Este relatório descreve um método para medir o tempo adulto de Drosophila melanogaster para nocautear usando um Drosophila Activity Monitor (DAM2) em resposta a um estressor de calor de condução de ar dentro de uma câmara de incubadora. O DAM2 mede a atividade registrando movimentos individuais de moscas à medida que cruzam um feixe infravermelho. A análise dos dados é facilitada por um novo arquivo executável criado pelos autores.
Artigo de método
Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo da tolerância ao calor em Drosophila melanogaster tem sido de particular interesse para os pesquisadores há décadas, com uma abordagem comum para avaliar a tolerância ao calor sendo monitorar o tempo de nocaute (TKD) após a exposição a uma temperatura elevada. Classicamente, as moscas são alojadas em frascos individuais e colocadas dentro de um banho-maria aquecido. O TKD é então monitorado manualmente pelos pesquisadores. Embora muito bem estabelecidos, permanecem problemas de subjetividade e aplicação consistente de uma definição tangível de cessação de todos os movimentos, incluindo espasmos musculares, ao implementar esses ensaios manuais. Desenvolvemos um método de alto rendimento para automatizar ensaios de tolerância ao calor usando os Monitores de Atividade de Drosophila TriKinetics (DAM2). Para acompanhar o sistema DAM2, escrevemos um programa e criamos um executável fácil de usar para ler automaticamente a última vez de movimento a partir dos dados de atividade gerados. Este script então grava em um arquivo .csv o tempo para paralisia de calor (TKD) para cada mosca. Nossos dados mostram que esse método DAM2 automatizado é consistente e confiável. Enquanto isso, os perfis de atividade criados a partir dos dados de contagem de atividades são de interesse. Esses perfis de atividade podem ser compilados e têm o potencial de expandir os ensaios de tolerância ao calor para incluir os componentes comportamentais relativamente não estudados da tolerância ao calor. Este protocolo descreverá em detalhes como usar o sistema DAM2 e o HoTDAM! para estimar a tolerância ao calor em D. melanogaster.
Introdução
Os ectotérmicos geralmente respondem ao estresse térmico com aumento da atividade locomotora. Esse fenômeno tem sido aparente para os pesquisadores há décadas, com a resposta comportamental característica descrita por Cowles e Bogert em 19441. Eles descreveram como um organismo sob estresse térmico mostrará primeiro um aumento do movimento locomotor. À medida que o estresse térmico aumenta, pequenas explosões de atividade são intercaladas com períodos de inatividade. A temperatura na qual o organismo não pode mais mostrar movimento coordenado é o máximo térmico crítico (CTmax). Seguem-se os espasmos musculares e, por fim, o organismo entra em colapso 1,2. Esse colapso é difícil de definir e representa algo semelhante a "rigor térmico, coma ou morte"2. Aqui usaremos o termo colapso fisiológico para teoricamente nos referirmos a esse ponto final embaçado do estresse térmico.
Drosophila melanogaster e outros pequenos insetos têm sido modelos valiosos para estudar o estresse térmico. Para estimar pelo menos uma parte da complexa coleção de características que constituem a tolerância ao calor, muitos pesquisadores observaram manualmente o tempo e a temperatura em que ocorre o colapso fisiológico, representando o tempo para knockdown (TKD) e CTmax, respectivamente. Embora muito bem estabelecidos, esses métodos de ensaio manual sofrem algumas desvantagens. Uma definição operacional de colapso fisiológico pode ser difícil de estabelecer e aplicar adequadamente a todos os casos, especialmente quando os observadores são menos experientes. Por exemplo, em que ponto o organismo passa de espasmos musculares para o colapso? O padrão de espasmos musculares e atividade convulsiva antes do colapso pode ser imprevisível e pode complicar a observação precisa 2,3, ameaçando a exatidão e a precisão. Enquanto isso, a dificuldade de observação também limita o número de organismos que podem ser testados ao mesmo tempo, limitando a escalabilidade.
Como um aumento na atividade é uma resposta consistente ao calor e o TKD e o CTmax são, em última análise, o ponto em que a atividade cessa, procuramos empregar os monitores de atividade de Drosophila (DAM2) da TriKinetics para automatizar os ensaios de tolerância ao calor. Recentemente, publicamos um método para um ensaio automatizado, juntamente com um software fácil de usar, usando o sistema DAM24. O ensaio foi validado comparando medidas de tolerância ao calor em termos de TKD com um ensaio clássico de TKD baseado em observação manual em vários fatores. Também exploramos o componente de atividade locomotora dos ensaios de TKD para caracterizar ainda mais o fenótipo de termotolerância induzível. Chamamos o ensaio e o software que o acompanha de HoTDAM! (Ensaios de tolerância ao calor usando o Sistema de Monitoramento de Atividade de Drosophila). Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do método automatizado de ensaio de tolerância ao calor usando o sistema DAM2 e o HoTDAM! software. O ensaio é fácil de usar e é facilmente escalável para permitir a medição de muitos organismos ao mesmo tempo.
Neste manuscrito, realizamos ensaios de TKD em moscas mutantes termossensoriais (potencial receptor transitório anquirina 1; TRPA1) e seus controles genéticos (White1118; W1118). Esses organismos foram escolhidos para enfatizar a importância do aumento da atividade característica observada durante o estresse térmico para o ensaio. Ou seja, os organismos TRPA1 não apresentam esse comportamento de fuga, ilustrando a conexão intrínseca entre as respostas comportamentais conservadas e as estimativas de tolerância ao calor, como o TKD. Realizamos o ensaio para fêmeas e machos, juntamente com a implementação de um pré-tratamento de endurecimento térmico. Os resultados representativos apresentados aqui são dados de ensaios totalmente novos do que aqueles usados nos ensaios de validação originais publicados anteriormente.
Protocolo
1. Criação de moscas
- Escolha o estoque/linha de mosca apropriado para a investigação.
NOTA: Para ilustrar o ensaio, usamos o estoque de nocaute TRPA1 do potencial receptor transitório e seu controle genético, o estoque w1118 . - Manter as matérias-primas em condições consistentes, conforme adequado. Para seguir este protocolo, armazenar estoques a 25 ° C sob um ciclo diurno de 12:12 em alimentos padrão (fubá, melaço e levedura de torula).
- Separe machos e fêmeas com anestesia leve.
NOTA: Dependendo do experimento, moscas virgens ou acasaladas podem ser usadas.- Permitir que machos e fêmeas adultos (separadamente para ambos os estoques) acasalem e ovipositem por 5 dias. Limpe os adultos das garrafas.
- Quando os adultos começarem a fechar vários dias depois, limpe as garrafas novamente. Após 2 dias, separe os machos e as fêmeas com anestesia de éter leve e deixe-os amadurecer separadamente a uma densidade de 25 moscas por frasco.
2. Pré-tratamento
- Aplicar o pré-tratamento ou variável independente que definirá os grupos experimentais (genético, ambiental, farmacológico ou outro).
- Para seguir este protocolo, separe os adultos por sexo e, após 5 dias, pré-trate metade dos adultos imergindo um frasco lacrado contendo os organismos em banho-maria a 37 °C por 1 h. Manter os controlos na incubadora a 25 °C. Deixar as moscas recuperarem durante 24 horas após o pré-tratamento, antes do ensaio de tolerância ao calor.
3. Configuração do sistema DAM2
- Carregue as moscas nos tubos do monitor DAM2 e tampe os tubos em ambas as extremidades com algodão. Se as moscas forem avaliadas quanto à tolerância ao calor imediatamente, não use anestesia enquanto carrega os organismos nos tubos do monitor para evitar possíveis efeitos de confusão associados à exposição à anestesia. Em vez disso, aspire moscas individuais dos frascos de retenção para os tubos do monitor.
- Coloque os tubos de ensaio nos monitores de atividade, anotando em quais números de slot os diferentes grupos estão carregados.
NOTA: Estes podem ser randomizados dependendo do experimento se a localização dentro do monitor puder ser considerada uma variável de confusão. - Software de aquisição de dados DAM2
NOTA: O sistema e o software DAM2 são descritos detalhadamente na Folha de Dados do Software DAMSystem3 disponível no site da empresa (consulte a Tabela de Materiais). Consulte as instruções do DAM2 para solução de problemas específica e funcionalidade geral. Aqui, fornecemos orientação para o uso do sistema no contexto de nosso ensaio de tolerância ao calor.- O sistema DAM2 monitora o número de vezes que uma mosca individual dentro de cada tubo quebra um feixe infravermelho. O software de aquisição de dados indexa e redefine essa contagem a cada intervalo de tempo definido. Em preferências, selecione o intervalo de leitura a ser usado no ensaio. Encontramos um intervalo de leitura de 15 s para alcançar um bom equilíbrio entre resolução e erros de leitura.
NOTA: Recomenda-se que o intervalo de leitura não seja menor em segundos do que o número de monitores que estão sendo usados. Um intervalo de leitura mais curto dará melhor resolução temporal ao ensaio, mas também aumentará potencialmente os casos de erros de leitura. O software pode ficar para trás ao tentar indexar as leituras. Além disso, um computador mais novo e mais rápido ajuda muito a evitar erros de leitura. - Ao considerar erros de leitura, certifique-se de que o computador que está sendo usado para executar o software de aquisição de dados DAM2 esteja configurado para nunca dormir ou hibernar para não interromper o ensaio. Além disso, certifique-se de que as atualizações automáticas (incluindo quaisquer atualizações de rede controladas pela instituição) estejam desativadas durante a coleta de dados.
- Verifique se todos os monitores estão conectados e se comunicando com o software. Confirme se o status de cada monitor está verde na guia de dados atual .
NOTA: Consulte a folha de dados do software DAMSystem3 para obter detalhes sobre os problemas a que se referem os diferentes códigos de cores. - O software de aquisição de dados gravará automaticamente as contagens de atividades em arquivos de texto na pasta Dados dentro dos arquivos do sistema. Para facilitar a análise de dados, exclua todos os arquivos de texto dentro desta pasta de dados antes de iniciar o software de aquisição de dados para qualquer ensaio.
NOTA: Os arquivos de texto serão preenchidos automaticamente, portanto, é permitido removê-los desta pasta para limpar os dados antigos sem impedir o programa.
- O sistema DAM2 monitora o número de vezes que uma mosca individual dentro de cada tubo quebra um feixe infravermelho. O software de aquisição de dados indexa e redefine essa contagem a cada intervalo de tempo definido. Em preferências, selecione o intervalo de leitura a ser usado no ensaio. Encontramos um intervalo de leitura de 15 s para alcançar um bom equilíbrio entre resolução e erros de leitura.
4. Ensaio de tolerância ao calor
- Carregue os monitores na incubadora de ensaios.
- Inicie o software de aquisição e deixe o software indexar por um período de tempo definido (por exemplo, 40 índices ou 10 min se o intervalo de leitura for definido como 15 s) antes de aplicar o estresse térmico.
NOTA: Isso permite alguma aclimatação aos tubos e recuperação do movimento dos monitores durante a configuração. Especialmente se a atividade durante o ensaio estiver sendo analisada, esse tempo de aclimatação estabelecerá uma atividade de linha de base antes da indução do estresse térmico. Dependendo da natureza específica do ensaio que está sendo realizado, essa fase de aclimatação pode ser ignorada, com os monitores colocados diretamente na incubadora já na temperatura de tensão. - Se estiver realizando um ensaio estático (TKD), configure a incubadora para rampar o mais rápido possível para a temperatura nociva definida após o período de aclimatação. A variável resposta será operacionalizada como o último tempo de movimento registrado (ou seja, último índice diferente de zero) para estimar o TKD.
- Se estiver realizando um ensaio dinâmico, determine a taxa na qual a temperatura aumentará após o período de aclimatação. Aqui, a variável de resposta medida é tecnicamente o tempo novamente. O tempo em que o último movimento é registrado coincidirá com uma temperatura (CTmax), dependendo da taxa de rampa.
- Monitore as contagens de atividades em tempo real na tela do sistema DAM no software de aquisição ou examine diretamente os arquivos de texto na pasta de dados nos arquivos do programa DAMSystem3. Copie os arquivos de texto e abra a cópia em vez do arquivo original na pasta de dados para evitar problemas com a gravação de dados ao vivo.
- Depois que nenhum movimento for visto em nenhuma das moscas por vários minutos, pare o software de aquisição.
NOTA: Com nossos ensaios, descobrimos que alguns a vários minutos de inatividade são indicativos de colapso fisiológico devido ao estresse térmico semelhante ao observado nos ensaios manuais clássicos de TKD. Isso depende, no entanto, do comportamento de fuga espontânea. Como tal, considere possíveis variáveis de confusão se o tratamento específico na investigação puder alterar essa resposta comportamental. Além disso, dependendo dos parâmetros específicos do ensaio (por exemplo, temperatura, tratamento), a duração do ensaio obviamente variará.
5. Organização e análise dos dados
OBSERVAÇÃO: consulte o Vídeo Suplementar S1 para obter um passo a passo de como baixar o aplicativo executável do GitHub, bem como a funcionalidade básica do software.
- Depois que os dados forem adquiridos, verifique os arquivos de texto em busca de erros usando o software referenciado (consulte a Tabela de materiais) e selecione pontos de início e parada específicos para os dados da atividade de compartimentalização. Se um intervalo de aclimatação de 10 minutos foi implementado, inicie o binning 10 minutos na gravação da atividade. Consulte a discussão para obter mais detalhes sobre o binning.
- Abra o HoTDAM! software de análise e importe os arquivos de dados do monitor digitalizados clicando em Arquivo | carregar dados do monitor.
NOTA: O software e o aplicativo executável estão disponíveis no GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) ou no site da empresa na seção Software de análise . Observe que o aplicativo executável é compatível apenas com sistemas operacionais Windows no momento. - Adicione designações de grupo para indicar quais grupos de tratamento correspondem a qual célula dentro dos monitores DAM2.
NOTA: O layout da interface do software corresponde ao layout dos monitores. - Clique em Iniciar definição de vários grupos para abrir uma caixa de diálogo para adicionar uma designação de grupo que será aplicada a várias células. Assim que a designação do grupo for aceita, clique nas células para aplicar a designação do grupo e, em seguida, clique em Parar designação de vários grupos.
NOTA: O software organiza e exporta dados DAMSystem3 para .csv arquivos a serem analisados no software de estatística. - Exporte o TKD (ou seja, o último índice diferente de zero) para cada mosca dentro dos monitores para um arquivo .csv clicando em Arquivo | Exportar dados de knockdown | Exportar todos os monitores ou Exportar monitores selecionados. O TKD para cada mosca será organizado na saída por designação de grupo.
- Exporte os dados de atividade para cada mosca clicando em Arquivo | Exportar dados de atividade | Exporte todos os monitores ou exporte monitores selecionados para um arquivo .csv, mantendo apenas os dados de carimbo de data/hora e contagem, facilitando o trabalho com o arquivo de dados, ao mesmo tempo em que atribui rótulos de grupo designados para cada mosca.
NOTA: As primeiras colunas nos arquivos de dados DAMSystem3 correspondem aos dados internos dos monitores (por exemplo, monitoramento de luz ou mensagens de erro) durante a aquisição. Os dados de contagem estão nas colunas 11-42 (consulte a Folha de Dados DamSystem3 para obter detalhes). Exportar os dados da atividade com o software de análise removerá todas as colunas, exceto as colunas de carimbo de data/hora e dados de contagem. - Se estiver realizando um experimento CTmax, use o TKD para determinar o CTmax usando a taxa de rampa de temperatura.
NOTA: O software de análise foi escrito de forma orientada a objetos em C# (código-fonte disponível no GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) de modo que aspectos do programa podem ser facilmente modificados para permitir a personalização para atender a propósitos específicos.
6. Estatísticas
NOTA: Muitos testes diferentes podem ser usados para analisar os dados TKD, dependendo das especificidades da configuração experimental.
- Use a análise de sobrevivência (por exemplo, regressão de Cox, Kaplan-Meier) para conceituar o knockdown como um evento que cada mosca dentro do ensaio experimentará.
NOTA: Para uma revisão detalhada, consulte a série de 4 artigos de Bradburn e Clark discutindo a análise de sobrevivência e sua implementação 5,6,7,8. - Use a ANOVA para avaliar as diferenças de grupo e comparar modalidades, especialmente ao validar o ensaio automatizado para condições específicas.
- Analise os dados de TKD usando a análise de sobrevida de Kaplan-Meier. Divida o arquivo por estoque de forma que a análise seja realizada separadamente (por exemplo, para linhas de estoque TRPA1 e w1118). Escolha a variável tempo como TKD (em min), knockdown como o evento, pré-tratamento como fator e sexo como estratos.
- Realize os testes log-rank, Breslow e Tarone-Ware para comparar o pré-tratamento para cada estrato (ou seja, sexo), para fins ilustrativos, mostrando vários métodos.
- Construa parcelas de sobrevivência.
Resultados
As análises para os estoques TRPA1 e w1118 foram realizadas separadamente. Os tempos percentuais de TKD e outros descritivos podem ser encontrados na Tabela 1.
| Percentisa | ||||||||
| Sexo | Tratamento | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | Estimar | Erro padrão | Estimar | Erro padrão | Estimar | Erro padrão | ||
| W1118 | ||||||||
| Fêmea | Controle | 16 | 42.50 | 0.43 | 40.75 | 2.00 | 38.75 | 0.43 |
| Endurecido | 16 | 48.75 | 4.55 | 43.25 | 2.50 | 38.50 | 1.95 | |
| Macho | Controle | 16 | 43.25 | 1.88 | 39.75 | 0.25 | 37.00 | 2.38 |
| Endurecido | 16 | 46.50 | 5.63 | 35.50 | 2.00 | 30.75 | 3.03 | |
| TRPA1 | ||||||||
| Fêmea | Controle | 16 | 34.25 | 2.17 | 29.25 | 7.50 | 21.50 | 0.72 |
| Endurecido | 15 | 37.25 | 4.84 | 28.75 | 1.77 | 25.75 | 0.86 | |
| Macho | Controle | 15 | 38.25 | 3.29 | 32.00 | 1.29 | 24.50 | 7.92 |
| Endurecido | 16 | 27.50 | 0.72 | 25.75 | 1.00 | 22.75 | 6.06 | |
Tabela 1: Estatísticas descritivas para análises de sobrevivência de Kaplan-Meier de moscas w1118 e TRPA1. Os valores do percentil TKD são dados em minutos. Endurecido refere-se ao pré-tratamento a 37 °C seguido de 24 horas de recuperação antes do choque térmico a 39 °C. Os controles foram mantidos a 25 °C durante o pré-tratamento. NOTA: Nas análises de sobrevivência, o percentil 75 é o último momento em que 75% da amostra continua a exibir atividade.
Para as moscas w1118, o teste log-rank encontrou uma diferença significativa na probabilidade de knockdown entre fêmeas endurecidas e controle (p = 0,026), de modo que as fêmeas endurecidas tiveram uma menor probabilidade de serem derrubadas pelo estressor de calor ao longo do ensaio. Enquanto isso, o teste de log-rank não encontrou diferença significativa na probabilidade de knockdown entre machos endurecidos e controle w1118 (p = 0,798). Para as fêmeas TRPA1 , não foi encontrada diferença significativa na probabilidade de knockdown entre organismos endurecidos e controle (p = 0,547) usando o teste de log rank. Finalmente, para os machos TRPA1 , o teste de log-rank encontrou uma diferença significativa na probabilidade de knockdown entre organismos endurecidos e controle (p = 0,014), de modo que os organismos de controle tiveram uma menor probabilidade de serem derrubados pelo estressor de calor. Ver Tabela 2 para todos os resultados das análises de sobrevivência (incluindo testes generalizados de Wilcoxon e Tarone-Ware) e Figura 1 para curvas de sobrevivência.
| Sexo | χ2 | Df | Valor de p | |
| W1118 | ||||
| Fêmea | Classificação de log (Mantel-Cox) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| Breslow (Wilcoxon generalizado) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| Tarone-Ware | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| Macho | Classificação de log (Mantel-Cox) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| Breslow (Wilcoxon generalizado) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| Tarone-Ware | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| TRPA1 | ||||
| Fêmea | Classificação de log (Mantel-Cox) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| Breslow (Wilcoxon generalizado) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| Tarone-Ware | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| Macho | Classificação de log (Mantel-Cox) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| Breslow (Wilcoxon generalizado) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| Tarone-Ware | 5.20 | 1 | 0.023 |
Tabela 2: Teste de significância comparando a probabilidade de permanecer ativo entre moscas fêmeas e machos pré-tratadas e controle w1118 e TRPA1 . Endurecido refere-se ao pré-tratamento a 37 °C seguido de recuperação de 24 horas antes do choque térmico a 39 °C. Os organismos de controle foram mantidos a 25 °C durante o pré-tratamento.
Figura 1: Curvas de sobrevivência representando a proporção de organismos com atividade remanescente ao longo do ensaio TKD para moscas w1118 e TRPA1 . Endurecido refere-se ao pré-tratamento a 37 °C seguido de recuperação de 24 horas antes do choque térmico a 39 °C. Os organismos de controle foram mantidos a 25 °C durante o pré-tratamento. O TKD está em minutos desde a introdução do estressor de calor de 39 °C. Abreviaturas: TKD = tempo para o knockdown; TRPA1 = anquirina 1 potencial receptor transitório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A atividade média plotada em relação ao tempo pode ser vista na Figura 2 para machos e fêmeas endurecidos e controle TRPA1 e w1118.
Figura 2: Atividade média versus tempo para w1118 e TRPA1 voa durante o ensaio TKD. Abreviaturas: TKD = tempo para o knockdown; TRPA1 = anquirina 1 potencial receptor transitório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Provavelmente, existem inúmeras e novas maneiras de analisar os dados da atividade, especialmente ao considerar os efeitos de grupo e incorporar a DRT. Como a análise da atividade durante a tolerância ao calor é relativamente pouco estudada, não exploramos abordagens estatísticas potencialmente novas para analisar os dados da atividade. Esses testes estatísticos justificariam uma revisão e discussão da literatura muito mais extensa do que é apropriado aqui. Em vez disso, simplesmente representamos graficamente a atividade média para cada grupo (pré-tratamento ou controle) em relação ao tempo, porque publicamos anteriormente esse método para ilustrar a atividade com uma revisão apropriada da literatura.
Vídeo Suplementar S1: Passo a passo para baixar o aplicativo executável do GitHub e a funcionalidade básica do software. A versão mais recente (compatível apenas com Windows no momento) pode ser encontrada no GitHub referenciado (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) ou por meio de um link indexado na seção Software de Análise do site da empresa. Assim que a versão for baixada, os arquivos precisarão ser extraídos e o HoTDAM! aplicativo pode ser aberto. O software antivírus pode impedir a execução do aplicativo; Pode ser necessário conceder permissões ao aplicativo. Uma vez que a interface esteja em execução, o DAM2 (File Scan Software) digitalizado pode ser carregado (File | Carregar dados do monitor). A interface de designação de grupo representa o layout do monitor de atividade e permite que o usuário designe grupos de tratamento para tubos individualmente, um de cada vez, ou vários de uma só vez, com o recurso de definição de grupo de seleção múltipla . Todos os monitores são mutuamente exclusivos no que diz respeito à funcionalidade de designação de grupo e devem ser definidos separadamente. Os dados TKD e de atividade podem ser exportados para arquivos .csv (Arquivo | Exportar dados ou arquivo de knockdown | Exportar dados de atividade) para um monitor selecionado individualmente ou todos os monitores de uma só vez. Se todos os monitores forem exportados de uma só vez, o TKD ou os dados de atividade serão exportados para um único arquivo .csv, mas os dados de cada monitor serão separados dentro do arquivo. Os arquivos TKD exportados agruparão as moscas em grupos exibindo o último índice de atividade diferente de zero para cada tubo. Os arquivos de atividade manterão todos os tubos separados, mas associarão designações de grupo e removerão todas as informações dos arquivos, exceto os dados de registro de data e hora e contagem de cada tubo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O método de ensaio de tolerância ao calor que descrevemos aqui é versátil e escalável. Publicamos anteriormente um estudo de validação onde comparamos o HoTDAM! método para um ensaio TKD clássico baseado em observação e descobriu que o ensaio automatizado mostrou a mesma tendência geral em vários fatores4 (Figura 3). Em outras palavras, da mesma forma que o ensaio TKD manual clássico, o ensaio automatizado DAM2 foi capaz de diferenciar organismos por sexo, temperatura do ensaio, pré-tratamento de endurecimento e tempo de recuperação após o pré-tratamento de endurecimento antes do ensaio. Embora se presuma que o ensaio automatizado seja mais objetivo, pois o TKD não depende da observação do pesquisador, nossos dados não sugerem que isso torne o ensaio DAM2 consideravelmente superior ao ensaio manual em termos de descoberta de um efeito. Descobrimos que os ensaios são bastante semelhantes em termos de precisão e, no mínimo, os tamanhos de efeito dentro do ensaio automatizado são ligeiramente menores (consulte o material suplementar de Rokusek et al.4 para obter dados estatísticos descritivos detalhados e ANOVA para o DAM2 automatizado e os ensaios baseados em observação manual de nossos estudos de validação). A razão para isso provavelmente tem a ver com a diferença inerente no que os ensaios estão medindo em termos de TKD, que é discutida em detalhes abaixo.
Figura 3: Comparação do ensaio DAM2 automatizado com um ensaio TKD clássico baseado em observação. Os gráficos mostram o TKD médio em minutos e as barras de erro são o erro padrão da média. Os fatores independentes comparados são (A) sexo por temperatura de ensaio, (B) endurecimento por temperatura de ensaio, (C) sexo por tempo de recuperação, (D) endurecimento por sexo, (E) temperatura de ensaio por tempo de recuperação e (F) endurecimento por tempo de recuperação. A TKD absoluta tende a ser mais longa no ensaio automatizado, mas as tendências gerais entre os fatores são consistentes entre os ensaios. Essa figura foi retirada de Rokusek et al. 4. Abreviação: TKD = tempo para derrubar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os dados ilustrativos apresentados aqui representam experimentos totalmente separados de nossos testes de verificação originais, que também usaram diferentes linhas de mosca. O ensaio (TKD e atividade) foi sensível aos efeitos do pré-tratamento de endurecimento no estoque w1118 (usamos uma cepa do tipo selvagem Canton S nos experimentos originais), fornecendo suporte de que a funcionalidade básica do ensaio é estável sob condições variáveis, embora apenas algumas linhas tenham sido testadas até agora. O ensaio é versátil, pois não se limita à medição de TKD. Como o TKD em nosso ensaio é definido como a cessação da atividade locomotora, o CTmax pode ser determinado se a taxa de aumento de temperatura for conhecida. Finalmente, o ensaio é totalmente automatizado e pode ser facilmente ampliado adicionando mais monitores de atividade, permitindo tamanhos de amostragem muito maiores do que seria viável usando um método de observação manual.
Alguns pontos-chave a serem considerados ao realizar o ensaio e a análise são os seguintes. Use uma incubadora que possa atingir rapidamente uma temperatura definida, de modo que os monitores possam ser carregados na incubadora na temperatura de criação e deixados em silêncio para se aclimatar ao novo ambiente antes de aplicar o estressor de calor. Se a temperatura aumentar muito lentamente, o ensaio começa a se parecer mais com um ensaio CTmax dinâmico em oposição a um ensaio TKD estático. Por exemplo, se o software foi autorizado a indexar 40x antes da indução do estresse térmico para estabelecer uma linha de base, o software pode gerar o arquivo de dados começando no índice 40 para determinação de TKD e análise de dados. O ponto de partida é em termos do carimbo de data/hora registrado pelo software, portanto, esteja ciente do intervalo de índice (por exemplo, 40 índices são 10 minutos se o intervalo de índice for 15 s).
O software de verificação de arquivos também pode ser usado para "agrupar" índices e pode somar ou calcular a média das contagens. Por exemplo, quando representamos graficamente os dados de atividade (veja abaixo), agrupamos cada quatro índices somando contagens (ou seja, exportamos a atividade a cada minuto em vez de a cada 15 s). Observe que o software de verificação de arquivos não permitirá horários de início de minutos parciais durante o binning, em termos de carimbo de data/hora. Por exemplo, se o primeiro índice foi em 12:10:15, com intervalo de índice definido como 15 s, a compartimentalização em 1 min começará no próximo minuto mais próximo (por exemplo, 12:11:00). Como tal, se a atividade em incrementos de minutos for usada para análise, mas a resolução de intervalos de 15 s para TKD for desejada, inicie o software de aquisição dentro de 15 s do minuto inteiro mais próximo (por exemplo, em algum momento após 12:09:45 e antes de 12:10:00). Essa complicação se deve ao fato de que o software de aquisição de dados usa o relógio do sistema de computador como carimbo de data/hora, já que o DAMSystem3 provavelmente foi construído com estudos do sono em mente.
Em termos de abordagens estatísticas para comparação de TKD, argumentamos que a análise de sobrevida oferece mais informações do que simplesmente comparar os tempos médios ou medianos de knockdown entre os grupos. As curvas de sobrevivência podem oferecer uma visão visual do curso do tempo de knockdown para as populações durante o ensaio. Da mesma forma, os testes estatísticos podem ser adaptados à pergunta específica feita no estudo. Por exemplo, os testes generalizados de Wilcoxon colocam mais peso nos eventos iniciais, enquanto os testes de log-rank dão peso igual a todos os pontos de tempo e são mais sensíveis às diferenças nos pontos de tempo posteriores. Se as taxas de risco não forem proporcionais (ou seja, as curvas de sobrevivência se cruzam), Tarone-Ware é mais rigoroso. Uma vez que não deve haver censura de dados, pois todos os organismos terão experimentado o evento (knockdown), pode-se argumentar para o uso de testes não paramétricos de ordenação de classificação, como Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis, juntamente com as curvas de sobrevivência de Kapan-Meier9. Se uma investigação estiver interessada em knockdown após um período de tempo definido, em vez de TKD após todos os organismos terem sido derrubados, o uso da análise de sobrevivência e os testes de log-rank ou Wilcoxon generalizado seriam robustos para dados censurados (ou seja, um cenário em que nem todos os organismos teriam parado de se mover ou entrado em colapso até o final do ensaio). Fornecemos os resultados de log-rank, Wilcoxon generalizado e Tarone-Ware na Tabela 2 para ilustrar.
Durante o estresse térmico e antes do CTmax, alterações comportamentais (por exemplo, comportamento de fuga) servem como mecanismos de enfrentamento. Essas estratégias comportamentais inatas são conservadas em todo o reino animal, mas são especialmente importantes para os ectotérmicos, dada sua menor capacidade de termorregulação metabólica10,11. Claramente, o comportamento é um aspecto importante do fenótipo de estresse térmico ectotérmico, mas pesquisas relativamente esparsas examinaram esses aspectos comportamentais da tolerância ao calor. Dado que o ensaio que descrevemos se baseia no aumento característico da atividade locomotora em resposta ao estresse térmico, é adequado para explorar os aspectos locomotores das respostas ao estresse térmico. Ao mesmo tempo, essa dependência da atividade espontânea traz consigo algumas limitações. É importante lembrar, especialmente ao explorar os componentes das respostas locomotoras ao estresse térmico, que tanto o TKD quanto a atividade estão intrinsecamente relacionados. Para demonstrar uma situação em que isso seria limitante para nosso ensaio, fornecemos dados aqui de organismos TRPA1 que são deficientes em termossensação. Quando os organismos são deficientes para o receptor TRPA1, as moscas não exibem a resposta locomotora característica ao calor12. Nos dados representativos mostrados aqui, a resposta de atividade nos organismos TRPA1 é embotada. As medições de TKD não seriam facilmente comparáveis a organismos do tipo selvagem, uma vez que a medida representa uma resposta locomotora diferente.
A generalização e a comparação direta dos resultados, especialmente com os ensaios clássicos de tolerância ao calor, também são uma limitação potencial (Figura 3). Freqüentemente, os ensaios baseados em observação envolvem um estímulo mecânico ou outro estímulo para garantir que um organismo imóvel esteja realmente experimentando um colapso fisiológico e não simplesmente mostrando uma falta de atividade espontânea 3,13. Como nosso ensaio depende de atividade espontânea, há uma diferença inerente na definição operacional de TKD que pode complicar a comparação. Em outras palavras, definimos a DRT como a cessação da atividade locomotora, enquanto os ensaios clássicos geralmente definem a DRT como colapso fisiológico. Além disso, ensaios automatizados como o que descrevemos dependem de ar aquecido, enquanto os ensaios manuais geralmente envolvem um banho-maria e, portanto, uma transferência de calor mais eficiente. Todas essas limitações à comparação entre as modalidades de ensaio representam desvantagens para a generalização do método automatizado. Ao mesmo tempo, métodos baseados em observação foram relatados como sofrendo de complicações com comparações diretas entre as investigações 2,14,15. Argumentamos que, apesar das limitações, os ensaios automatizados são um meio viável de estimar a tolerância ao calor em termos de TKD ou CTmax.
Outros ensaios automatizados de tolerância ao calor para TKD e CTmax foram implementados e descritos anteriormente na literatura 16,17,18,19, com alguns utilizando os monitores de atividade DAM218,19. Além disso, pelo menos algumas investigações utilizaram métodos baseados em vídeo16 , 20 , 21 , bem como os monitores de atividade DAM220, para examinar os perfis de atividade da mosca da fruta no que se refere à tolerância ao calor no contexto do estresse térmico agudo. Como tal, automatizar ensaios de tolerância ao calor, inclusive com o sistema DAM2, não é uma ideia nova. O que é novo e valioso em nosso ensaio é a facilidade de gerenciamento de dados, conforme facilitado pelo HoTDAM! (análise). Os dados de atividade são difíceis de trabalhar e pode ser demorado e complicado extrair até mesmo as medidas mais simples (por exemplo, TKD) dos grandes conjuntos de dados sem o uso de software ou scripts que precisam ser personalizados para cada cenário. HoTDAM! é gratuito e está disponível como um aplicativo executável totalmente funcional com uma interface simples e fácil de usar. Nenhuma experiência anterior em codificação é necessária. Além disso, o software foi escrito de maneira orientada a objetos com documentação para facilitar a modificação. Como tal, HoTDAM! pode ser facilmente personalizado para atender a necessidades específicas. O código-fonte está disponível junto com o aplicativo executável. É nossa esperança que HoTDAM! pode atender laboratórios novos em ensaios de tolerância ao calor, oferecendo um meio fácil de medir TKD e CTmax, bem como atender laboratórios experientes com ensaios de tolerância ao calor, oferecendo software personalizável para facilitar o gerenciamento de dados.
Divulgações
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Agradecimentos
O projeto descrito foi apoiado por bolsas do Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (5P20GM103427 e 1U54GM115458). O Programa de Bolsas de Pesquisa de Graduação da UNK e o Programa de Pesquisa de Verão para Estudantes de Medicina da UNMC.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de ensaio de poliestireno de 14 mL | Falcon | 352057 | |
| tanque de peixes de 30 galões | Wal-mart | ||
| garrafas de 8 oz | Genesee | 32-129F | |
| Memmert | HPP750eco | ||
| fubá | Lab Scientific | FLY801010 | |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2 | (DAMSystem3 Data Sheet) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| DAMSystem software de aquisição de dados | TriKinetics | download grátis | |
| Drosophila | ágar Lab Scientific | FLY80201 | |
| etanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Ether | Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan software | TriKinetics | para digitalização de erros de texto, binning de dados e saída | |
| FlyStuff Flugs para garrafas | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs para frascos | Genesee | 49-102 | |
| Frascos FlyStuff | Genesee | 32-113RL | |
| HoTDAM software | Github ou Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| Aquecedor de circulação de imersão | PolyScience | MX-CA11B | |
| melaço | Lab Scientific | FLY80084 | |
| ácido propiônico | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Tubos de vidro 5 x 65 mm para DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| pincel pequeno | Wal-mart | ||
| SPSS Statistics | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| torula levedura | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 mutant stock | Bloomington Stock Center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | Bloomington Stock center | 3605 |
Referências
- Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
- Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
- Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
- Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
- Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
- Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
- MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
- Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
- Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
- Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).
Reimpressões e permissões
