Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.
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Artigo de método
Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imunocoloração dos cérebros de Drosophila melanogaster é essencial para explorar os mecanismos por trás de comportamentos complexos, circuitos neurais e padrões de expressão de proteínas. Os métodos tradicionais geralmente envolvem desafios como realizar dissecção complexa, manter a integridade do tecido e visualizar padrões de expressão específicos durante imagens de alta resolução. Apresentamos um protocolo otimizado que combina criossecção com coloração de fluorescência e imunocoloração. Este método melhora a preservação do tecido e a clareza do sinal e reduz a necessidade de dissecção trabalhosa para imagens cerebrais de Drosophila. O método envolve dissecção rápida, fixação ideal, crioproteção e criossecção, seguida de coloração fluorescente e imunocoloração. O protocolo reduz significativamente os danos aos tecidos, aumenta a penetração de anticorpos e produz imagens nítidas e bem definidas. Demonstramos a eficácia dessa abordagem visualizando populações neurais específicas e proteínas sinápticas com alta fidelidade. Este método versátil permite a análise de vários marcadores de proteína no cérebro adulto em vários planos z e pode ser adaptado para outros tecidos e organismos modelo. O protocolo fornece uma ferramenta confiável e eficiente para pesquisadores que conduzem imuno-histoquímica de alta qualidade em estudos de neurobiologia de Drosophila. A visualização detalhada desse método facilita a análise abrangente da neuroanatomia, patologia e localização de proteínas, tornando-o particularmente valioso para a pesquisa em neurociência.
Introdução
Comportamentos complexos que vão desde interações sociais1, percepção e processamento sensorial2, aprendizagem3 até movimento4 são impulsionados pelo cérebro. Os distúrbios neurológicos também são cada vez mais comuns e devem aumentar com o tempo 5,6. É fundamental estudar como o cérebro funciona tanto na saúde quanto na doença. O dogma central da biologia molecular sugere que uma das funções mais importantes das unidades biológicas são as proteínas7, e tanto quanto e onde elas são expressas são essenciais para entender como o cérebro funciona.
Drosophila melanogaster, comumente conhecida como mosca da fruta, é um modelo altamente valioso para estudar a função cerebral sob envelhecimento e condições fisiopatológicas8. A disponibilidade de ferramentas genéticas avançadas em Drosophila permite que os pesquisadores explorem a função de quase qualquer proteína9, com bibliotecas genéticas abrangentes para quase todos os genes prontamente acessíveis10. Juntamente com sua curta vida útil e alta taxa reprodutiva, essas características tornam a Drosophila um modelo excepcional para a pesquisa do cérebro11. Isso levou a conquistas significativas, incluindo o desenvolvimento de um mapa cerebral completo da mosca12, e até contribuiu para um Prêmio Nobel por elucidar os mecanismos neuronais dos ritmos circadianos e relógios moleculares 13,14,15. Como resultado, a Drosophila continua sendo um sistema poderoso e versátil, impulsionando nossa compreensão da função cerebral e fornecendo insights sem precedentes sobre os processos neurológicos.
A imuno-histoquímica e a imunofluorescência são ferramentas fundamentais para estudar a expressão de proteínas in situ. Em contraste com técnicas como Western Blot, que permite apenas análises semiquantitativas e normalmente é conduzida em tecido a granel16, ou técnicas complicadas e caras como espectrometria de massa para medir o nível de proteína17, a imuno-histoquímica é relativamente direta e permite tanto a quantificação da expressão da proteína quanto a medição da localização de uma proteína dentro de um tecido ou célula. É importante ressaltar que a imuno-histoquímica fluorescente também pode ser multiplexada para medir várias proteínas para identificar tipos específicos de células e tecidos ou responder a várias perguntas no mesmo tecido. Além disso, a fixação do tecido pode permitir comparações entre diferentes condições experimentais, genótipos, idades e pontos de tempo circadianos. No entanto, a imuno-histoquímica fluorescente pode ser desafiadora e muitos fatores podem influenciar a qualidade da imagem. Este protocolo otimizado de criosseccionamento e imunocoloração para cérebros de Drosophila visa aprimorar a imagem de alta resolução, melhorando a preservação do tecido, a penetração de anticorpos e a visualização de populações neurais e marcadores de proteínas. Desenvolvido para enfrentar os desafios dos métodos tradicionais, como dissecção complexa, danos teciduais e resolução de imagem limitada associada a montagens de cérebro inteiro18. Este protocolo combina criossecção com coloração de fluorescência para garantir integridade estrutural e imagens nítidas em vários planos z. Em comparação com as preparações de montagem inteira, esse método minimiza a distorção, facilita a difusão mais profunda de anticorpos e fornece análises neuroanatômicas e de localização de proteínas claras18. Sua versatilidade permite a adaptação para outros tecidos e organismos modelo, oferecendo uma ferramenta confiável e eficiente para pesquisas em neurociência 19,20. Ele pode ser adaptado para observar quase qualquer proteína e aplicado para estudar qualquer condição, doença ou modelo.
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Protocolo
1. Preparação do equipamento
- Certifique-se de que o criostato esteja ligado e ajustado para -20 °C. Ligue o aquecedor de lâminas ou uma pequena incubadora, certificando-se de que esteja ajustado para 37 °C.
NOTA: Nesta fase, as lâminas rotuladas podem ser colocadas no aquecedor ou incubadora e deixadas indefinidamente até o seccionamento.
2. Preparação de soluções
- Prepare 50 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS), pH 7,4, a partir de 10x estoque de PBS. Prepare uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS com um volume final de 10 mL.
- Prepare uma solução de limpeza de etanol a 70% em água em um borrifador. Prepare uma solução de bloqueio (albumina de soro bovino (BSA) a 3% em solução salina tamponada com Tris de estoque 20x). Preparar uma solução primária de anticorpos (a diluição depende da experiência). Aqui, uma diluição de 1:250 de anticorpo de camundongo ApoE em 3% BSA em TBS é usada.
- Preparar uma solução de anticorpos secundários (a diluição depende da experiência). Aqui, é usada uma diluição de 1:500 de Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary em 3% BSA em TBS.
- Prepare a solução de coloração fluorescente (a diluição depende do experimento). Aqui, uma solução de 5 μg / mL de Vermelho do Nilo em PBS é preparada.
NOTA: Todas as soluções, principalmente as fluorescentes, devem ser refrigeradas e armazenadas em um recipiente refrigerado escuro. Eles também devem ser levados à temperatura ambiente imediatamente antes do uso.
3. Coleta de tecido
- Depois de obter moscas em frascos envelhecidos, abra a válvula na esteira de CO2 e despeje as moscas na esteira rapidamente para evitar a fuga. Espere que as moscas fiquem quase inconscientes, interrompendo a maior parte do movimento. A posição voa sob o microscópio SZ61 movendo o tapete sob a lente objetiva. Ajuste a ampliação e o foco de forma que as moscas sejam claramente visíveis e confortáveis para decapitar.
NOTA: As moscas usadas para este exemplo são ELAV/+ e ELAV>ApoE4 - Insira uma tesoura de mola entre o tórax e a cabeça, aperte com firmeza e decapite 5 a 10 cabeças de mosca por grupo experimental. Devolva as moscas não utilizadas ao frasco de envelhecimento.
NOTA: Se houver preocupação com a penetração do fixador, uma pequena incisão pode ser realizada na parte posterior da cabeça para permitir maior penetração do agente fixador na etapa 4.1. - Usando um pincel, coloque suavemente as cabeças em tubos rotulados de 1,5 mL no gelo até que os grupos ELAV/+ e ELAV>ApoE4 tenham sido coletados.
4. Fixação de tecido total
- Remova os tubos do gelo e pipete 100 μL de paraformaldeído a 4% em solução de PBS em cada tubo, garantindo que todos os cabeçotes estejam submersos na solução. Se as cabeças estiverem aderidas às paredes do tubo e evitando o contato com a solução, use uma escova para empurrá-las suavemente para baixo ou bata levemente contra uma superfície horizontal para garantir o contato apropriado.
- Coloque em um agitador orbital usando uma configuração média por 15 min. Após 15 min, descarte a solução de Paraformaldeído e substitua-a por 1x PBS por 10 min, garantindo que todas as cabeças estejam submersas na solução.
- Descartando a solução anterior a cada vez, lave o lenço com PBS 2x por 10 min cada, totalizando 3 lavagens.
- Após a lavagem final, transfira os cabeçotes para uma solução de sacarose a 10% em PBS, garantindo que os cabeçotes estejam submersos dentro do tubo. Deixe-os durante a noite para obter a saturação ideal.
NOTA: Se for desejada uma imagem no mesmo dia, a infusão de sacarose pode ser reduzida; no entanto, os efeitos crioprotetores também serão reduzidos proporcionalmente.
5. Preparação do molde
- Preencha um molde rotulado aproximadamente 50% com composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT), permitindo que ele se espalhe para todos os 4 cantos do molde.
- Usando um pincel, coloque cuidadosamente as cabeças na superfície da OCT dentro do molde. Ao colocar vários grupos experimentais no mesmo molde, certifique-se de que esses grupos estejam separados dentro do molde para evitar confusão.
NOTA: É importante evitar a diluição do composto OCT por contaminação com a solução de sacarose anterior através da escova. Além disso, a colocação profunda na OCT usando o pincel pode criar muitas bolhas ao redor das cabeças. Evite esses erros para evitar problemas de seccionamento mais tarde. - Usando a ponta da pinça, empurre lentamente cada cabeça para a parte inferior do molde com os olhos voltados para o fundo. Essa orientação é selecionada para um corte no plano coronal.
- Evite perfurar ou esmagar as cabeças contra o fundo do molde durante este processo. Alinhe todas as cabeças nas dimensões X, Y e Z para que cada seção contenha todos os assuntos simultaneamente. Garanta uma submersão lenta para reduzir a formação de bolhas de ar.
- Uma vez que todas as cabeças estejam alinhadas corretamente, coloque cuidadosamente os moldes diretamente em -20 °C para congelar.
NOTA: Se o alinhamento das cabeças estiver significativamente errado durante o seccionamento, considere o uso de gelo seco ou nitrogênio líquido para o congelamento inicial do molde. - Quando o molde estiver quase todo congelado, encha o restante com OCT e deixe-o congelar antes de armazenar a longo prazo a - 80 °C.
6. Crioseccionamento de moldes
NOTA: Geralmente, é aconselhável preparar e cortar um molde em branco antes de cortar os moldes experimentais do grupo. Isso permite garantir a funcionalidade adequada da roda, lâmina e vidro anti-rolamento imediatamente antes de seccionar o tecido.
- Prenda a broca do mandril ao molde aplicando uma quantidade generosa de OCT no molde e colocando a broca por cima, pressionando-a plana. Deixe congelar completamente no criostato, geralmente dentro de 5 min.
- Solte a broca e o bloco OCT do molde e coloque-o no mandril, garantindo que o molde permaneça devidamente orientado de cima para baixo. Aperte a chave do mandril até que a broca esteja segura.
- Alinhe o bloco com a lâmina usando os botões de ajuste e os controles de profundidade do mandril.
- Defina a largura da seção para 20 μm. Corte cada fatia usando movimentos lentos, mas consistentes, permitindo que o vidro anti-rolo capture cada fatia. Capture seções usando os slides aquecidos tocando o slide na borda mais próxima da seção e permitindo que a seção suba no slide. Até oito seções podem ser ajustadas em uma corrediça de tamanho padrão (25 mm x 75 mm x 1 mm) quando espaçadas adequadamente.
NOTA: Há uma questão de escolha a ser feita ao escolher quais seções coletar. Como resultado da orientação de incorporação, as seções anteriores serão da anterior e as seções posteriores serão das porções posteriores da cabeça. Como tal, se o interesse estiver em uma área específica mais do que em outra, a seleção de seção pode ser ajustada de acordo. Alternativamente, todas as seções podem ser coletadas em várias lâminas até que não haja mais tecido. - Deixe as lâminas secarem em temperatura ambiente por pelo menos 30 min, mas não mais do que 1 h.
7. Coloração e IHQ
NOTA: Para este protocolo, o método detalhará a IHC usando um anticorpo primário não conjugado. Anticorpos conjugados com fluorocromo ou outras colorações de fluorescência que podem ser realizadas em um único estágio devem ser usados junto com o anticorpo secundário se ambos forem usados juntos.
- Imediatamente após o período de secagem, remova o OCT nas bordas da lâmina usando uma lâmina de barbear, deixando espaço para uma borda hidrofóbica. Desenhe uma borda hidrofóbica em cada slide usando o marcador. Deixe secar por 5 min.
- Lave todas as lâminas 3 vezes por 5 min cada com PBS pipetando suavemente em cima da lâmina, evitando pipetar diretamente em cima do tecido quando possível.
NOTA: A pipeta de 1000 μL é mais útil aqui. Uma lâmina de tamanho padrão com tecido deve ser completamente coberta com 750μL de qualquer solução. Racks e baldes de slides também podem ser usados. - Após a lavagem das lâminas, pipetar BSA a 3% em solução de bloqueio TBS nas lâminas. Deixe incubar por 30 minutos.
- Rejeitar a solução de bloqueio e pipetar a solução de anticorpos primários para as lâminas. Neste caso, uma diluição de 1:250 de SC-13521 ApoE em 3% BSA em TBS. Deixe o anticorpo incubar durante a noite a 4 °C ou por 1 h à temperatura ambiente. Use lenços umedecidos ou toalhas de papel para evitar que a solução seque durante a noite.
- Descarte o anticorpo primário e, usando a pipeta, lave 3 vezes por 5 minutos cada com PBS.
- Adicione a solução de anticorpos secundários. Neste caso, uma diluição de 1:500 de AF 750 Goat Anti-Mouse, além de uma concentração de 5 μg/mL de Vermelho do Nilo, tudo em 3% de BSA em TBS. Deixe incubar por 1 hora em temperatura ambiente.
NOTA: Incubamos simultaneamente uma coloração fluorescente e um anticorpo secundário no mesmo tampão, 3% de BSA em TBS. Isso é preferível, desde que não haja conflitos conhecidos entre os dois reagentes. Se houver conflitos, incube separadamente e faça mais 3 lavagens entre as incubações. - Lave as lâminas 3 vezes com PBS por 5 min cada. Após a lavagem final, deixe uma pequena quantidade de PBS na lâmina.
8. Montagem e preparação para imagem
- Usando uma pipeta de 1000 μL, adicione 3-5 gotas de meio de montagem endurecido contendo DAPI (0,9 μg/ml), uniformemente ao longo da lâmina, evitando queda direta no tecido.
- Coloque a lamínula na lâmina, evitando a formação de bolhas de ar.
NOTA: O uso de pinças pode ajudar nisso, permitindo que a lamínula deslize perto da superfície da lâmina antes de finalmente ser solta. - Manuseie as lâminas recém-montadas com cuidado e guarde-as planas até que estejam completamente secas. Sele as lâminas usando esmalte se houver previsão de armazenamento a longo prazo.
- Capture imagens o mais rápido possível para evitar o decaimento fluorescente.
9. Aquisição de imagem
NOTA: Para captura de imagem, o uso do software Olympus Cell Sense Dimensions será detalhado.
- Antes de fazer a imagem, inspecione as lâminas e limpe-as com etanol a 70% em solução aquosa. Se as lâminas forem fotografadas imediatamente após a montagem, tome cuidado extra ao limpar para evitar perturbar a lamínula. Deixe as superfícies da lâmina e da lamínula secarem por 5 minutos antes de fazer a imagem.
- Selecione cada canal desejado para captura, neste caso, os canais para DAPI, Nile Red e AF 750.
- Selecione a ampliação desejada conforme descrito abaixo. A escolha da ampliação depende do experimento; Aqui, use ampliação de 10x.
NOTA: Todas as ampliações são utilizáveis, incluindo lentes à base de óleo. Se desejar, aplique óleo de imersão na superfície da lâmina. - Para cada canal, calibre os tempos de exposição adequados com base nos assuntos fluorescentes mais brilhantes em um experimento. Evite a superexposição enquanto gera uma imagem o mais brilhante possível.
NOTA: Em geral, os dois principais determinantes da má captura do processo são a superexposição, resultando na perda de definição, e muito sinal de fundo, que é difícil de separar do sinal verdadeiro. Além disso, as exposições devem ser definidas independentemente para cada ampliação exclusiva usada. - Selecione a pasta a ser salva e nomeie as imagens mescladas no menu. Após a captura, todas as imagens estarão localizadas nesta pasta e terão o nome definido aqui.
- Capture imagens focando primeiro em um assunto no canal que permite o melhor ponto focal e, em seguida, comece a coletar. Mantenha o procedimento de focar em cada assunto no mesmo canal para consistência em todo o experimento.
- Capture todos os grupos experimentais usados para comparações posteriores no mesmo dia para evitar o decaimento fluorescente entre os grupos comparados.
- Selecione a ampliação desejada conforme descrito abaixo. A escolha da ampliação depende do experimento; Aqui, use ampliação de 10x.
10. Quantificação
NOTA: A quantificação pode ser realizada usando uma variedade de softwares. Aqui, o uso do Olympus CellSense Dimensions é referenciado.
- Após a coleta, revise as imagens. Remova seções que possuem imperfeições ou artefatos de seção da pasta de quantificação. Selecione imagens que reflitam o objetivo da quantificação. Exemplos de imperfeições são bolhas, seções rasgadas, tecido sobreposto e poeira ou detritos.
- Para selecionar as imagens apropriadas, certifique-se de que todas as imagens com tecido cerebral sejam usadas para quantificação para refletir a expressão geral em todo o cérebro. Como alternativa, use imagens que reflitam apenas o prosencéfalo, o mescentro ou o posterior para fornecer informações sobre as diferenças de expressão nessas áreas.
- Nos menus de contagem e medição, determine os parâmetros de interesse e seus limites para a quantificação das imagens.
- Para quantificação da expressão ApoE por comparação de valor de intensidade média, selecione valores de limite de modo que todos os pixels desse canal sejam considerados (0-infinito). Além disso, contorne as regiões de interesse usando as ferramentas de desenho disponíveis.
- Execute a contagem e a medição em lote para todos os arquivos ou individualmente em cada imagem.
- Para processamento em lote, registre as configurações e a execução da quantificação e selecione a pasta para executar a quantificação. O processamento em lote pode ser acessado por meio da guia do gerenciador de macros e acelera muito o fluxo de trabalho.
- Exporte a tabela de dados para uma planilha para plotagem. Para fazer isso, use o menu de contagem e medição de resultados ao abrir ou exportar para uma tabela automaticamente ao executar em um lote. Essas tabelas de dados conterão todos os parâmetros selecionados escolhidos na etapa 10.2.
- Para análise estatística e plotagem, plote os dados usando uma planilha diretamente ou por meio de outro software. A familiaridade com o software escolhido é fundamental para gerar uma representação precisa dos resultados experimentais. Aqui, os valores absolutos de intensidade da expressão de ApoE no cérebro do mutante foram normalizados para o controle e, em seguida, plotados usando o GraphPad Prism.
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Resultados
O método descrito acima permite a imagem de fluorescência de cérebros de moscas adultas de forma confiável e sem dissecção tediosa. Ilustrado de forma simples na Figura 1, o método é simples e pode ser executado rapidamente se todas as amostras, equipamentos e materiais estiverem prontamente disponíveis. Alternativamente, usando armazenamento de -80 °C durante o estágio de molde OCT, as amostras podem ser mantidas para uso muitas semanas depois. Os pesquisado...
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Discussão
Aqui, apresentamos um protocolo para imagens fluorescentes precisas de cabeças de Drosophila criosseccionadas. Esta é uma abordagem direta que tem vários pontos positivos importantes. Ou seja, os métodos são simples o suficiente para que qualquer pessoa com treinamento básico de segurança laboratorial possa concluir, eles são adaptáveis para medir a expressão de qualquer proteína para a qual existam anticorpos de alta qualidade e permitem a medição precisa de quanto uma proteína...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório Melkani por sua ajuda com feedback valioso para o desenvolvimento do protocolo. Os estoques de moscas, Elav-Gal4 (BL # 458) e UAS-ApoE4 (BL # 76607) foram obtidos do Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, EUA). Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health (NIH) AG065992 e RF1NS133378 ao GCM. Este trabalho também é apoiado pelos fundos UAB Startup 3123226 e 3123227 para a GCM
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipeta 1000 uL | Eppendorf | 3123000063 | |
| 1000 uL Pontas de Pipeta | Olympus Plastics | 23-165R | |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | J62036.K7 | ph=7.4 |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 64-17-5 | |
| 20X Tris Buffered Saline | Thermo Scientific | J60877.K2 | pH=7.4 |
| AF750 Anticorpo Secundário Anti-Rato de Cabra | Alexa Fluor | A21037 | |
| Vidro Anti-Rolo | IMEB | AR-14047742497 | |
| Anticorpo Primário de Rato ApoE | Santa Cruz | SC13521 | |
| Albumina de Soro Bovino Fisher | 9048-46-8 | ||
| Tubos de Centrífuga 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Lâminas Carregadas | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Moldes de Criosseccionamento | Fisher | 2363553 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Lâminas de Criostato | C.L. Sturkey | DT554N50 | |
| Água | |||
| Gelo Seco | ??? | ??? | |
| Pinça Fina | Ferramentas de Ciência Fina | 11254-20 | |
| Fly Pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| Mídia de montagem de endurecimento com Dapi | Vectashield | H-1800 | |
| Kimwipes | Microscópio Kimtech | 34120 | |
| Olympus | SZ61 | ||
| Nile Red | Sigma | N3013 | |
| Composto de Temperatura de Corte Ideal | Fisher | 4585 | |
| Agitador Orbital | OHAUS | SHLD0415DG | |
| Paraformaldeído 20% | Microscopia Eletrônica Ciências | 15713 | |
| Lâminas de Barbear | Gravey | # 40475 | |
| Tesoura de Mola | Ferramentas de Ciência Fina | 15000-10 | |
| Sacarose | Fisher | S5-500 |
Referências
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Reimpressões e permissões
