionizada ou 39 g de PDA em 1 L de água deionizada. Para N% CMA ou PDA, suspenda 1/N da quantidade recomendada pelo fabricante e suplemente com ágar adicional para atingir uma concentração de ágar de 7,5% (p/v).
NOTA: Etapa opcional: Antes da autoclavagem, adicione 25 μg/mL de cloranfenicol se a contaminação bacteriana for uma preocupação. - Esterilize o meio em autoclave, a 121 °C por 15 min.
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Resultados
Após um cruzamento de 4 vias, cada cepa variou ligeiramente em sua taxa de crescimento, conforme determinado pela mudança na área do micélio (Figura 2). Embora não seja estatisticamente significativo, o NRRL 1555 teve uma mudança mais rápida na área quando plaqueado em 25% CMA, 25% PDA ou 100% PDA. Da mesma forma, NRRL 1465 teve uma mudança maior na área quando cultivado em 50% de PDA ou CMA. NRRL 1464 teve o aumento mais rápido na área quando cultivado em 100% CMA. Após 24 h (1 DPI), as cep.......
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Discussão
Um protocolo simples para induzir a reprodução sexuada em P. blakesleeanus em um ambiente de laboratório é apresentado aqui. Uma das considerações mais críticas para este protocolo é a limitação de nutrientes. Supõe-se que os fungos cooptaram a reprodução sexuada como resposta a condições ambientais adversas, como limitação de nutrientes 6,28,29,30,31,32.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Comitê Executivo de Ciências Naturais do Colorado College, ao Departamento de Biologia e Ecologia do Organismo e ao Hevey Family Fund for Student Research por financiar este trabalho. Também estendemos nossa gratidão a Alice Keller e Tia Hutchens por seu apoio técnico.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar pó | ThermoFisher | 3453PK | |
| cloranfenicol | FisherSci | BP904-100 | |
| Ágar fubá | Carolina | 742460 | |
| Panorama Stitcher | Apple App Store | ||
| Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1555 | Departamento de Agricultura dos Estados Unidos - Serviço de Pesquisa Agrícola | 1555 | USDA-ARS só enviará para pesquisadores acadêmicos; veja abaixo as alternativas |
| Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1564 | Departamento de Agricultura dos Estados Unidos - Serviço de Pesquisa Agrícola | 1564 | USDA-ARS enviará apenas para pesquisadores acadêmicos; veja abaixo as alternativas |
| Phycomyces blakesleeanus (-) Cultura de tubos | Carolina Biological Supply | 156183 | Cultura de nível educacional disponível para compra; NRRL 1555 |
| Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1554 | Departamento de Agricultura dos Estados Unidos - Serviço de Pesquisa Agrícola | 1554 | USDA-ARS só enviará para pesquisadores acadêmicos; veja abaixo as alternativas |
| Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1565 | Departamento de Agricultura dos Estados Unidos - Serviço de Pesquisa Agrícola | 1565 | O USDA-ARS enviará apenas para pesquisadores acadêmicos; veja abaixo as alternativas |
| Phycomyces blakesleeanus (+) Cultura tubular | Carolina | 156182 | Cultura educacional disponível para compra; NRRL 1554 |
| Ágar Batata dextrose | FisherSci | DF0013-17-6 | |
| Sprout Plus Mini Centrífuga | Heathrow Scientific | SKU 120610 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P6585-10ML |
Referências
- NaranjoOrtiz, M. A., Gabaldón, T. Fungal evolution: diversity, taxonomy and phylogeny of the fungi. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2101-2137 (2019).
- Idnurm, A. Sex determination in the firstdescribed sexual fungus. Eukaryot Cell. 10 (11), 1485-1491 (....
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Reimpressões e permissões
