Identificação e classificação de variantes missense da subunidade do receptor GABAA específicas da posição para seu papel nos neurônios piramidais do hipocampo

Summary

Este estudo apresenta uma estrutura multiescala, abrangendo desde o DNA até a função da proteína e o comportamento neural. Ele apresenta uma nova abordagem para investigar mutações patogênicas previstas na subunidade do receptor GABA_A , levantando a hipótese de que mutações epileptogênicas e mutações proximais, previstas como patogênicas, podem produzir efeitos semelhantes no modelo de neurônio piramidal CA1.

Abstract

Compreender os efeitos de variantes funcionalmente desconhecidas em genes associados à epilepsia é crucial para elucidar a fisiopatologia da doença e desenvolver terapêuticas personalizadas. Com uma estrutura multiescala, abrangendo desde a sequência de DNA até a função da proteína e o comportamento neural, descrevemos uma nova abordagem para prever e investigar mutações patogênicas, levantando a hipótese de que mutações epileptogênicas na subunidade do receptor GABA_A e mutações previstas próximas podem produzir efeitos semelhantes no modelo de neurônio piramidal CA1. Ao explorar as relações características entre mutações patogênicas previstas e mutações epileptogênicas proximais, o estudo visa estimar os efeitos das mutações previstas com base nos efeitos das mutações epileptogênicas nas simulações de neurônios piramidais do hipocampo.

A metodologia começa com a coleta de dados genéticos da subunidade γ2 do receptor GABA_A , seguida de limpeza e formatação dos dados realizada em R usando um script personalizado. Em seguida, os preditores de conjunto serão aplicados para identificar e priorizar as variantes patogênicas missense da subunidade γ2 . O mapeamento de uma variante patogênica específica (prevista) para os domínios estruturais da subunidade compartilhados por mutações epileptogênicas será ilustrado, acompanhado de modelagem molecular de seus efeitos e consideração da conservação evolutiva. Em seguida, será realizada meta-análise específica da variante e normalização de parâmetros, seguida de análise de correlação para identificar quaisquer relações significativas entre as mutações previstas e as mutações epileptogênicas proximais. Usando um simulador neural baseado em Python, será descrito um modelo de neurônio baseado em condutância multicompartimental, refletindo o efeito de mutantes do tipo selvagem e epileptogênicos. A simulação das respostas neurais geradas pelo subtipo de receptor GABA_A epileptogênico será considerada para a estimativa aproximada do efeito das variantes patogênicas previstas na resposta neural. Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo que explora uma estrutura multiescala para estimar os efeitos das variantes do receptor GABA_A no comportamento neuronal, crucial para a pesquisa da epilepsia. Este protocolo pode servir como base para melhorar as previsões de fenótipos celulares causados por variantes potencialmente patogênicas dos receptores GABA_A associados à epilepsia.

Introduction

Para quase todas as doenças humanas, a variação genética desempenha um papel significativo na suscetibilidade individual. Portanto, entender como as variações de sequência se relacionam com o risco de doença oferece uma maneira valiosa de descobrir os principais processos envolvidos no desenvolvimento da doença e identificar novas abordagens para prevenção e tratamento¹. Isso também se aplica aos distúrbios do neurodesenvolvimento, que estão entre as condições médicas crônicas mais prevalentes na atenção primária pediátrica². Condições como transtorno do espectro autista, deficiência intelectual e epilepsia ilustram como a variação genética influencia significativamente a suscetibilidade individual durante o desenvolvimento³.

O cérebro em desenvolvimento é mais suscetível a crises epilépticas do que o cérebro adulto devido à incompatibilidade de neurodesenvolvimento geneticamente programada no equilíbrio crítico entre excitação e inibição⁴. Como o GABA (ácido gama-aminobutírico), o principal neurotransmissor inibitório no cérebro adulto, é excitatório durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal inicial, isso não é favorável à estabilidade necessária para prevenir convulsões em cérebros jovens. Esse estado temporário, causado pela falta de expressão suficiente de cotransportadores K-Cl⁵, pode contribuir para um risco aumentado de atividade convulsiva na presença de receptores GABA_A disfuncionais. Os receptores GABA_A medeiam as ações excitatórias e inibitórias do GABA, dependendo da concentração intracelular do íon ^Cl-6. Assim, à medida que o cérebro amadurece, mutações nos genes codificadores do receptor GABA_A, bem como em outros canais iônicos, distorcem a excitabilidade, e mutações em genes envolvidos no metabolismo neuronal, sinalização celular e formação de sinapses⁷ podem causar condições como epilepsia do tipo ausência da infância⁸.

As intervenções clínicas estão cada vez mais alavancando a análise genética para melhorar a precisão no tratamento de distúrbios do neurodesenvolvimento². O teste genético na epilepsia pediátrica apresenta alvos potenciais para abordagens de medicina de precisão⁹, destacando a importância das variantes genéticas na orientação das decisões de tratamento. Além disso, ~ 25% dos pacientes com epilepsia com mutações de novo recebem diagnósticos genéticos que identificam alvos potenciais para a medicina de precisão, ressaltando o valor significativo das variantes genéticas na orientação das decisões de tratamento¹⁰. Isso foi alimentado por avanços nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração, como painéis de genes direcionados, sequenciamento de exoma completo e sequenciamento de genoma completo, que aceleraram drasticamente as descobertas genéticas¹¹. No entanto, o número crescente de novas descobertas de genes vem com um desafio quando os resultados produzem uma variante de significado desconhecido (VUS), uma classificação que reflete evidências conflitantes ou informações insuficientes sobre o papel molecular da variante na patogênese da doença. As variantes classificadas como VUS correspondem a uma categoria dentro do sistema de classificação de variantes de cinco níveis proposto pelo American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) e pela Association for Molecular Pathology (AMP)¹².

Enfrentar o desafio de variantes genéticas funcionalmente desconhecidas requer esforços em duas dimensões principais: prática clínica e pesquisa. Clinicamente, a incerteza em torno da USV pode complicar o manejo e a tomada de decisão^{do paciente 13}. Do ponto de vista da pesquisa científica, identificar variantes patogênicas entre o número crescente de variantes de significado incerto e determinar seus papéis na fisiopatologia da doença e nos efeitos fenotípicos são cruciais¹. Um cenário ideal envolveria prever com precisão os efeitos moleculares, neuronais e de nível de rede de todas as variantes funcionalmente não caracterizadas, minimizando assim os recursos, tempo e esforço necessários para investigações baseadas em laboratório. Esses aspectos ressaltam a importância de classificar com precisão as variantes genéticas para permitir o diagnóstico preciso de epilepsias genéticas, apoiar o tratamento personalizado e facilitar a descoberta de potenciais alvos farmacológicos. As ferramentas preditivas atuais 14,15,16,17 são relativamente precisas, mas normalmente fornecem apenas classificações binárias (patogênicas vs. benignas) e carecem de informações específicas da doença sobre fisiopatologia molecular, consequências fenotípicas e mecanismos subjacentes. Concentrando-se nas variantes missense desconhecidas de genes codificadores de subunidades do receptor GABA_A selecionados, este artigo apresenta uma estrutura destinada a melhorar a orientação da pesquisa, incorporando fatores contextuais de variantes como aspectos moleculares, evolutivos e estruturais, bem como simulações de patologia neural derivadas de dados biofísicos in vitro de mutações associadas à epilepsia. Nossa metodologia aborda a identificação de variantes patogênicas desconhecidas da subunidade γ2 do receptor GABA_A, uma subunidade-chave envolvida na fisiopatologia da epilepsia 18,19,20. Isso é seguido pela exploração da correspondência específica da posição dessas variantes previstas com as mutações associadas à epilepsia caracterizadas por dados estruturais e eletrofisiológicos. Esses dados são então usados para estimar o efeito variante em um modelo de neurônio piramidal hipocampal expressando um subtipo de receptor GABA_A, composto por subunidades γ2, α1 e β3 (receptores γ2-GABA_A), responsáveis pela rápida inibição sináptica⁶. É importante notar que os receptores GABA_A se reúnem a partir de um grande pool de subunidades (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π e ρ1-ρ3) e, dependendo da composição da subunidade, os receptores GABA_A diferem em sua modulação, características biofísicas, bem como padrões de expressão regional, celular e subcelular acoplados a funções específicas 6,21,22,23^{, 24,25}. Assim, o presente estudo se concentra apenas nos receptores γ2-GABA_A ou γ2 contendo GABA_A.

As subunidades do receptor GABA_A são compostas por características estruturais características - um longo domínio extracelular N-terminal (ECD), quatro domínios transmembranares (TM1 a TM4), um ligante intracelular conectando o TM1 e o TM2, um ligante extracelular conectando o TM2 e o TM3, uma grande alça intracelular entre o TM3 e o TM4 (alça TM3-TM4) e um terminal C extracelular curto ^{6,26, 27}. Sugere-se que o receptor_{GABA A} funcione por meio de um mecanismo complexo de "bloqueio e puxão", onde a ligação do GABA bloqueia as subunidades β e α, fazendo com que elas puxem os domínios extracelulares (ECDs) das subunidades, girando-as no sentido anti-horário²⁷. Esse movimento dobra os domínios transmembranares (TMDs), abrindo assim o canal iônico²⁷. Assim, a atividade do canal parece ser coordenada junto com estruturais dentro dos receptores GABA_A. Acontece que as mutações da epilepsia causam disfunção na atividade do canal por meio da distorção desses estruturais²⁸. Consequentemente, nosso estudo é baseado na ideia de que variantes patogênicas preditas nas proximidades de mutações epileptogênicas funcionalmente identificadas nos estruturais específicos das subunidades do receptor GABA_A podem exibir padrões semelhantes de distorção eletrofisiológica ou biofísica na função do canal, como observado nos casos dessas mutações epileptogênicas. Embora a presença de estruturais epileptogênicos nas subunidades do receptor GABA_A ²⁸ apoie indiretamente essa noção, nosso estudo demonstra a complexidade e o desafio de correlacionar parâmetros biofísicos de mutações epileptogênicas com os de mutações patogênicas previstas. Para desmascarar essas relações complexas, nossa estrutura é significativa, pois destaca uma abordagem multiescala que vai do DNA à função da proteína e ao comportamento neural crítico para a pesquisa da epilepsia. Essa abordagem integra genética computacional com modelagem molecular e simulações neurais, ao mesmo tempo em que enfatiza a importância de métodos complementares, como aprendizado de máquina treinado em grandes conjuntos de dados, que podem capturar os efeitos das mutações na estrutura do canal, atividade e excitabilidade neural. Além disso, a simulação da atividade do receptor γ2-GABA_A epileptogênico no modelo de neurônio piramidal do hipocampo permite a replicação do fenótipo celular in vitro associado à canalopatia do receptor GABA_A e a demonstração de respostas alteradas de neurônio único no centro da disfunção da rede.

Protocol

1. Predição in silico de variantes patogênicas

1. Coleta de dados de variantes
   1. Usando o banco de dados ClinVar²⁹, pesquise variantes de significado incerto (VUS) na região codificadora do gene de interesse através do site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Digite o símbolo do gene (por exemplo, GABRG2) na barra de pesquisa e filtre os resultados para incluir apenas os tipos desejados de variantes, como nucleotídeo único, variantes missense com significado incerto. Baixe e salve os dados como data.xlxs (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S1). Registre a data dos dados baixados.
      NOTA: No presente protocolo, será analisada a subunidade γ2 humana do receptor GABA_A, especificamente a subunidade do receptor do ácido gama-aminobutírico tipo A gama2 (GABRG2), variante de transcrição 1, mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), também conhecida como γ2L. É importante registrar o transcrito de referência do gene de interesse, bem como outros identificadores correspondentes em diferentes bancos de dados (UniProt, ENSEMBL, PDB), uma vez que diferentes métodos computacionais podem exigir identificadores diferentes (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S2). Caso o banco de dados ou ferramenta computacional não reconheça os números de versão dos identificadores de sequência, tente o ID com o número da versão (NM_198904.4) e sem o número da versão (NM_198904).
   2. Informações básicas sobre proteínas de referência
      1. No https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ do banco de dados do NCBI, selecione Nucleotídeo nas opções de pesquisa e insira o NCBI Ref. seq. ID do gene de interesse (NM_198904.4). Em seguida, rolando para baixo na coluna da direita, clique na Proteína na categoria Informações relacionadas para encontrar a proteína (NP_944494.1) codificada pela transcrição NM_198904.4. Usando as informações fornecidas para a proteína NP_944494.1, registre as posições de sequência das regiões específicas na forma de uma tabela (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S3).
         NOTA: É importante determinar as informações preliminares conhecidas para a posição da sequência de regiões, motivos ou resíduos funcional e estruturalmente críticos, como domínios de proteínas, locais de fosforilação, locais de ligação de ligantes e interfaces de interação molecular. Isso pode ser alcançado combinando banco de dados (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) e pesquisas bibliográficas.
2. Organização de dados variantes
   1. Organize os dados para atender aos requisitos de entrada para os preditores escolhidos. Certifique-se de que o formato dos dados recuperados esteja organizado para corresponder aos requisitos do servidor dbNSFP http://database.liulab.science/dbNSFP. Para fazer isso, remova colunas desnecessárias do arquivo data.xlsx (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S1 da etapa 1.1.1), mantendo apenas as seguintes colunas na ordem especificada:
      "Cromossomo GRCh38", "Localização GRCh38", "Nome", "Alteração de proteína".
   2. Salve o arquivo com um novo nome de arquivo: "data1.xlsx" (Tabela Suplementar S4). Formate o arquivo data1.xlsx em R executando o código (Arquivo Suplementar 1: Data_GABAA. R), que salvará os dados formatados como data1_output.xlsx (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S5) no diretório de trabalho relevante para o projeto R.
      NOTA: Diferentes métodos computacionais requerem diferentes tipos e formatos de dados. Coletar e organizar dados de acordo com requisitos de formato específicos, mesmo para uma dúzia de variantes, pode ser propenso a erros e demorado, portanto, essa etapa é importante, a menos que o pool de variantes seja composto por apenas algumas variantes. Então, a organização manual de dados pode ser possível.
3. Predição de patogenicidade
   1. Transfira o conteúdo do arquivo data1_output.xlsx para a versão acadêmica do servidor dbNSFP^30,31 acessado via http://database.liulab.science/dbNSFP. Para fazer isso, copie/cole ou carregue diretamente o arquivo em .txt formato.
   2. Certifique-se de que as seguintes opções sejam pré-selecionadas e confirmadas no servidor: HG38 (build do genoma), ClinPred³² e BayesDEL³³ antes do envio. Em alguns minutos, o servidor gerará os resultados.
      NOTA: No presente protocolo, dois preditores de conjunto, BayesDEL³³ e ClinPred³², foram selecionados para alta precisão³⁴ e praticidade. No entanto, outros preditores, como o AlphaMissense, que está disponível no banco de dados dbNSFP ^30,31 também podem ser selecionados. A seleção de ferramentas in silico depende de vários fatores, incluindo a geração de várias linhas suficientes de evidências computacionais para uma previsão poderosa¹². Preditores de conjunto integrando a análise de vários algoritmos preditivos podem servir a esse propósito.
   3. Baixe o arquivo de saída (um formato .txt) e salve-o como data2.xlsx (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S6).
   4. Defina os filtros em data2.xlsx (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S6) clicando na opção de filtro no menu e determinando as variantes de consenso em ambas as colunas filtrando por D. Isso fornecerá a lista das variantes mais patogênicas; salve-o (consulte a guia Consenso na Tabela Suplementar S6 [ Arquivo Suplementar 4]).
4. Seleção de variantes
   1. Dentre as predições patogênicas consensuais, determinar as variantes na proximidade de mutações epileptogênicas obtidas da literatura. Certifique-se de que estes últimos tenham parâmetros estruturais e biofísicos adequados para modelagem de neurônios.
      NOTA: Esta etapa é exploratória e também está relacionada ao levantamento da proteína de interesse em termos de seus parâmetros estruturais, físico-químicos e biofísicos. No presente estudo, esses dados foram obtidos de Brünger et ^al.35 e Guo et ^al.36, além de um levantamento de mutações associadas à epilepsia. Além disso, como opção, os escores do AlphaMissense³⁷ foram acessados a partir do banco de dados dbNSFP^30,31 repetindo a etapa 1.3 (Arquivo Suplementar 4: Tabela Suplementar S7). Mais detalhes são fornecidos nas seções 2.1.1 e 2.1.2 do protocolo e nos Resultados (consulte "Variantes de agrupamento para parâmetros estruturais e biofísicos").
   2. Para visualização básica, use os servidores Protter³⁸ ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) e HOPE³⁹ (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) para examinar as variantes na etapa anterior no contexto de mutações selecionadas do gene GABRG2 : P302L⁴⁰ e K328M (ou K289M⁴¹, ao excluir o peptídeo sinal de 39 resíduos).
      NOTA: Devido à enorme complexidade, a avaliação estrutural dos efeitos das variantes deve ser conduzida em vários níveis de análise. Ferramentas como o Protter³⁸ permitirão a visualização clara das variantes no contexto das características topológicas da proteína e servidores fáceis de usar, como o HOPE³⁹ , fornecerão informações sobre o efeito da variante por modelagem molecular. Além disso, uma revisão abrangente da literatura sobre a proteína de interesse é fundamental para identificar e integrar as informações sobre mutações associadas à epilepsia.
   3. Análise da conservação evolutiva e insights estruturais
      1. Abra o Jalview 42,43,44, um programa de código aberto para edição, visualização e análise de proteínas.
      2. Importe sequências para alinhamento. Clique em Arquivo no menu superior | Buscar sequências; selecione o banco de dados na caixa de diálogo (como UniProt); clique na guia recuperar IDs; e, conforme descrito na caixa de diálogo, insira os IDs de acesso UniProt do gene de interesse (GABRG2) de espécies humanas e de outros vertebrados: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Clique em OK.
         NOTA: Os números de acesso UniProt de proteínas codificadas por GABRG2 são os seguintes: P18507 (P18507-2) para Homo sapiens, P22723 para Mus musculus, A0A2I3TKX0 para Pan troglodytes, F1RR72 para Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 para Canis familiaris e A0A8M1P4D6 para Danio rerio.
      3. Dependendo do gene de interesse, algumas sequências podem não ser anotadas; portanto, realize uma pesquisa BLAST para identificar informações relevantes e potenciais homólogos para uma melhor compreensão contextual. Nesse caso, carregue o formato FASTA de sequências de proteínas por meio da opção Adicionar sequências/caixa de texto De no menu Arquivo para produzir vários alinhamentos de sequência das sequências desejadas.
      4. Depois que o alinhamento for carregado, observe as sequências exibidas para comparação de várias sequências. Cada linha representa uma sequência e cada coluna representa uma posição no alinhamento. Para determinar o melhor método de alinhamento, use diferentes abordagens; por exemplo, clique nos serviços da Web no menu Sequência e selecione a opção Executar T-Coffee com predefinição , que permite o alinhamento ideal.
      5. Clique com o botão direito do mouse na sequência P18507 Homo sapiens (a sequência de referência no presente estudo) e defina-a como a sequência de referência. Escolha Formatar no menu superior e clique em Wrap para a visualização do alinhamento completo na tela. No mesmo menu Formatar, clique na escala acima para aprimorar a visualização de números de resíduos específicos. Para melhorar ainda mais a visualização, ajuste os esquemas de cores acessando Cor e selecionando diferentes opções (por exemplo, Cor Clustal, Propriedade Química); Modifique o tamanho da fonte, se necessário.
      6. Clique em Calcular na barra de menus e selecione Calcular consenso automaticamente para destacar as regiões conservadas.
      7. Concentre-se na posição das variantes de interesse identificadas na etapa de previsão in-silico e examine as posições específicas das variantes. Anote resíduos específicos clicando com o botão direito do mouse neles e selecionando Adicionar anotação. Escreva o rótulo (por exemplo, ID da variante) com o código de cor apropriado e salve.
         NOTA: Na presente análise, P302L (roxo) e A303T (vermelho) foram selecionados para visualizá-los no alinhamento de sequências múltiplas junto com os dados estruturais (consulte a próxima seção).
   4. Reconstrução tridimensional da proteína completa mostrando os resíduos conservados selecionados
      1. No arquivo obtido na etapa anterior, clique com o botão direito do mouse na sequência de referência (GABRG2 humano) e selecione os dados da estrutura 3D.
      2. Identifique os dados estruturais apropriados (7QNE, Cadeia C)²⁶ no menu suspenso e selecione Abrir nova visualização de estrutura com Jmol.
         NOTA: Isso permitirá a incorporação dos resíduos selecionados no alinhamento de sequências múltiplas nos dados estruturais pelo Jmol, um visualizador baseado em Java de código aberto para estruturas químicas 3D.

2. Seleção de parâmetros e modelação biofísica

1. Meta-análise específica da variante e normalização de parâmetros
   1. Pesquise a literatura atual para reunir variantes de subunidades identificadas com condutância eletrofisiológica do canal de dados (g_GABAA), tempo de desativação (_{τ desativação}), tempo de subida (τ_aumento) e amplitude máxima da corrente (I_máx.). Forneça as composições de subunidades, tipo de célula e medidas de tipo selvagem para cada caso. Rotule as variantes e seus controles de acordo (por exemplo, conhecido para variantes com características biofísicas identificadas e controle conhecido para as medições do tipo selvagem para cada variante).
   2. Obtenha pontuações de patogenicidade AlphaMissense para variantes com características biofísicas identificadas.
      NOTA: Consulte a seção 1.3 do protocolo para obter mais detalhes.
   3. Crie um quadro de dados com subunidade e posição de aminoácidos para cada variante, os aminoácidos originais e alterados, pontuação de patogenicidade e parâmetros biofísicos obtidos da literatura. Para evitar discrepâncias experimentais, normalize os parâmetros biofísicos para variantes identificadas como mudanças de x vezes em medições de tipo selvagem.
2. Análise comparativa de variantes por características estruturais e funcionais
   1. Organize as variantes previstas em um quadro de dados; rotular de acordo (por exemplo, previsto para variantes sem literatura disponível sobre suas características biofísicas).
   2. Classifique as variantes por sua localização na sequência de aminoácidos e estrutura terciária. Adicione parâmetros de classificação estrutural (por exemplo, localização em alfa-hélices, bobinas, folhas beta, domínios extracelulares, intracelulares ou transmembrana, revestimento de poros, ligação de agonistas, interações proteína-proteína) no quadro de dados e forneça informações para cada variante em relação à sua posição de aminoácido.
   3. Classifique as variantes por sua distância ao centro da membrana e ao eixo dos poros. Adicione os parâmetros distância ao eixo dos poros e distância ao centro da membrana no quadro de dados.
   4. Analise a correlação entre parâmetros estruturais e biofísicos em relação a variantes conhecidas. Se possível, avalie as variantes previstas em relação às correlações obtidas.
3. Construção de modelos de sinapses e neurônios
   1. Use o Brian2⁴⁵, um simulador neural de código aberto desenvolvido em Python para modelar e simular redes neurais de pico, para construir um modelo biofísico multicompartimental da sinapse GABAérgica em um neurônio piramidal do hipocampo baseado em condutância multicompartimental.
   2. Projete o modelo baseado em condutância definindo a cinética de passagem do canal iônico, parâmetros passivos e ativos e condutâncias pós-sinápticas. Defina o modelo baseado em condutância conforme fornecido no Arquivo Suplementar 2, que descreve as equações usadas no modelo.
      1. Defina a capacitância da membrana (C_m) como 1 μF / cm² e a resistência intracelular (R_a) como 200 Ω.cm.
      2. Use as condutâncias modificadas do tipo Hodgkin-Huxley para neurônios piramidais do hipocampo³⁹ com g_L = 0,0003 S / cm², g_K = 0,036 S / cm²_{, EL =} -76,5 mV, E_Na = 50 mV_{e EK =} -90 mV.
      3. Ajuste a distribuição de densidade dos canais de Na_V sobre g_Na como 0,05 S / cm² para soma, 0,5 S / cm² para segmento inicial de axônio (AIS) e nó de Ranvier (NR) e 0,005 S / cm² para dendritos. Defina g_K e g_Na como 0 em segmentos mielinizados.
      4. Construa a cinética de passagem do canal iônico para Na_{V e KV conforme} descrito no Arquivo Suplementar 2.
      5. Introduza as correntes sinápticas (I_syn) como a soma de todas as sinapses glutamatérgicas e GABAérgicas em um compartimento. Inclua a corrente mediada pelo receptor AMPA rápida (I_AMPA) e a corrente mediada pelo receptor NMDA lenta (I_NMDA) na corrente glutamatérgica (I_glu). Inclua apenas corrente rápida mediada pelo receptor GABA_A na corrente GABAérgica (I_GABA). Suponha que uma quantidade constante de glutamato seja liberada para a sinapse para cada pico pré-sináptico; portanto, a ativação dos receptores é dependente do tempo de pico (s_AMPA e s_NMDA) e as condutâncias totais do receptor (g_AMPA e g_NMDA) refletem a quantidade de glutamato que é liberada por cada evento.
      6. Use o modelo sináptico conforme descrito no Arquivo Suplementar 2.
         NOTA: Para obter uma explicação detalhada das equações, consulte o Arquivo Suplementar 2 que descreve as equações usadas no modelo.
   3. Obtenha o diâmetro medido experimentalmente para soma e neuritos e o comprimento de cada compartimento de neuritos e padrões de ramificação da literatura anterior^46,47. Reduza a morfologia real do neurônio em um modelo multicompartimental, dividindo a célula em vários compartimentos, que preserva com precisão a estrutura de ramificação principal e mantém a simetria bilateral.
   4. Defina o morfológico (comprimento e diâmetro do segmento; ou seja, d_soma: 30 μm; l_AH: 5 μm; d_AH_i: 1,5 μm; d_AH_f: 1,3 μm; l_AIS: 40 μm; d_axon: 1 μm; l_myseg: 100 μm; l_NR: 2 μm; l_AxTer: 4 μm; d_AxTer: 2 μm; l_approx: 100 μm; l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i: 4 μm; d_approx_f: 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis: 2 μm; l_apLM: 70 μm; d_apLM: 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal: 1,4 μm; l_nAcDbasal_stem: 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1,5 μm) e parâmetros biofísicos (conforme indicado na seção 2.3.2) para cada compartimento do modelo de neurônio piramidal^46,47, conforme também detalhado no script Python (Arquivo Suplementar 3: GABAAvar.py).
   5. Determine os parâmetros biofísicos para o modelo de sinapse GABAérgica avaliando as medições de controle do tipo selvagem obtidas na etapa 2.1.1.
4. Projetar a topologia do modelo de neurônios e atribuir parâmetros morfológicos e biofísicos, o que inclui especificar o arranjo espacial e as interconexões dos compartimentos, com base nas informações morfológicas e de ramificação obtidas anteriormente. Atribua os parâmetros morfológicos (por exemplo, comprimento e diâmetro do segmento) e biofísicos apropriados (Seção 2.3.2) a cada compartimento do modelo, conforme descrito no Arquivo Suplementar 3: GABAAvar.py.
5. Construção de sinapses e injeção de corrente
   1. Crie a atividade pré-sináptica usando SpikeGeneratorGroup (uma classe da biblioteca Brian2) conforme fornecido em "GABAAvar.py" (Arquivo Suplementar 3). Conecte o gerador de pico ao compartimento alvo do neurônio modelo usando a classe Synapses para modelar conexões sinápticas.
   2. Defina uma corrente constante sustentada (I_inj) como 0,85 nA e coloque no soma para imitar a atividade subliminar impulsionada pela carga de corrente iônica de linha de base em um determinado momento, conforme descrito no Arquivo Suplementar 3: GABAAvar.py.
6. Para criar monitores de gravação, registre rastreamentos de tensão de compartimentos de destino usando StateMonitor.
7. Construa e execute a rede.
   1. Construa a rede com o neurônio modelo, conexões e monitores usando Network.
   2. Defina o intervalo de tempo da simulação por defaultclock.dt (por exemplo, 0,01 ms).
   3. Execute a simulação na rede com network.run(T*ms), em que T é definido como 1.000 ms no exemplo.
8. Testando o impacto das mutações missense do receptor GABA_A
   1. Defina o impacto de cada mutação missense na cinética do canal por meio dos parâmetros biofísicos coletados na etapa 2.1.1.
   2. Execute a estimulação alterando esses parâmetros e plote os resultados usando "matplotlib.pyplot" conforme fornecido em "GABAAvar.py" (Arquivo Suplementar 3).
9. Teste combinações de parâmetros para analisar as mudanças nos padrões e taxas de disparo. Plote os resultados para comparações.

Results

Este estudo utiliza uma abordagem multiescala para prever e caracterizar as variantes patogênicas na subunidade γ2 do receptor GABA_A , um componente chave na fisiopatologia da epilepsia. Por meio do uso de modelos preditivos, modelagem molecular, conservação evolutiva, exame estrutural, análise de correlação e simulações neurais, essa abordagem aprimora a classificação de variantes, com relevância significativa para a pesquisa de epilepsia e possivelmente para uso clínico. O re...

Discussion

Ao aplicar uma combinação de genética computacional, modelagem molecular e simulações neurais, a abordagem apresentada neste artigo tem o potencial de melhorar a classificação das variantes do receptor GABA_A, oferecendo informações valiosas para pesquisas sobre epilepsia e aplicações clínicas. Uma análise abrangente para a identificação e priorização de mutações patogênicas previstas é apresentada e estendida em uma estrutura que potencialmente preenche a lacuna entre os efeit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brian2	Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, França; Imperial College London, Reino Unido	2.8.0.4	Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/)
servidor dbNSFP	Genos Bioinformatics LLC, EUA	v3.0	Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
ESPERANÇA	Centro de Informática Molecular e Biomolecular CMBI, Universidade Radboud, Holanda	1.1.1	Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview	Universidade de Dundee, Reino Unido	JV2	Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter Notebook	Projeto Jupyter, EUA		https://jupyter.org/install
Phyton	Python Software Foundation, EUA	3.13	https://www.python.org/downloads/
Protter	ETH Zurique, Suíça	Versão 1.0	Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R	Fundação R para Computação Estatística, EUA	R versão 4.3.2	https://www.r-project.org/
RStudio	Posit software, PBC, EUA	RStudio 2023.12.1+402 Lançamento "Ocean Storm"	https://posit.co/downloads/