Protocolo de injeção direta do nervo vago para ratos

Resumo

Apresentamos um protocolo para injeção direta do nervo vago em ratos, permitindo a administração do medicamento diretamente no nervo sem complicações pós-injeção. Este método se aplica a estudos neurológicos pré-clínicos envolvendo manipulação do sistema nervoso autônomo. Pode ser usado para injeção direta de nervos para outros nervos em ratos e outras espécies, com as modificações necessárias.

Resumo

Há uma abundância relativa de estratégias e metodologias para facilitar a entrega de medicamentos ao sistema nervoso central. No entanto, a administração de medicamentos diretamente no sistema nervoso periférico é menos comum, com menos publicações de métodos detalhados disponíveis para ajudar os pesquisadores. Aqui, descrevemos um método de injeção direta de nervo para administração de medicamentos no sistema nervoso periférico, usando o nervo vago como nervo modelo. Este método pode ser usado no tratamento de distúrbios do sistema nervoso autônomo através do direcionamento do nervo vago esquerdo, embora este método geral de injeção possa ser extrapolado para injeção de outros nervos com pequenas modificações. Este método explica todas as etapas críticas envolvidas no procedimento envolvendo microcirurgia em ratos adultos anestesiados sob um microscópio de dissecação. O uso de um corante de rastreamento é descrito para facilitar o monitoramento da fidelidade da injeção em tempo real. São fornecidas ilustrações de injeções bem-sucedidas e fracassadas. Se realizadas corretamente, as injeções diretas do nervo vago podem ser conduzidas de maneira segura e bem tolerada pelo rato, sem complicações pós-parto. Por exemplo, uma vez que os cirurgiões foram treinados neste método, seis dos seis ratos foram injetados com sucesso sem complicações. Este método de injeção direta de nervos para estudos pré-clínicos em ratos é capaz de fornecer agentes (incluindo, mas não se limitando à terapia genética) aos nervos periféricos.

Introdução

A aplicação do método correto de administração de medicamentos é um dos fatores críticos para alcançar resultados terapêuticos bem-sucedidos. Apesar da abundância de métodos para entrega de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC), apenas alguns métodos são relatados para entrega do sistema nervoso periférico (SNP) por injeção direta no nervo. A injeção direta do nervo, como a injeção nos gânglios da raiz dorsal (DRG) em ratos, foi testada em estudos pré-clínicos para melhor compreensão dos mecanismos de dor, toxicidade de drogas, transferência de genes ^1,2,3 e desenvolvimento de métodos gerais ^1,4. Relatos adicionais sobre injeção direta do nervo incluem injeção do nervo espinhal⁴, injeção do nervo ciático¹ e injeção do nervo vago em ratos⁵ e camundongos⁶. Recentemente, um método de injeção supracondrial foi proposto para a melhor distribuição da terapêutica na cabeça do nervo óptico em coelhos⁷.

O DRG é considerado o local ideal para injeção direta de vetores carregados de transgenes, como o vírus adeno-associado (AAV), devido à função sensorial dos corpos celulares no DRG². Métodos cirúrgicos e não cirúrgicos de injeções de DRG foram descritos ^1,8. No entanto, conclusões controversas foram encontradas sobre a consistência dos resultados com o método não cirúrgico de injeção de DRG¹. Um método cirúrgico envolvendo uma laminectomia parcial foi sugerido como 100% bem-sucedido para injeção de DRG em ratos sem qualquer alteração nos resultados comportamentais³, bem como um método envolvendo osteotomia parcial em camundongos⁹. Vários estudos relatam os métodos de injeção de DRG de drug delivery, que têm sido utilizados na pesquisa pré-clínica de terapia gênica em ratos e camundongos ^1,2,10. Estudos de terapia gênica baseados em vetores envolvendo injeções localizadas podem incluir os seguintes benefícios: diminuição da expressão fora do alvo, redução da toxicidade sistêmica e menores cargas virais e volumes de injeção, diminuição do risco de complicações imunogênicas^11,12.

O método de injeção direta no nervo ciático, o nervo mais longo do corpo, foi tentado expondo o nervo ciático direito no nível médio da coxa de um rato. O método utilizou uma pipeta de vidro puxado equipada com um sistema de injeção controlado por microprocessador para injetar um volume total de 10 μL de corante com uma taxa de fluxo de 1,2 μL/min¹. Este experimento mostrou uma falta de distribuição de corante ao nível de DRG, e a distribuição foi limitada principalmente em torno do local da injeção. Da mesma forma, outros métodos de injeções diretas de nervos, como injeções de nervos espinhais, foram testados com corante para avaliar a quantidade apropriada de volume de injeção e padrão de distribuição de corante em ratos. Sugere-se que 2 μL sejam ideais para injeção no nervo espinhal, enquanto 3 μL de corante por injeção de DRG mostraram a distribuição nos gânglios da raiz dorsal e ventral em ratos¹. O volume para injeção de DRG em camundongos foi relatado como ideal de 1,0 μL a 1,5 μL com base na cepa e no tamanho do corpo ^2,9.

O método de injeção direta do nervo vago foi usado em ratos⁵ e camundongos⁶ para avaliar o papel da lesão neural ou integridade celular na transferência de α-sinucleína humana. Esses dois estudos, conduzidos pelo mesmo grupo de pesquisadores, descrevem um breve método de injeção direta de vetores AAV no nervo vago esquerdo na região cervical. Em ratos, o método envolveu um capilar de vidro com um diâmetro de ponta de 60 μm para injetar 2 μL de vetor a uma taxa de fluxo de 0,5 μL / min com uma seringa Hamilton de 5 μL. Em camundongos, um volume total de solução vetorial de 750 nL foi injetado a uma taxa de fluxo de 160 nL / min usando uma agulha de aço rombo de 36 G encaixada em uma seringa NanoFil de 10 μL⁶. Esses experimentos mostraram que o transgene foi entregue e expresso em axônios na ponte e no mesencéfalo dos ratos e camundongos. Da mesma forma, o núcleo motor dorsal do nervo vago esquerdo mostrou imunorreação positiva com o transgene. Essas evidências ilustram que o método de injeção direta do nervo vago pode ser um método confiável em terapia genética, onde a transdução celular é estendida para vários locais do cérebro, que projetam axônios através do nervo vago. No entanto, esses métodos não mencionam o uso de nenhum corante para rastrear a fidelidade da injeção.

Aqui, é descrito um método para injeção direta no nervo vago esquerdo usando corantes de rastreamento não tóxicos amplamente aplicáveis a pesquisadores em estudos pré-clínicos. Armadilhas potenciais que podem causar dificuldades na entrega de medicamentos e as formas de superá-las são discutidas. Essas situações são ilustradas com fotos para mostrar o que torna a entrega malsucedida e a maneira de torná-la bem-sucedida.

Protocolo

O protocolo a seguir é conduzido de acordo com as diretrizes de ética institucional e a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Preparação da habitação

NOTA: Este protocolo é para ratos adultos com pelo menos 2 meses. Animais menores (incluindo camundongos e ratos mais jovens) são possíveis, mas não são recomendados e serão consideravelmente mais difíceis.

1. Forneça ração úmida ou qualquer outro alimento macio (gel de recuperação veterinária) por 48 h antes da cirurgia do nervo vago. Como os animais podem enfrentar dificuldade para comer após o procedimento, apresente esses itens aos animais antes da cirurgia para ajudá-los a se familiarizar com o sabor desses itens e induzir a motivação alimentar.
2. Ratos domésticos individualmente em uma gaiola pelo menos 1 semana antes da cirurgia, bem como 1 semana após a cirurgia. Isso permitirá que eles se acostumem com o estresse de estar sozinhos e evitem arranhões nas feridas após a cirurgia por um companheiro de ninhada.

2. Preparação dos itens cirúrgicos e espaço

1. Faça uma lista de todos os itens necessários com antecedência e verifique novamente se todos os itens estão disponíveis para a cirurgia.
2. Esterilize todos os itens com métodos apropriados de esterilização antes da cirurgia.
3. Configure o espaço cirúrgico estéril sob o microscópio de dissecação. Coloque uma almofada de aquecimento sob o microscópio para manter o rato aquecido durante a cirurgia.
4. Coloque todos os materiais cirúrgicos em uma mesa cirúrgica sobre uma cortina estéril. Mantenha espaço suficiente para a cirurgia sob o microscópio de dissecação. Certifique-se de que o foco do microscópio seja ideal e abranja a área cirúrgica para visualizar o nervo.
5. Coloque a bomba de seringa perto do estágio cirúrgico para que o comprimento do tubo seja suficiente para alcançar o local da injeção.
6. Coloque as ferramentas cirúrgicas ao lado da mão dominante do cirurgião.

3. Preparando uma mistura do medicamento candidato e do corante de rastreamento

1. Certifique-se de que o medicamento candidato seja diluído para atingir a concentração necessária no diluente recomendado, de modo que 5 μL do medicamento misturado com corante forneçam a quantidade necessária do medicamento candidato a ser administrado. Recomenda-se que um volume máximo de injeção pelo método do nervo vago direto seja de 5 μL (incluindo o corante de rastreamento, consulte a etapa 3.2).
2. Misture um corante compatível com o medicamento candidato para permitir o rastreamento da fidelidade da injeção em tempo real. Por exemplo, uma concentração final de 1% de Luxol Fast Blue ou 0,002% de fluoresceína são corantes compatíveis a serem usados.
   CUIDADO: Use o corante em sua concentração ideal na mistura de corante e medicamento candidato. Quando a concentração de corante na mistura é muito baixa, pode não ser visível rastrear a injeção. Quando a concentração de corante é muito alta, pode resultar em uma mistura muito espessa e com alta viscosidade, o que bloqueará a agulha de injeção.

4. Carregando a mistura candidata de medicamento e corante na tubulação

1. Ligue uma seringa de vidro de 100 μL com o êmbolo removido a uma agulha de 27 G.
2. Conecte uma extremidade de aproximadamente 45 cm de tubo de polietileno esterilizado à agulha de 27 G.
3. Pegue uma seringa de plástico de 3 mL e encaixe-a com uma agulha de 27 G. Carregue a seringa com cerca de 0,5 mL de solução salina normal a 0,9%.
4. Encha o tubo de polietileno com solução salina normal a 0,9% da extremidade aberta para preencher todo o comprimento do tubo e todo o cilindro da seringa de vidro até que transborde.
   NOTA: É fundamental evitar que bolhas de ar fiquem presas dentro da tubulação.
5. Remova e descarte a seringa e a agulha de 3 mL.
6. Insira o êmbolo da seringa no cilindro da seringa de vidro e empurre-o ligeiramente para a frente até o meio do cilindro.
7. Coloque a seringa de vidro na bomba de seringa.
8. Puxe o êmbolo ligeiramente para trás usando a bomba de seringa para criar um espaço de ar de cerca de 1.5 cm na extremidade aberta do comprimento do tubo.
9. Pipete pelo menos 5 μL de corante e mistura de medicamento candidato com uma micropipeta de 10 μL e coloque-a em um pedaço esterilizado de parafilme.
10. Retire a mistura de medicamentos candidatos para a tubulação puxando o êmbolo para trás através da bomba de seringa. Mantenha a bolha de ar entre a solução salina a 0,9% e a solução de injeção, mas, caso contrário, evite prender bolhas de ar dentro da solução de injeção. Marque o nível da mistura de injeção na tubulação com um marcador.
    NOTA: O espaço de ar entre a mistura candidata de corante medicamentoso e a solução salina estéril dentro da tubulação é fundamental para evitar a mistura das duas soluções.
11. Encaixe a agulha de 35 G com o tubo. Fixe a agulha na superfície limpa do estágio cirúrgico com fita adesiva para que a agulha não fique solta, não se mova e toque em mais nada e permaneça esterilizada.

5. Escorva da agulha de injeção

1. Defina o programa da bomba de seringa para dispensar 0.5 μL/min.
2. Ligue a bomba de seringa por cerca de 10-15 s, até que a solução de injeção comece a sair da ponta da agulha. Uma pequena quantidade da mistura na ponta da agulha sem vazamento na junta do tubo e da agulha de injeção (ou em qualquer outro lugar ao longo do comprimento da seringa, tubo ou agulha) indica que a configuração está correta.
   NOTA: Se uma pequena gota na ponta da agulha não for vista, isso indica um bloqueio da agulha. O bloqueio da agulha pode ocorrer devido à alta viscosidade do medicamento candidato e da mistura de corante, excesso de ar preso no sistema e a seringa de vidro não está encaixada corretamente dentro da bomba da seringa. Consulte a Figura 1 para obter um exemplo de vazamento na junção entre a agulha e o tubo. O priming é fundamental porque ajuda a identificar se a agulha está desobstruída e se a injeção dentro do nervo passaria suavemente.

6. Preparação do rato para a cirurgia

1. Obter o peso corporal do rato para calcular a dose necessária de analgésicos. Por exemplo, o carprofeno é usado na dose de 5 mg / kg por via subcutânea em ratos.
   NOTA: Recomenda-se armazenar o carprofeno a 4 °C antes da injeção.
2. Anestesiar o rato com um vaporizador de isoflurano usando uma taxa de fluxo de 3% -4% para indução da anestesia por cerca de 2-3 min. Reduza a taxa de fluxo de isoflurano para cerca de 1,75% -2% para manutenção da anestesia.
3. Transfira o rato para uma mesa separada com uma configuração para depilação e preparação do local. Certifique-se de que esta mesa esteja próxima ao espaço cirúrgico.
4. Aplique pomada lacrimal artificial em ambos os olhos do rato para evitar o ressecamento excessivo.
5. Administre analgésicos de acordo com o protocolo institucional aprovado para controlar a dor quando o rato voltar à consciência.
6. Depile a área cirúrgica com uma máquina de cortar cabelo no lado ventral do pescoço, na região cervical. Faça a barba até cerca de 2 cm de distância perpendicular da linha média em ambos os lados, do queixo ao esterno.
7. Esterilize a área com álcool etílico 70% e betadina 10%, limpando a área três vezes alternadamente com um cotonete embebido em álcool e iodopovidona. Limpe do centro da área para fora em um padrão circular.
8. Transferir o rato para a fase cirúrgica ao microscópio em decúbito dorsal. Ajuste o foco do microscópio para visualizar a área da cirurgia na região cervical.

7. Realização de cirurgia em ratos para injetar o medicamento candidato diretamente no nervo vago esquerdo (Figura 2, Figura 3 e Figura 4)

NOTA: Esta parte do método exigirá uma segunda pessoa para auxiliar o cirurgião.

1. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento em decúbito dorsal sob o microscópio de dissecação associado a uma luz montada.
2. Prenda os dentes da mandíbula superior frontal do rato com um pedaço de sutura não absorvível e fixe a extremidade aberta da sutura dentro do cone do nariz para que a narina do rato fique sempre dentro do cone do nariz durante a anestesia.
3. Posicione o rato de forma que sua cabeça fique no lado esquerdo do cirurgião destro (ou no lado direito de um cirurgião canhoto). Nesta posição, a parte frontal do cirurgião é perpendicular ao corpo do rato. Coloque uma almofada de calibre esterilizado sob o pescoço e ajuste o ângulo da região cervical do rato para que a região cervical fique reta. Isso facilitará a localização do nervo vago esquerdo e a realização da injeção.
4. Cubra todo o corpo do rato com um campo esterilizado, mantendo o espaço cirúrgico aberto.
5. Fixe quatro pinos retratores individualmente com 4 fixadores magnéticos com elastômeros e coloque os fixadores nos quatro cantos do estágio cirúrgico.
6. Injete anestésicos locais epidérmicos na linha média da região cervical onde a incisão é feita. Por exemplo, geralmente é usada uma mistura de lidocaína e bupivacaína.
7. Faça uma incisão longitudinal na pele com cerca de 2 cm de comprimento na linha média entre o queixo e o esterno com uma lâmina de bisturi no lado ventral do pescoço na região cervical (Figura 3A).
8. Separe as bordas cortadas da pele com pontas de algodão esterilizadas.
9. Retraia as bordas da pele em direções opostas do local da incisão com a ajuda de pontas retratoras.
10. Separe o painel com pontas de algodão para ir mais fundo. Empurre as glândulas salivares para o lado lateral.
11. Separe os músculos esternomastóideos com pontas de algodão e retraia-os com os pinos. À medida que a separação do músculo esternomastóideo avança, a traqueia aparece no meio, coberta por músculo esterno-hióideo (Figura 3B).
    NOTA: Tenha cuidado para não exercer pressão sobre a traqueia.
12. Avance a separação do tecido no lado esquerdo da traqueia do rato até que apareça a bainha carotídea, que contém a artéria carótida comum correndo junto com o nervo vago esquerdo.
13. Faça cuidadosamente um pequeno orifício na bainha carotídea com uma pinça fina, prestando atenção para não ferir a artéria carótida ao microscópio. Separe o nervo vago esquerdo da artéria carótida comum com uma pinça fina.
    NOTA: A área cirúrgica é anatomicamente crítica. A parede da artéria carótida é espessa, escorregadia e não se machuca facilmente, mas a ponta afiada de uma pinça fina pode machucá-la e pode ocorrer sangramento. Ao mesmo tempo, preste atenção para não ferir o nervo.
14. Uma vez que o nervo é separado da artéria pela pinça, use uma agulha curva de 25 G encaixada em uma seringa de 1 mL desse orifício para "enganchar" e segurar o nervo pela mão não dominante (Figura 4A).
    NOTA: A ponta da agulha curva é cega para não ferir o nervo e a artéria. O ângulo de curvatura da ponta da agulha é feito sob medida para cerca de 90° usando um hemostático (Figura 2).
15. Com a mão dominante, segure a agulha carregada com a mistura candidata de corante medicamentoso e pique suavemente o nervo na mesma direção em que o nervo corre, de modo que o chanfro da agulha fique voltado para cima.
    1. Para uma picada fácil, mantenha o nervo reto puxando suavemente usando o gancho de 25 G. Insira a agulha no nervo e avance para frente, mais de 0,5 cm, mantendo a agulha paralela ao nervo vago. Em seguida, puxe ligeiramente para trás para que cerca de 0,4-0,5 cm da agulha permaneça dentro do nervo.
       NOTA: O ângulo da agulha deve ser raso o suficiente para penetrar dentro do nervo sem passar para o outro lado.
16. Pode haver ocasiões em que a agulha está desobstruída fora do nervo no momento da preparação, mas a mistura candidata de corante medicamentoso não passa suavemente dentro do nervo. Para evitar essa situação, limite o número de picadas nervosas com uma única agulha não mais do que 3 vezes. Se a agulha ficar embotada, as chances de bloqueio ou injeção inadequada aumentarão.
17. Certifique-se de que a agulha esteja completamente dentro do nervo. Mantenha a posição imóvel e ligue a bomba da seringa.
    NOTA: Verifique cuidadosamente no local da injeção para ver se a mistura candidata de corante medicamentoso não está refluindo para fora do nervo.
18. Enquanto a injeção estiver em andamento, examine constantemente se a infusão permanece dentro do nervo e flui suavemente. Use a marca feita no tubo de infusão para monitorar o movimento da mistura de corante a partir do ponto de partida.
    1. Se a mistura candidata de corante medicamentoso não estiver fluindo suavemente, puxe a agulha para fora e repita a etapa de primer (etapa 5.2). Em seguida, reinsira a agulha no nervo e retome a infusão.
19. O nervo começa a desenvolver a cor do corante (Figura 4B). Continue a infusão a 0,5 μL / min por 10 min para infundir todos os 5 μL da mistura candidata de medicamento e corante.
    NOTA: Recomenda-se irrigar os tecidos expostos com uma pequena quantidade de solução salina estéril quente a 0,9%, conforme necessário, para evitar ressecamento excessivo e danos.
20. Depois que os 5 μL forem infundidos e a bomba da seringa parada, mantenha a agulha no lugar por mais 1 minuto para permitir que toda a mistura candidata de medicamento e corante se espalhe do local da injeção. Remova a agulha.
21. Remova a agulha curva de 25 G. Use pontas de algodão estéreis para mover suavemente os lenços de volta ao seu local original. Remova as pontas do retrator.
22. Feche a ferida com uma sutura não absorvível (sutura absorvível também pode ser usada). Aplique uma pequena quantidade de cola de tecido entre os pontos, se necessário, para fechar a ferida perfeitamente.

8. Cuidados pós-operatórios de um rato

1. Infundir cerca de 3 mL de solução salina morna a 0,9% por via subcutânea após o fechamento da ferida. Isso ajuda os ratos a se reidratarem imediatamente.
2. Coloque o rato em uma fonte de calor até que ele se recupere totalmente da anestesia para a condição normal. Observe qualquer coisa observada que seja anormal durante o processo de recuperação.
   NOTA: a duração da recuperação pode ser maior se o procedimento de injeção nervosa demorar muito.
3. Transfira o rato para sua gaiola doméstica com ração úmida no chão da gaiola. Certifique-se de que a água esteja disponível o tempo todo. Observe o rato no pós-operatório por cerca de 2 h para garantir que o rato não esteja sentindo frio.
   NOTA: Coloque o rato em uma fonte de calor por mais horas se sentir frio.
4. Monitore o rato em 12 h, 24 h, 36 h, 48 h e 72 h após a cirurgia com notas escritas de observações. Repita os analgésicos de acordo com o protocolo institucional aprovado para controlar a dor. Por exemplo, o carprofeno é administrado a uma taxa de 5 mg / kg por via subcutânea duas vezes no intervalo de 24 h. Consulte um veterinário se a dor permanecer no rato por mais de 48 h.
5. Repita a injeção subcutânea de cerca de 3 mL de solução salina morna a 0,9% em 24 h com base nas condições do rato.
6. Continue a avaliar a ferida. Certifique-se de que a ferida esteja seca e em processo de cicatrização.
   NOTA: Vermelhidão, inchaço e condição dolorosa da ferida com inatividade e embotamento do rato podem ser uma indicação de inflamação da ferida e podem justificar uma consulta veterinária adicional. Um rato com dor mostrará costas curvadas, pelagem com babados, olhos vermelhos e condição inativa. Geralmente é encontrado em um canto da gaiola.
7. Remova as suturas não absorvíveis dentro de 2 semanas após a cicatrização da ferida.

Resultados

Seis ratos adultos (3 machos e 3 fêmeas) foram utilizados no presente estudo. De seis, um rato foi injetado várias vezes para demonstrar uma condição de falha na injeção que mostra uma difusão de corante ao redor do local da injeção Figura 5A. Todos os outros ratos apresentaram injeção lisa e coloração nervosa, conforme mostrado na Figura 4B e na Figura 5B.

Discussão

O método de injeção direta no nervo vago esquerdo pode ser feito com segurança e sem complicações pós-cirúrgicas em ratos. A administração de medicamentos ao nervo vago pode ser usada para atingir o sistema nervoso autônomo (SNA). Isso envolve certas etapas críticas que exigem prática e um grau moderado a alto de habilidade cirúrgica.

Este procedimento cirúrgico requer anestesia geral balanceada em ratos. O cirurgião pretende terminar a cirurgia em um período...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL BD  Seringa Tuberculina com Destacável 25 G x 5/8". Agulha	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Usado para conectar com agulha curva para puxar o nervo vago e segurá-lo no momento da injeção.
Injeção de cloridrato de bupivacaína a 0,5%	Hospira	NDC 0409-1162-19	Anestésicos locais usados para anestesiar o tecido local.
100 mL 0,9% de Cloreto de Sódio para Irrigação USP	Stericare Solutions	Item #6240	Solução salina normal, usada para reidratar ratos e tecidos.
20 Pontas Retratoras, 7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Usado para separar e segurar tecidos no momento da cirurgia.
Seringa BD-Luer-Lok de 3 mL, Estéril, Uso Único	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Usado para injetar solução salina em ratos e preencher a solução salina no tubo de polietileno.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Corante de fluoresceína visível dentro do nervo. Usado para rastrear a fidelidade da injeção.
Balança de pesagem de animais	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Usado para medir o peso corporal de ratos.
Luvas cirúrgicas Ansell ENCORE Perry Style 42 PF	Ansell	ASTM D3577	é usada no momento da cirurgia por um cirurgião.
Pomada artificial 3.5g das lágrimas		NDC 46066-753-55	Usado nos eyses para impedir a secura excessiva dos olhos.
Hemostático Baby-Myxter	Ferramentas Fine Science	13013-14	Usado para parar o sangramento em caso de emergência. Também usado para dobrar a agulha de 25 G x 5/8".
Tubulação de PE Intramédica BD	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Usado no sistema de configuração de injeção para conectar com agulha Hamilton e agulhas NanoFil. Ele também contém a mistura de injeção.
Agulha de Deslizamento BD Precison, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Usada para injetar solução salina em ratos e para fazer uma agulha curva.
Agulha de Deslizamento BD Precison, 27 G x ½ "	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Usado para encher solução salina estéril no tubo intradérmico BD.
Benchmark Accuris " PróximoPette" Conjunto de Pipeta de Volume Variável Micro Starter inclui 4 pipetas: 10/20/200/1000 μ L, mais suporte	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Usado para pipetar solução estéril.
Betadine, Povidina Iodo 10%	Honestmed	67618015017	Usado para desinfetar a área cirúrgica.
Solução injetável de carprofeno 50 mg/mL	Fornecido pela Covtrus (6451506845)	SKU 591149	No nosso caso, usamos carprofeno diluído na taxa de dose de 5 mg/kg fornecida pelo Animal Resource Center do University of Texas Southwestern Medical Center.
Agulha curvada (feita sob medida)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in a agulha é curvada a 90 graus com a ajuda de um hemostático. A ponta da agulha é cega. Ele precisa ser esterilizado antes do uso. É usado para enganchar o nervo vago e segurá-lo no momento da separação e injeção.
Microscópio de dissecação	Motic	SMZ-171-BLED (binóculo com luzes)	Usado para ampliar a área anatômica crifical no momento da separação do nervo vago, injeção e para verificar o vazamento da injeção.
Folha de cortinado	Dynarex	Reorder#8122	Usado como cortina após a esterilização.
Aplicadores de Ponta de Algodão Dukal, Não Estéril	Item Dukal	9003	Usado para separação de tecido, precisa esterilizar antes do uso.
Dumont #7 - Fórceps Fino	Ferramentas de Ciência Fina	11274-20	Usado para separar o nervo vago esquerdo da artéria carótida comum. É curvo tão fácil de usar.
Sutura de Monofilamento Não Tingida Ethicon PDS II - SUTURA, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Usado na sutura da ferida.
Sutura de Nylon Ethilon Monofilamento Preto	Ethicon	1856G	Usado na sutura da ferida se for usada sutura não absorvente. Também usado para enganchar o dente de rato para fixar o nariz dentro do cone do nariz.
Fórceps Fino - Acabamento Espelhado	Ferramentas de Ciência Fina	11412-11	Usado no momento da separação do nervo vago da artéria carótida comum. Isso é direto.
Tesoura Fina - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Ued para cortar tecido.
Solução de limpeza	Hamilton Hamilton	HT18311	Usado para limpar o Hamilton após o uso.
Agulha Hamilton, 27G, Agulha RN de Cubo Pequeno, 2", PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Usado para conectar BD Intramedic™ Tubulação PE.
Seringa Hamilton, 710RN	Hamilton	7638-01	Usado para segurar a droga no momento da injeção do nervo vago.
Seringa de Insulina	EXEL INT, Ponto de conforto	REF 26027	Usado para injetar carprofeno e anestésicos locais.
Lidocaína 2% Injeção	Covetrus	Reorder#002468	Usado para misturar com Bupivacaína e injetar no local da incisão.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Corante visível dentro do nervo, usado para misturar com a droga para que a mistura de injeção seja visível.
Micro esterilizador do grânulo com ferramentas finas da ciência dos grânulos de vidro		Artigo no. 18090-46	Usado para esterilizar ferramentas cirúrgicas entre a cirurgia do rato.
Agulhas NanoFil-NF35BV-2	Instrumento de Precisão Mundial	NC9708956	Usado para injetar uma mistura de drogas e corantes dentro do nervo vago.
Porta-agulhas Olsen-Hegar com cortadores de sutura	Ferramentas de Belas Ciências	12002-12	Usado na sutura de feridas.
Filme de Embalagem de Laboratório Parafilm M, 4 Polegadas x 125 Pés, 1 Rolo por Caixa, 12 Contagem	Honestmed	PM#996	Usado para segurar os 5 uL aliquotados de mistura de droga-corante para que o carregamento da mistura de droga-corante no tubo intradérmico BDTM seja preciso.
Almofadas de preparação de álcool PDI	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Usado para desinfetar a área cirúrgica.
Esponjas de Gaze Tipo VII Estéreis Premium Care, 8-Ply, 2" x 2"	Item Dukal	C5119	Usado como cushon sob o pescoço de rato no momento da cirurgia.
Imprensa' n Filme de Vedação	Glad		Usado para cobrir um rato no momento da cirurgia como uma cortina.
Conjunto de Retrator de Rato	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Usado para manter a incisão aberta para que seja fácil separar o nervo vago da artéria carótida.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20,3 cm L x 25,4 cm L (8 pol. L x 10 pol. L), usado para manter o rato aquecido.
S& Pinça T - Pontas SuperGrip Ferramentas	de Ciência Fina	00632-11	Usado no momento da sutura para segurar o tecido sem danos.
S& Pinça de amarração de sutura T	Fine Science Tools	00272-13	Usado para apertar a sutura.
Lâmina de bisturi #15	Fine Science Tools	10015-00	Usada para fazer uma incisão na pele no lado ventral do pescoço.
Cabo de bisturi-#7	Fine Science Tools	10007-12	Usado para segurar a lâmina do bisturi.
Bomba de Seringa	KD Scientific	78-81-8052GL	A #D107034 serial, modelo # LEGATO-180, é uma bomba programável que pode bombear pequenos volumes de mistura sob um programa.
Recarga de Ponta de Filtro TipOne Starter Systems	USA Scientific	Item #1120-3510	Usado para pipetar a mistura de drogas e corantes.
Vaporizador para Isoflurano, Cheio de Funil	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Usado para anestesiar ratos.
Adesivos de tecido Vetbond	3M Ciência aplicada à identificação de vida	B00016067	Usado para selar o tecido no local da ferida cortada se a sutura não for perfeita.
Kit de Tosquiadeira Sem Fio Profissional Wahl BravMini+	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Usado para cortar cabelo de rato.