Artigo de método

Desenvolvimento e Avaliação de Modelos de Infecção Intracelular para Staphylococcus aureus

DOI:

10.3791/67834

⸱

17 de janeiro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Research Institute, Southwest University, 2National Engineering Research Center of Immunological Products, Third Military Medical University, 3School of Pharmacy, University of South China

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus (S. aureus) tem a capacidade de se disseminar por todo o corpo, causando infecções persistentes e recorrentes. Para melhor compreender esses processos, este estudo estabelece um modelo de infecção intracelular para S. aureus. Este modelo fornecerá uma base crucial para investigar os mecanismos por trás das infecções intracelulares.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus pode invadir e persistir dentro das células hospedeiras, incluindo células imunes, o que permite que ele escape da detecção e eliminação imunológica. Essa persistência intracelular contribui para infecções crônicas e recorrentes, dificultando o tratamento e prolongando a doença. Consequentemente, há uma necessidade crítica de um modelo de infecção intracelular para melhor entender, prevenir e tratar infecções causadas por S. aureus. Este estudo indicou que os antibióticos eliminaram efetivamente as bactérias extracelulares, mas não conseguiram erradicar aquelas que entraram nas células. Assim, uma infecção intracelular estável in vitro foi estabelecida por RAW264.7 infectados com S. aureus e co-cultivando-os com antibióticos. Posteriormente, um modelo de infecção intracelular em camundongos foi estabelecido pela injeção de macrófagos peritoneais contendo a infecção intracelular. A vancomicina eliminou efetivamente as cargas bacterianas em camundongos desafiados com S. aureus planctônico; no entanto, foi ineficaz contra camundongos infectados com níveis iguais ou inferiores de bactérias intracelulares dentro dos macrófagos peritoneais. Isso indica que o modelo de infecção intracelular de S. aureus foi estabelecido com sucesso, oferecendo insights potenciais para a prevenção e tratamento de infecções intracelulares.

Introdução

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S. aureus é um patógeno altamente contagioso que pode causar uma série de infecções, incluindo infecções de pele e tecidos moles, sepse, meningite, pneumonia e endocardite1. O uso clínico indevido de antibióticos levou ao aumento da resistência em S. aureus e ao surgimento de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), que representa uma ameaça significativa à saúde pública em muitos países2.

Embora o S. aureus não seja tradicionalmente classificado como um patógeno intracelular, evidências emergentes sugerem que ele pode colonizar persistentemente as células hospedeiras após a invasão3. A capacidade de S. aureus de sobreviver intracelularmente dentro dos fagócitos do hospedeiro é cada vez mais reconhecida como um mecanismo que facilita a infecção metastática e a disseminação por todo o hospedeiro 4,5,6. O S. aureus secreta vários fatores de virulência, que criam um ambiente imunológico que promove sua sobrevivência e complica a capacidade do hospedeiro de eliminá-lo totalmente7. O regulador do gene acessório (agr) e os elementos auxiliares estafilocócicos (Sae) são dois importantes reguladores de virulência que estão intimamente relacionados à sobrevivência de Staphylococcus aureus em fagócitos 8,9. O sistema agr é um mecanismo de detecção de quorum que regula a expressão de vários fatores de virulência em S. aureus. Controla a produção de toxinas e outros fatores que facilitam a sobrevivência e disseminação bacteriana. Durante a infecção intracelular, o sistema agr desempenha um papel crítico na regulação dos fatores de virulência que são essenciais para a capacidade da bactéria de escapar das respostas imunes do hospedeiro e sobreviver dentro das células hospedeiras. Estudos mostraram que o sistema agr influencia a capacidade da bactéria de escapar dos fagossomos e persistir dentro dos macrófagos. A ausência de agr pode levar à redução da sobrevivência bacteriana dentro das células hospedeiras e diminuição da virulência10,11. O sistema Sae é um sistema regulatório de dois componentes que controla a expressão de vários fatores de virulência em S. aureus. Está envolvido na regulação de toxinas e enzimas que contribuem para a capacidade da bactéria de invadir e danificar os tecidos do hospedeiro. O sistema Sae também desempenha um papel crucial na sobrevivência intracelular de S. aureus. Influencia a capacidade da bactéria de resistir à morte pelos fagócitos do hospedeiro e evitar a degradação autofágica 12,13.

Quando os patógenos invadem, os macrófagos têm funções fagocíticas, que podem engolir e matar patógenos estranhos e ativar a resposta imune adaptativa14. A maioria das bactérias invasoras é fagocitada por macrófagos, que então ativam vários mecanismos de morte para eliminá-los. No entanto, algumas bactérias S. aureus podem sobreviver dentro de macrófagos, levando à infecção persistente do hospedeiro. Além das proteínas bacterianas, o hospedeiro também afeta a sobrevivência e proliferação de S. aureus dentro dos macrófagos pela secreção de citocinas 15,16,17. Alguns estudos indicam que o S. aureus pode evitar a degradação residindo em autofagossomos, criando um nicho intracelular que promove a disseminação18. S. aureus escapa da degradação autofágica bloqueando o fluxo de autofagia (por exemplo, LC3-II, p62) e aumentando o pH dentro dos autolisossomos após a invasão de macrófagos19. Essa evasão imunológica é alcançada por meio da regulação dos fatores de virulência e autofagia de S. aureus, levando a infecções persistentes e ocultas.

A eliminação de infecções intracelulares de S. aureus é crucial para o manejo de infecções persistentes e latentes na prática clínica. Atualmente, os antibióticos são o tratamento primário para infecções por S. aureus, sendo a vancomicina a última linha de defesa para infecções por MRSA20,21. No entanto, numerosos estudos mostraram que os antibióticos existentes são ineficazes na eliminação intracelular de S. aureus, tanto in vivo quanto in vitro 22,23,24.

Atualmente, não existe um padrão unificado para os vários modelos de infecção intracelular de S. aureus 25,26,27, pois as condições de cada modelo diferem significativamente. Consequentemente, os mesmos critérios não podem ser aplicados para avaliar a eficácia desses modelos. Neste estudo, estabelecemos um modelo universal de infecção intracelular de Staphylococcus aureus, otimizando as condições experimentais. Este modelo oferece maior comodidade em comparação com outros, pois permite a infecção inicial de bactérias em células in vitro, seguida pela entrega dessas células infectadas no corpo.

Para entender melhor os mecanismos da infecção intracelular por S. aureus e desenvolver drogas relacionadas, estabelecemos modelos in vitro e in vivo . Um modelo de infecção intracelular estável foi criado com sucesso in vitro infectando RAW264.7 e co-cultivando-os com antibióticos. Em seguida, os macrófagos peritoneais foram extraídos e formados em infecções intracelulares. Um modelo de infecção intracelular em camundongos foi estabelecido pela injeção desses macrófagos peritoneais.

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Protocolo

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Animais experimentais, camundongos BALB/c fêmeas livres de patógenos específicos (SPF) de 6 a 8 semanas de idade, foram adquiridos da Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Pequim, China). Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar e foram realizados de acordo com as políticas e diretrizes institucionais e nacionais para o uso de animais de laboratório. Os camundongos foram mantidos e vacinados em instalações do SPF e receberam acesso gratuito a alimentos e água estéreis. Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos e receberam um tempo de adaptação de pelo menos 7 dias antes do início dos experimentos.

1. Preparação para S. aureus

  1. Recuperação de cepa: Obtenha um tubo de MRSA252 congelado, cauterize e resfrie o anel de inoculação para obter um anel de solução bacteriana, inocule as bactérias em placas de ágar soja tríptica (TSA) (consulte a Tabela de Materiais) pelo método da placa de estrias28 e cultive durante a noite a 37 ° C.
  2. Ativação bacteriana: No dia seguinte, pegue um frasco shaker de 50 mL e adicione 20 mL de meio de caldo de soja tríptico (TSB) (consulte a Tabela de Materiais). Escolha uma única colônia com uma ponta de pipeta de 10 μL e adicione-a ao agitador. Incubar as colônias durante a noite a 220 rpm, 37 ° C.
  3. Ativação secundária: No dia seguinte, pegue um frasco agitador de 50 mL contendo 15 mL de meio TSB. Retirar 200 μl de solução bacteriana do agitador que contém a primeira bactéria activada, adicionar a um novo frasco contendo 20 ml de meio TSB e incubar a 220 rpm, a 37 °C, durante 4 h.
  4. Colete a solução bacteriana ativada secundária em um tubo de centrífuga de 50 mL, centrifugue a 3.000 x g por 10 min e descarte o sobrenadante.
  5. Ressuspenda as bactérias precipitadas em 10 mL de solução salina e centrifugue a 3.000 x g por 10 min. Repita esta etapa 2X.
  6. Meça o valor de OD600 da solução bacteriana e ajuste-o para 1,0 com solução salina. Neste momento, a quantidade bacteriana de MRSA252 neste experimento foi de 1,0 x 109 UFC/mL.
    NOTA: A solução bacteriana é adicionada a um meio sem antibióticos e diluída até a concentração desejada; Todas as bactérias utilizadas neste experimento foram preparadas pelo método acima.

2. Estabelecimento de modelo de infecção intracelular in vitro

  1. Preparação de células RAW264.7
    NOTA: As linhagens celulares utilizadas neste estudo foram obtidas do ATCC. Todas as linhagens celulares testaram negativo para contaminação por micoplasma. Todos os experimentos foram realizados em células na fase de crescimento logarítmico.
    1. Retirar as células do azoto líquido e descongelá-las num banho-maria a 37 °C.
    2. Coloque as células RAW264.7 em um tubo de centrífuga de 15 mL, adicione 2 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM; ver Tabela de Materiais) suplementado com 10% de soro fetal bovino (ver Tabela de Materiais), penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 μg/mL; ver Tabela de Materiais; meio completo) a 37 ° C em 5% de CO2. Centrifugue a 300 x g por 5 min.
    3. Semeie 3 x 106 células RAW264,7 em placas de 100 mm com 10 mL de meio completo. Conservar durante 12 h numa incubadora de cultura celular a 37 °C a 5% de CO2 , de modo a que a confluência das células se situe entre 50% e 60%.
  2. Infecção intracelular in vitro
    1. Pegue 10 μL de suspensão celular e adicione-o ao contador de células para calcular a concentração celular. Conte e semeie 2 x 105 células RAW264.7 em uma placa de 24 poços (consulte a Tabela de Materiais) usando 1 mL de meio completo para cada poço e mantenha-o em uma incubadora de cultura de células por 10-12 h.
    2. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de meio completo contendo 2 x 106 solução bacteriana UFC (etapa 1.6) a cada poço. Coloque-o na incubadora de cultura de células por 2 h. A multiplicidade MRSA252 infectada de infecção
      (MOI) é 10. (Para verificar a correlação entre vários valores de multiplicidades de infecção (MOI) e a fagocitose de bactérias por células, estabelecemos grupos experimentais com valores de MOI de 20, 30, 40 e 50.).
      NOTA: O meio completo usado para infectar células não contém penicilina e estreptomicina.
    3. Remova o sobrenadante e lave as células 2x com PBS (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 800 μL por alvéolo de DMEM com 100 μg/mL de gentamicina (ver Tabela de Materiais) e coloque na incubadora de células a 37 °C em 5% de CO2 por 2 h.
  3. Avaliação do modelo de infecção intracelular in vitro
    1. Ensaio intracelular de morte de S. aureus
      1. Colete as células RAW264.7 (etapas 2.2.2 e 2.2.3) separadamente em tubos de centrífuga. Lave as células 2x com PBS, adicione 0,1% de solução Triton X-100 (consulte a Tabela de Materiais) a cada tubo por 5 min e colete o lisado nos tubos da centrífuga.
      2. Use PBS para diluir o lisado em série. Pegue 20 μL de lisado e adicione-o a um tubo de microcentrífuga contendo 180 μL de PBS, depois misture bem por pipetagem. Dilua passo a passo seguindo este procedimento. Identificar cada diluição do lisado em placas TSA e incubar durante a noite a 37 °C. Contar as colónias nas placas TSA para lisado (figura 1A).
        NOTA: Além disso, investigamos as condições experimentais ideais para infecção intracelular de MRSA252 em macrófagos peritoneais. A carga bacteriana em macrófagos peritoneais infectados com MRSA252 e tratados com concentrações variáveis de gentamicina é mostrada na Figura 1B, enquanto a carga bacteriana após o tratamento com 100 μg/mL de gentamicina por diferentes durações é mostrada na Figura 1C.
      3. Diluir o sobrenadante e o lisado em série com PBS, conforme descrito no ponto 2.3.1.2, e observar as colónias nas placas TSA para o sobrenadante e o lisado (figura 2A).
    2. Microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)
      1. Dilua as células RAW264.7 (etapa 2.2) em 2 x 105 células/mL em uma placa de Petri confocal (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-as em uma incubadora de células para adesão durante a noite a 37 ° C em 5% de CO2. Adicionar 1 mL de meio completo contendo 2 x 106 UFC e 4 x 106 solução bacteriana (passo 1.6) a cada placa de Petri confocal e colocá-la na incubadora de células por 2 h, perfazendo o MOI 10 e 20, respectivamente.
      2. Remova o sobrenadante e lave as células 3x com PBS, adicione 100 μg / mL de gentamicina DMEM por 2 h e remova as bactérias extracelulares. Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células 2x com PBS, adicione fluido de trabalho DIL (consulte a Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 5 min no escuro.
      3. Remova o fluido de trabalho DIL e lave 3x vezes com PBS e fixe com solução de paraformaldeído a 4% (consulte a Tabela de Materiais) por 20 min.
      4. Remova a solução de paraformaldeído e lave 3x com PBS, adicione o corante DAPI (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 5 min no escuro. Remova a solução de corante DAPI e lave 5x com PBS. Use CLSM para observar células (Figura 2B).
        NOTA: Este trabalho usado MRSA252 projetado com uma proteína fluorescente verde (GFP), que foi construída usando o método de recombinação homóloga29.

3. Estabelecimento de modelo de infecção intracelular in vivo

  1. Aquisição de macrófagos peritoneais em camundongos
    1. Prepare caldo de amido a 6%. De acordo com a proporção de massa 3:10:5 (p/p), adicione três tipos de excipientes (extrato de carne em pó, triptona, cloreto de sódio; ver Tabela de Materiais) sucessivamente no recipiente de vidro. Adicione 1 L de ddH2O a um recipiente de vidro, mexa para derreter e aqueça no microondas. Adicione amido solúvel (consulte a Tabela de Materiais) com uma proporção de massa de 6, mexa para derreter e certifique-se de autoclave o recipiente de vidro a 121 ° C por 30 min. Conservar no frigorífico a 4 °C até formar uma pasta.
    2. Colete macrófagos peritoneais de camundongos seguindo as etapas descritas abaixo.
      1. Escolha dois ratos Balb / c. Use a mão esquerda para agarrar o pescoço do mouse e controlar a cauda. Vire o mouse e abaixe a cabeça e o abdômen para cima (Figura 3A). Administre injeção intraperitoneal de caldo de amido a 6%, 3 mL por camundongo (Figura 3B).
        NOTA: Devido à gravidade, os órgãos da cavidade abdominal cairão para trás em direção ao tórax, evitando que a seringa machuque outros órgãos.
      2. Após 72 h, anestesiar os camundongos com isoflurano a 3% e depois sacrificá-los por luxação cervical. Desinfete-os com álcool etílico 75%. Use uma tesoura oftálmica para abrir o abdômen do camundongo para expor totalmente seu peritônio (Figura 4A-C).
      3. Injete 10 mL de meio DMEM nos camundongos para lavar a cavidade abdominal por injeção intraperitoneal ( Figura 4D ). Depois de injetar DMEM na cavidade abdominal dos camundongos, esfregue o abdômen dos camundongos suavemente por cerca de 1 minuto para lavar o abdômen mais completamente. Use uma seringa para coletar o fluido de lavagem em um tubo de centrífuga de 50 mL (Figura 4E).
      4. Centrifugue o fluido de lavagem a 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
      5. Use 10 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 μg/mL; meio completo) para soprar e aspirar as células coletadas, contá-las e diluir a concentração celular para 2 x 106/mL e colocar em placas de 6 poços (ver Tabela de Materiais), 1 mL por poço.
      6. Colocar a placa de 6 poços a 37 °C em CO2% a 5%, incubar durante 4 h e retirar o sobrenadante. Lave as células 2x com PBS estéril e cultive durante a noite com 1 mL de DMEM por poço a 37 ° C em 5% de CO2.
  2. Preparação de bactérias intracelulares
    1. Incubar os macrófagos peritoneais (etapa 3.1.2) com MRSA252 por 2 h. Remova o sobrenadante e lave as células 2x com PBS. Adicionar meio completo DMEM com 100 μg/ml de gentamicina (1 ml por alvéolo) e incubar durante 2 h a 37 °C em 5% de CO2.
    2. Remova o sobrenadante e lave as células 3x com PBS. Use um raspador de células para coletar macrófagos peritoneais de camundongos em tubos de centrífuga de 50 mL, centrifugue a 300 x g por 5 min. As bactérias intracelulares de MRSA252 foram preparadas com sucesso em macrófagos peritoneais.
    3. Para o cálculo de bactérias intracelulares, aos macrófagos peritoneais infectados com MRSA252 intracelular, adicione lisozima (10 μg / mL, consulte a Tabela de Materiais) a 37 ° C por 10 min e depois lave com PBS 2x. Em seguida, adicione 1 mL de PBS para ressuspender as células. Lise as células adicionando 0,1% de Triton X-100 por 5 min.
    4. Diluir a lise com diluições em série e colocá-la numa placa TSA. Cultura durante a noite a 37 °C. Calcule as bactérias intracelulares de MRSA252 em macrófagos peritoneais, que eram 1,8 x 106 UFC por camundongo, contando as colônias bacterianas.
      NOTA: Quando o raspador de células coleta células, a ação deve ser suave. As células são raspadas em uma direção para evitar a quebra celular, o que pode afetar o experimento subsequente.
  3. Infecção bacteriana intracelular em camundongos
    1. Divida aleatoriamente 20 camundongos Balb / c em quatro grupos (n = 5, Figura 5A).
    2. Para o Grupo I, injetar 3 x 106 UFC MRSA252 planctônicos por camundongo por injeção intravenosa. Para o Grupo II, injetar 3 x 106 UFC MRSA252 planctónico e vancomicina (110 mg/kg; ver Tabela de Materiais) por ratinho por injeção intravenosa. Para o Grupo III, injetar as bactérias intracelulares (preparadas na etapa 3.2) por injeção intravenosa. Para o Grupo IV, injetar as bactérias intracelulares (preparadas na etapa 3.2) e vancomicina (110 mg/kg) por camundongo por injeção intravenosa.
    3. Coloque os ratos sob a lâmpada de fisioterapia infravermelha até que as veias da cauda fiquem dilatadas.
    4. Injetar por via intravenosa 3 x 106 UFC MRSA252 planctônicos por camundongo do Grupo I e Grupo II. Injetar por via intravenosa as bactérias intracelulares (preparadas no passo 3.2) por ratinho do Grupo III e do Grupo IV.
      NOTA: Ao usar uma seringa para coletar líquido contendo bactérias intracelulares, recomenda-se primeiro misturar suavemente o líquido uniformemente com uma pipeta para garantir níveis consistentes de infecção em todos os camundongos.
    5. Após 30 minutos, injete vancomicina por via intravenosa no Grupo II e no Grupo IV por camundongo.
  4. Avaliação do modelo de infecção intracelular in vivo
    1. Avaliar o modelo de infecção intracelular de camundongos por meio da contagem da colonização de bactérias nos rins. Após 24 h de injeção, anestesiar os camundongos com isoflurano a 3% e sacrificá-los por luxação cervical. Desinfete-os em álcool etílico 75%.
    2. Imobilize os camundongos, levante a pele abdominal com uma pinça com uma mão, corte a pele abdominal do camundongo com uma tesoura oftálmica com a outra mão, encontre os rins na cavidade abdominal e retire completamente os rins. Coloque-os na PBS.
    3. Adicione 1 mL de PBS ao tubo de moagem de tecido. Transfira os rins de cada camundongo para tubos de moagem separados e triture até que não reste nenhum tecido sólido. Despeje o tecido homogeneizado em tubos EP individuais e rotule cada tubo com a identificação do mouse correspondente.
    4. Use PBS para diluir em série o homogeneizado de tecido. Colocar cada diluição em placas TSA separadas e incubar durante a noite a 37 °C. Conte as colônias e analise os dados (Figura 5B).

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Resultados

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Modelos de infecção intracelular de S. aureus foram estabelecidos com sucesso in vitro e in vivo. Otimizando as condições experimentais para fagocitose e estendendo a concentração e a duração do tratamento com antibióticos, alguns S. aureus sobreviveram dentro dos macrófagos (Figura 1). Para avaliar melhor a resistência a antibióticos de S. aureus, os macrófagos infectados com o MRSA252 foram tratados com antibióti...

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Discussão

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S. aureus, como patógeno intracelular facultativo, pode invadir e sobreviver em vários tipos de células, usando essa capacidade de escapar de antibióticos e respostas imunes durante a infecção30. Este estudo estabeleceu um modelo de infecção intracelular de S. aureusin vivo para fornecer uma base para investigar os mecanismos de infecção intracelular do patógeno. Ao explorar o impacto de vários valores de MOI na fagocitose de macrófagos de S....

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, Grant No.32300779, NO.32270989), Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0156), Projeto de Pesquisa em Ciência e Tecnologia da Comissão de Educação de Chongqing (KJQN202312802) e Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China (2024M754250).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 24 poçosCorning Incorporated, EUA3524
Solução de paraformaldeído a 4BBI, Reino UnidoE672002-0500
Placa de 6 poçosCorning Incorporated, EUA3516
Extrato de carne em póBBI, Reino UnidoA600114-0500
Equipamento de segurança de risco biológicoForça de cura, ChinaVS-1300L-u
Incubadora de célulasESCO, CingapuraCCL-170B-8
Raspador de célulasNest710001
Centrifuge M1416RRWD, ChinaM1416R
Tubo de centrífugaGuanghou Labselect, ChinaCT-002-50A
Microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)Zeiss, Alemanha880
Placade Petri confocalBiosharp, ChinaBS-20-GJM
DAPI coranteShanghai Beyotime, China DIL C1006
Shanghai Beyotime, China C1991S
Dulbecco' s Modified Eagle MediumThermo Gibco, EUAC11995500BT
Hyclonebovino fetalSV30208.02
GentamycinShanghai Sangon, ChinaB540724-0010
IncubadoraShanghai Hengzi, ChinaHDPF-150
LysozymeBeijing Solarbio, ChinaL9070
MRSA252Terceiro Militar Universidade Médica, Chinanull
MRSA252(GPF)Third Military Medical University, Chinanull
Penicilina e EstreptomicinaShanghai Beyotime, China C0222
Solução Tampão de FosfatoShanghai Beyotime, China ST476
SalinoSichuan Kelun, Chinanulo
Cloreto de sódioShanghai Macklin, ChinaS805275
Solúvel em amidoShanghai Sangon, ChinaA500904-0500
Triton X-100Shanghai Beyotime, China P0096-100ml
Placas de ágar tripta de soja (TSA)Pequim AOBOX Biotechnology Co., LTD, China02-130
Caldo de soja tríptico (TSB) médioPequim AOBOX Biotechnology Co., LTD, China02-102K
TriptonaOXOID, Reino UnidoLP0042B
VancomicinaXangai Beyotime, China ST2807-250mg
RAW264.7 célulaEUA, ATCCnulo
% Fluido de trabalho de soro

Referências

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