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Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

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DOI:

10.3791/67846

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24 de janeiro de 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Resumo

O tecido adiposo é composto principalmente de adipócitos maduros e carregados de lipídios em volume. Essas células pós-mitóticas desempenham um papel crítico no armazenamento e mobilização de energia, termorregulação e secreção de fatores endócrinos. A expansão do tecido adiposo branco devido ao desequilíbrio calórico resulta tanto no aumento dos adipócitos existentes quanto na geração de adipócitos adicionais a partir de células progenitoras de adipócitos. As alterações causadas pela obesidade no tecido adiposo branco, incluindo aquelas que afetam os adipócitos, estão associadas a inúmeras comorbidades, como diabetes tipo 2 e 13 tipos de câncer. Uma barreira significativa para estudar como os adipócitos contribuem para a doença é a incapacidade de isolar e cultivar prontamente adipócitos maduros. Este artigo descreve um protocolo para isolar adipócitos magros e obesos murinos dos depósitos de gordura subcutânea e visceral de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas. O protocolo detalha como os adipócitos primários isolados podem ser cultivados em um sistema agregado de adipócitos de membrana por até 2 semanas, facilitando sua análise funcional em experimentos de co-cultura, ensaios de lipólise ou por meio da coleta de meios condicionados contendo fatores secretados por adipócitos. Além disso, o protocolo descreve métodos para cultura de explantes de tecido adiposo em cúpulas de matriz de membrana basal e imagens de adipócitos isolados primários. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser integrada aos protocolos existentes para o isolamento de células progenitoras de adipócitos residentes no tecido adiposo usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Juntos, esses protocolos fornecem aos pesquisadores ferramentas para estudar funcionalmente adipócitos, células progenitoras de adipócitos e tecido adiposo total de camundongos magros e obesos, machos e fêmeas.

Introdução

Espera-se que a prevalência de obesidade adulta nos Estados Unidos atinja 50% até 20301, tornando imperativo entender melhor os efeitos celulares e fisiológicos da obesidade. A obesidade é caracterizada pelo desequilíbrio calórico, resultando na expansão do tecido adiposo branco devido ao aumento do armazenamento de energia na forma de gordura. A expansão do tecido adiposo pode ocorrer tanto pela geração de novos adipócitos (hiperplasia) quanto pelo aumento do tamanho dos adipócitos existentes (hipertrofia). Embora ambos os processos resultem na expansão do tecido adiposo, a expansão hipertrófica coincide com redução da saúde metabólica e maior incidência de distúrbios metabólicos 2,3. Uma melhor compreensão das complexidades do tecido adiposo fornecerá informações sobre os mecanismos moleculares que regulam os distúrbios metabólicos e outras comorbidades relacionadas à obesidade, incluindo diabetes tipo 2 e câncer.

O tecido adiposo tem sido apreciado há muito tempo por seu papel no armazenamento de energia e termorregulação. Mais recentemente, no entanto, o tecido adiposo emergiu como um importante tecido sinalizador metabólico, responsável pela secreção de metabólitos, lipídios e peptídeos 4,5. Essas moléculas derivadas do tecido adiposo, denominadas adipocinas, sinalizam local e sistemicamente e podem regular a homeostase energética, a função imunológica, a dinâmica vascular e muito mais 5,6,7. Os adipócitos maduros constituem aproximadamente 50% das células do tecido adiposo e representam a grande maioria do volume do tecido adiposo8. É importante ressaltar que estudos descobriram que os adipócitos consistem em muitas subpopulações 9,10. Como tal, as células progenitoras de adipócitos geram populações distintas de adipócitos maduros com base em fatores como sexo e depósito de tecido adiposo. Esses adipócitos maduros podem ser modulados ainda mais por mudanças na dieta e obesidade, criando subpopulações de adipócitos que são transcricionalmente distintos e expressam diferentes assinaturas parácrinas 9,11,12,13,14,15,16 . Apesar de sua complexidade e importância fisiológica, a capacidade de isolar e cultivar adipócitos maduros continua sendo uma barreira distinta para o estudo dessas células.

Os métodos atualmente disponíveis usados para isolar adipócitos maduros empregam diferenciação de células progenitoras de adipócitos (APCs), classificação de células ativadas por fluorescência e técnicas baseadas em centrifugação, embora todas tenham suas próprias desvantagens. A diferenciação in vitro ou ex vivo de APCs em adipócitos maduros é amplamente utilizada para desenvolver adipócitos maduros. No entanto, essas células artificialmente diferenciadas são multiloculares, contendo muitas pequenas gotículas lipídicas, em vez do fenótipo unilocular de adipócitos maduros in vivo, que contêm uma grande gotícula lipídica17. Além disso, estudos descobriram que as células diferenciadas in vitro são transcricionalmente distintas dos adipócitos maduros isolados encontrados in vivo17. É importante ressaltar que a diferenciação in vitro é incapaz de capturar a diferença entre adipócitos magros e obesos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) é comumente usada para isolar populações de células específicas do tecido; no entanto, os adipócitos maduros podem estourar facilmente em condições de FACS devido ao seu grande tamanho e membranas frágeis, tornando este um método ineficiente para o isolamento de adipócitos maduros. Outros protocolos existentes resultam no acúmulo de grandes quantidades de lipídios livres, que podem ser tóxicos para os adipócitos maduros em cultura ao longo do tempo.

Aqui, descrevemos um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros do tecido adiposo branco. Esse protocolo foi adaptado do protocolo para culturas de agregados de adipócitos maduros originalmente estabelecido por Harms et al.17; No entanto, a abordagem baseada em centrifugação descrita aqui usa equipamentos de laboratório comuns e é capaz de isolar eficientemente os adipócitos de pequenas quantidades (~ 0,5 g) de tecido adiposo. Este é um sistema facilmente adaptável e modificações para isolar adipócitos murinos maduros de camundongos machos e fêmeas, depósitos de gordura visceral e subcutânea e diferentes condições de dieta estão incluídas.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade de Utah. Este protocolo foi otimizado para o isolamento de adipócitos maduros de camundongos machos e fêmeas C57BL/6 com idades entre 8 e 16 semanas, com pesos corporais variando de 20 a 45 g. Detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação da solução

  1. Prepare o tampão colagenase. Adicione 100 mg de colagenase em pó, 1 mL de tampão HEPES 1 M, 500 μL de 100x P188, 50 μL de CaCl1 M 2, 0,05 g de BSA e 48,45 mL de Medium 199. Filtrar a solução estéril, alíquota e conservar a -20 °C.
  2. Faça meios de cultura de células. Combine 500 mL de DMEM, 50 mL de FBS, 5 mL de penicilina-estreptomicina e 5 mL de suplemento de L-glutamina.

2. Coleta de depósitos de tecido adiposo branco de camundongos

  1. Prepare uma placa de 1 x 10 cm com 200 μL de HBSS para cada depósito diferente e condicione conforme apropriado e coloque-a no gelo.
  2. Recupere os animais do biotério e sacrifique os camundongos de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Instituição. Aqui, os animais foram eutanasiados por luxação cervical sob anestesia profunda.
  3. Pese e registre o peso de cada mouse, se apropriado.
  4. Esterilize o mouse pulverizando etanol 70% para revestir o exterior.
  5. Colha as almofadas de gordura apropriadas do mouse18,19.
    NOTA: Tome cuidado para remover os gânglios linfáticos do depósito subcutâneo antes de colocar o tecido no prato.
  6. Pese cada gordura e registre o peso.
  7. Coloque a almofada de gordura no prato preparado de 10 cm no gelo.

3. Preparação de explantes de tecido adiposo branco

NOTA: Esta etapa é opcional.

  1. Pelo menos 12 h antes de iniciar a dissecção, descongele a matriz da membrana basal (Matrigel) a 4 ° C no gelo e resfrie uma caixa de pontas de pipeta estéreis de 200 μL a 4 ° C.
  2. Usando pontas de pipeta resfriadas, pipete 80 μL de matriz de membrana basal no centro de cada poço de uma placa de cultura de 24 poços para criar uma cúpula (Figura 1A). Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% CO2) por 30 min para solidificar parcialmente a matriz.
  3. Prepare o tecido: Usando uma tesoura de dissecção estéril, pese 0,1 g de tecido de cada amostra e coloque-o em PBS no gelo.
  4. Com pinças estéreis, incorpore o tecido pré-pesado na cúpula da matriz parcialmente solidificada. Adicione 30 μL de matriz de membrana basal sobre o tecido incorporado. Retorne a placa à incubadora por 30 min para fixar o tecido na matriz da membrana basal.
    NOTA: A incorporação de tecido na matriz da membrana basal é crucial para garantir que o tecido permaneça em cultura em vez de flutuar. Isso preserva a saúde e a qualidade do tecido (Figura 1B).
  5. Adicione 1 mL de meio de crescimento (DMEM com 10% de FBS) a cada poço e retorne à incubadora.

4. Tratamento de colagenase

  1. Calcule a quantidade de solução de colagenase necessária. Veja a Tabela 1.
  2. Prepare a solução de colagenase com DNase. Adicionar 0,00017 g de DNase por 1 ml de solução de colagenase. Vórtice para misturar.
  3. Usando uma lâmina de barbear, pique o tecido adiposo isolado até que o tecido pareça homogêneo (Figura 2A). Transfira o tecido picado para um tubo cônico estéril de 50 mL.
    NOTA: Não pique demais. A picagem está completa quando o tecido parece homogêneo e pastoso. O tecido subpicado parece volumoso e heterogêneo, e o tecido picado demais resultará na liberação de lipídios livres (Figura 2B).
  4. Adicionar a solução preparada de colagenase e DNase ao tecido adiposo picado utilizando os volumes calculados no passo 4.1. Vórtice na velocidade máxima por 7 a 10 s para combinar completamente. Coloque tubos cônicos de 50 mL horizontalmente em um agitador regulado para 220 rpm, 37 °C.
  5. Incube agitando por 10 min, depois vortex por 5 s e verifique as amostras. As amostras totalmente digeridas parecerão homogêneas, sem aglomerados visíveis ou pedaços de tecido. Se as amostras não forem totalmente digeridas, continue a digestão no shaker, verificando a cada 2 minutos (Figura 2C).
    NOTA: Não digerir em demasia. O tempo excessivo em solução de colagenase pode resultar na quebra dos adipócitos e na liberação de lipídios.
  6. Use uma pipeta sorológica para passar o tecido digerido através de uma peneira para uma nova cônica de 50 mL. Adicione um volume de FBS igual ao volume de tecido + solução de colagenase através da peneira em um cônico para neutralizar a colagenase.
    NOTA: Uma pequena quantidade de tecido permanecerá na peneira após a filtragem.

5. Lavando o lenço de papel

NOTA: Conclua todas as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos estéreis.

  1. Prepare 1 tubo de 15 mL com 10 mL de meio de cultura quente para cada condição.
  2. Gire os tubos da etapa 4.6 a 300 x g por 3 min na temperatura especificada na Tabela 1.
    NOTA: A temperatura para centrifugação precisa ser modificada com base no sexo dos camundongos dos quais o tecido adiposo foi isolado; essas temperaturas são fornecidas na Tabela 1.
  3. Certifique-se de que, após a rotação, o tecido se separe em quatro camadas (Figura 3A).
    NOTA: A camada superior são os lipídios livres, a segunda camada é a camada de adipócitos maduros, a terceira camada é a colagenase e FBS, e a quarta camada é a fração vascular estromal (SVF) que se espalha para o fundo20,21.
  4. Descarte cuidadosamente a camada superior de lipídios livres com uma pipeta de 200 μL.
  5. Depois de remover a camada superior, use uma pipeta p1000 com a parte inferior cortada para transferir os adipócitos maduros para o tubo preparado de 15 mL com 10 mL de meio de crescimento (Figura 3B).
    1. Opcional: Para isolar as células progenitoras de adipócitos primários (APCs), gire os tubos novamente a 300 x g por 10 min. Em seguida, proceda ao isolamento das células progenitoras de adipócitos por Liu et al.22, Cho et al.23 ou similar.
  6. Inverta os tubos de 15 mL com os adipócitos maduros suavemente 3-5 vezes até que a camada branca se disperse por todo o meio.
  7. Deixe os tubos descansarem na posição vertical por 10 min na temperatura indicada na Tabela 1 para permitir a separação das camadas de adipócitos e meios.
  8. Após o descanso de 10 min, gire os tubos a 100 x g por 1 min em temperatura ambiente para promover ainda mais a separação das camadas. Após a centrifugação, as amostras serão separadas novamente em quatro camadas, conforme mostrado na Figura 3A.
  9. Remova e descarte a camada superior de lipídios livres com uma pipeta.
  10. Usando uma agulha de 21 G conectada a uma seringa de 5 mL, deslize a agulha pela borda do tubo até que a parte inferior da agulha esteja livre da camada de adipócitos maduros ( Figura 3C ). Certifique-se de que a parte superior da agulha e a parte inferior da seringa não perturbam a camada de adipócitos maduros.
  11. Puxe lentamente a seringa para remover o meio de cultura e quaisquer detritos celulares.
    NOTA: À medida que o meio é removido, certifique-se de que a ponta da agulha esteja livre da camada de adipócitos maduros.
  12. Adicione suavemente 10 mL de meio de cultura a cada tubo.
  13. Repita as etapas 5.6 a 5.11. Não adicione mais meios de cultura.
  14. Usando pontas de pipeta de carregamento de gel, deslize a ponta da pipeta pela borda do tubo para remover o meio restante abaixo da camada de adipócitos maduros.

6. Embalagem

  1. Centrifugue as células a 100 x g durante 1 min à temperatura indicada no quadro 1. Remova os lipídios livres (camada de óleo transparente no topo das células) usando uma pipeta. Remova o meio de cultura abaixo dos adipócitos usando uma ponta de carregamento de gel. Tome cuidado para minimizar a ruptura da camada de adipócitos (Figura 4).
  2. Repita a etapa 6.1 até que todos os meios de cultura e lipídios livres tenham sido removidos (normalmente 3-5 vezes). O pacote de células deve ser de cor branca, sem lipídios livres visíveis acima das células ou meios abaixo das células (Figura 4).

7. Revestimento e ensaios funcionais

  1. Plaqueamento dos adipócitos maduros para cultura de células
    1. Remova as inserções de cultura de células de uma placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos e coloque-as com o lado da membrana voltado para cima na superfície do capuz.
    2. Encha os poços alternados da placa com 1 mL de meio de cultura quente.
    3. Usando uma ponta de pipeta p200 cortada, coloque 30 μL de adipócitos maduros embalados da etapa 6.2 no topo de um inserto transwell ( Figura 5A , B ).
    4. Pegue e inverta cuidadosamente o inserto do transwell e coloque-o em um poço pré-preenchido na placa de 24 poços (Figura 5A). Coloque cuidadosamente a placa na incubadora regulada a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Os adipócitos devidamente embalados devem formar uma camada opaca sem gotículas lipídicas livres claras visíveis quando vistos de cima (Figura 5C).
    5. Troque o meio nos adipócitos maduros a cada 2-7 dias por até 14 dias.
      1. Para remover o meio dos poços, segure o poço no lugar e use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o meio através das pequenas aberturas na lateral do inserto do poço (Figura 5D).
      2. Uma vez que o meio tenha sido removido, enquanto ainda mantém o transwell no lugar, adicione muito lentamente 1 mL de meio à parede lateral do poço.
        NOTA: Tome cuidado para adicionar e remover mídia muito lentamente. Os adipócitos podem facilmente se desalojar da membrana se o meio for trocado rapidamente.
  2. Ensaio de lipólise
    1. Explantes de tecido adiposo em placa, conforme descrito na etapa 3.4, ou adipócitos maduros, conforme descrito na etapa 7.1.
      NOTA: As células ou tecidos devem ser cultivados em meio sem vermelho de fenol por pelo menos 24 h antes de realizar o ensaio de lipólise.
    2. Preparação da solução: Prepare uma solução de 5% de BSA em DMEM (sem vermelho de fenol) dissolvendo 5 g de BSA em 100 mL de DMEM. Inverta suavemente para combinar até que o BSA esteja totalmente dissolvido.
      1. Prepare soluções de trabalho para meios de controle e estimulação. Para meios de controle, combine 5% de mídia BSA DMEM com o veículo. Para meios de estimulação, combine 5% de mídia BSA DMEM com 5 μM de CL-316,243. Aqueça os meios de controlo e estimulação a 37 °C antes da utilização.
    3. Remova a mídia dos poços e lave com 1 mL de DPBS quente. Encha os alvéolos com 500 μL por poço de meio de controle ou estimulação. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    4. Às 1 h, 2 h, 4 h e 24 h após o início do ensaio de lipólise, colete 100 μL de meio de cada poço em um tubo de microcentrífuga e substitua-o por 100 μL do meio de controle ou estimulação apropriado.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C neste momento.
    5. Execute o Glycerol Colorimetric Assay usando um kit de glicerol gratuito disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) ou similar.
      1. Prepare os reagentes conforme indicado no kit.
      2. Descongele as amostras e misture delicadamente pipetando.
      3. Preparar uma curva-padrão com uma diluição seriada de sete pontos e 2 vezes utilizando a solução-padrão de glicerol.
      4. Transfira 25 μL de amostra ou padrão para cada poço de uma placa de fundo transparente de 96 poços.
      5. Adicione 100 μL de reagente de ensaio de glicerol livre a cada poço contendo amostra ou solução padrão.
      6. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, ler a absorvância a 540 nm (Figura 6A-D).
  3. Imagiologia
    1. Prepare as lâminas de imagem. Para preparar slides, remova a camada de papel de apoio de cada espaçador de imagem e coloque-a no slide. Dois espaçadores de imagem podem ser colocados lado a lado em cada lâmina.
    2. Usando uma ponta de pipeta cortada de 200 μL, transfira 30 μL de adipócitos embalados da etapa 6.2 para um tubo de microcentrífuga.
    3. Prepare a mistura de coloração. Preparar 200 μL por amostra de solução de coloração da membrana plasmática a 5 μg/ml e Hoechst a 4,5 μg/ml em PBS. Adicione a mistura de manchas às amostras e agite suavemente.
    4. Amostras de coloração por 30 min em temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz.
    5. Após a conclusão da coloração, lave as amostras. Adicione 500 μL de PBS a cada amostra e agite suavemente para combinar. Deixe repousar por 5 min. Gire a 100 x g por 1 min e, em seguida, remova a mídia sob as células com uma ponta de pipeta de carregamento de gel.
    6. Prepare os slides. Remova o filme plástico transparente da parte superior dos espaçadores de imagem para expor a camada pegajosa.
    7. Adicione 500 μL de PBS ao tubo de adipócitos corados e misture suavemente.
    8. Rapidamente, para não dar tempo para os adipócitos maduros subirem à superfície, use uma ponta de pipeta p200 cortada para colocar 35 μL dos adipócitos dentro do espaçador na lâmina de imagem.
    9. Coloque uma lamínula no espaçador.
    10. Prossiga imediatamente para a imagem (Figura 6C). Um atraso na imagem pode resultar em sangramento do marcador de membrana.

Resultados

Como mostrado na Figura 2, a moagem adequada (Figura 2B) e a digestão (Figura 2C) são importantes para o isolamento de adipócitos maduros intactos. A sub-picagem e a subdigestão podem resultar em um baixo rendimento de adipócitos maduros devido à separação inadequada do tecido conjuntivo. Visualmente, isso pode ser observado com o tecido fibroso remanescente após a picagem e aglomerados visíveis na solução de colagenase. Além disso, a picagem excessiva e a digestão excessiva também resultam em baixo rendimento devido ao estouro dos adipócitos maduros. Visualmente, isso resulta na perda da camada opaca branca e no acúmulo de uma camada lipídica grande, clara e livre. Níveis inadequados de picagem ou digestão resultarão em isolamento deficiente dos adipócitos.

A preparação e digestão adequadas do tecido adiposo resultarão na separação do tecido em quatro camadas distintas, como visto na Figura 3. Algum estouro dos adipócitos, resultando na liberação de lipídios livres, é inevitável; no entanto, a picada e a digestão adequadas garantirão a ruptura mínima dos adipócitos. A camada lipídica livre restante e o meio serão removidos durante o empacotamento dos adipócitos (Figura 4). O empacotamento adequado dos adipócitos é essencial para o isolamento eficiente dos adipócitos maduros. Quaisquer lipídios ou meios livres restantes resultarão em isolamento deficiente e afetarão negativamente os ensaios funcionais a jusante, como plaqueamento, lipólise e imagens celulares.

Este protocolo gera uma preparação limpa de adipócitos maduros. Ensaios de imagem celular e lipólise podem ser realizados para avaliar a função celular e demonstrar que os adipócitos maduros mantêm a função após o isolamento e após a cultura por até duas semanas. O ensaio de lipólise indica que os adipócitos maduros mantêm a capacidade de responder à sinalização celular através da liberação de glicerol livre após a estimulação do receptor adrenérgico β-3 (Figura 6A, B). Essa capacidade é mantida mesmo após 2 semanas em cultura e é altamente comparável à atividade de lipólise de explantes de tecido adiposo cultivados por 24 h ( Figura 6C , D ). Os adipócitos de baixa qualidade apresentarão lipólise atenuada. A imagem celular de adipócitos isolados mostra adipócitos maduros uniloculares redondos e intactos contendo uma única gotícula lipídica grande. Isolamentos de adipócitos de baixa qualidade mostrarão principalmente gotículas de óleo extracelulares grandes indicativas de adipócitos estourados.

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Figura 1: Incorporação de explantes de tecido adiposo. (A) Imagem da cúpula da matriz da membrana basal parcialmente solidificada antes da incorporação do tecido. (B) Imagens representativas de incorporação inadequada e adequada de tecidos. A incorporação inadequada é visível, pois o tecido parece flutuar parcial ou completamente acima da cúpula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Esquema de picagem e digestão adequadas do tecido adiposo. (A) Representação esquemática das etapas de picagem e digestão do tecido 4.2-4.6. (B) Imagens representativas de tecido sub, ótimo e superpicado. O tecido subpicado tem grandes pedaços que mantêm sua forma original. O tecido picado em excesso resulta em um aumento visível nos lipídios livres ao redor do tecido, que parecem claros e oleosos. (C) Imagens representativas de tecido sub, ótimo e superdigerido. O tecido subdigerido contém pedaços de tecido inteiro remanescentes na solução. O tecido superdigerido exibe uma grande camada lipídica livre que se separa rapidamente da solução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Separação das camadas de tecido adiposo digerido. (A) Imagem esquemática e representativa das camadas que estão presentes seguindo a etapa 5.3. (B) Uso de uma ponta de pipeta cortada para remover a camada de adipócitos maduros do tubo cônico de 50 mL. (C) Técnica e colocação adequadas da agulha e seringa para remover os meios de cultura abaixo da camada de adipócitos maduros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Empacotamento seqüencial de adipócitos maduros. Imagens sequenciais do empacotamento dos adipócitos maduros. Camadas de lipídios livres, adipócitos e meios são marcados. Após cada centrifugação, os lipídios e meios livres são removidos. Isso é repetido até que nenhum meio ou lipídios livres se separem dos adipócitos após uma centrifugação. A imagem final é representativa de adipócitos maduros bem compactados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Plaqueamento e cultura de adipócitos maduros. (A) Esquema do plaqueamento de adipócitos maduros. Usando uma ponta de pipeta p200 cortada, os adipócitos compactados são colocados na membrana de uma inserção de cultura de células. A pastilha é então invertida em poços pré-cheios de meios de cultura. (B) Uma imagem representativa de adipócitos maduros de chapeamento representando adipócitos depositadores de ponta de pipeta cortada na inserção transwell. (C) Esquemas e imagens representativas de adipócitos adequadamente embalados e mal embalados revestidos com transwells, vistos de cima dos poços. Os adipócitos adequadamente compactados parecem brancos e opacos, enquanto os adipócitos mal compactados resultam na formação de gotículas lipídicas claras. (D) Esquema da técnica usada para mudar os meios de cultura. Uma ponta de pipeta p200 é usada para remover cuidadosamente o meio através das aberturas na parede lateral do inserto do transwell. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Imagem de adipócitos maduros e ensaio de lipólise. (A, B) Liberação de glicerol dos adipócitos maduros subcutâneos (A) e viscerais (B). Os adipócitos foram isolados de camundongos machos C57BL/6 de 16 semanas de idade alimentados com uma dieta normal de ração. 30 μL de adipócitos foram plaqueados conforme descrito na etapa 7.1 e cultivados por 1 ou 10 dias. Os adipócitos foram tratados com 5 μM de CL-316.243 por 1 h, 2 h e 4 h, e os sobrenadantes foram coletados e analisados para glicerol livre. (C, D) Liberação de glicerol a partir de explantes de tecido adiposo subcutâneo (C) e visceral (D). O tecido adiposo foi isolado de camundongos fêmeas C57BL/6 de 18 semanas de idade alimentados com uma dieta normal. 0,1 g de explantes de tecido adiposo foram plaqueados conforme descrito nas etapas 3.1-3.4 e cultivados por 24 h. Os adipócitos foram tratados com 5 μM de CL-316.243 por 1 h, 2 h e 4 h, e os sobrenadantes foram coletados e analisados para glicerol livre. N = 3 réplicas técnicas para A-D. Todos os dados são média ± desvio padrão. (E) Imagens representativas de adipócitos maduros subcutâneos e viscerais isolados. Os adipócitos foram isolados de camundongos machos C57BL / 6J de 16 semanas alimentados com uma dieta normal. Os adipócitos foram corados com coloração de membrana plasmática (vermelho) e coloração de núcleos de Hoechst (azul). Barras de escala: 50 μm; Ampliação: 60x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

SexoDietaDepósitoDificuldade de picarColagenase: proporção de tecidoTempo de digestão sugerido (min)Temperatura de rotação.Temperatura de lavagem.
FêmeaRação normalSubcutâneoDuro2:112RT37 °C
VisceralMédia1:18RT37 °C
Dieta rica em gorduraSubcutâneoFácil1:18RT37 °C
VisceralFácil1:18RT37 °C
MachoRação normalSubcutâneoDuro2:1144 °CRT
VisceralMédia1:1104 °CRT
Dieta rica em gorduraSubcutâneoFácil1:1104 °CRT
VisceralFácil1:1104 °CRT

Tabela 1: Sexo, depósito e modificações específicas da dieta. A dificuldade de picar de cada tecido, descrita como "Fácil", "Média" ou "Dura" em relação a outros depósitos. Observe que o tempo real de picagem varia de acordo com o pesquisador e o tecido. Colagenase: Proporção de tecido listada como volume (mL) de solução de colagenase + DNase preparada na etapa 4.1 para o peso do tecido (g). O tempo de digestão é uma estimativa aproximada, mas o tempo real de digestão varia de acordo com a picagem e o tecido. Os pesquisadores devem avaliar a digestão conforme descrito no protocolo. A temperatura de centrifugação e a temperatura de lavagem diferem entre camundongos machos e fêmeas. RT denota temperatura ambiente.

Discussão

Os adipócitos primários são notoriamente difíceis de isolar e cultivar porque se rompem facilmente, e seu grande tamanho impede o uso de ferramentas comuns de isolamento de células primárias, como citometria de fluxo. O protocolo descrito aqui produz adipócitos maduros limpos e funcionais, que podem ser usados para uma variedade de aplicações a jusante. É importante ressaltar que este protocolo permite a separação dos adipócitos maduros de outros detritos celulares e da camada lipídica livre, permitindo ensaios eficazes de imagem, cultura e lipólise. O protocolo pode ser prontamente combinado com protocolos publicados 22,23 para o isolamento da fração vascular estromal e APCs. Este protocolo também detalha um procedimento para a preparação e cultura de explantes de tecido total do tecido adiposo, que podem ser usados para aplicações a jusante, como ensaios de lipólise e coleta de fatores secretados de todo o tecido adiposo.

Os aspectos críticos incluem picagem adequada, digestão e remoção da camada lipídica livre. Para garantir a picada adequada, é importante monitorar de perto a aparência visual do tecido durante todo o processo. O tempo e o esforço necessários para obter uma carne moída ideal do tecido variam de acordo com o depósito de tecido adiposo, as intervenções dietéticas (como uma dieta rica em gordura) e o pesquisador. Outras ferramentas para picar, como tesouras, podem ser incorporadas, se necessário, mas isso não foi explorado aqui. É importante notar que o excesso de picagem deve ser evitado, pois romperá os adipócitos, o que não apenas diminui o rendimento imediato, mas também diminui o rendimento total e a qualidade dos adipócitos devido ao efeito deletério que a camada lipídica livre tem sobre os adipócitos restantes. A digestão adequada, semelhante a uma carne picada adequada, dependerá do depósito de tecido adiposo, intervenções dietéticas, idade dos camundongos, etc. A adição de DNase à colagenase ajuda a prevenir a agregação dos adipócitos durante a digestão, que pode resultar de detritos celulares. O tempo de digestão dos tecidos é, portanto, altamente variável. As estimativas fornecidas para os tempos de digestão servem como um guia, que pode ser encontrado na Tabela 1. No entanto, a melhor maneira de garantir que os tecidos sejam digeridos adequadamente é inspecionar visualmente o tecido durante todo o processo e conforme descrito no protocolo. As diferentes temperaturas de centrifugação e lavagem detalhadas na Tabela 1, sugeridas com base no sexo, são essenciais para a separação adequada dos adipócitos maduros tanto da camada lipídica livre quanto dos outros detritos celulares e SVF; O uso de temperaturas alternadas pode resultar na perda dos adipócitos maduros devido à agregação e ruptura dos adipócitos.

A remoção da camada lipídica livre em cada etapa é de importância crítica, e a falha em fazê-lo apresentará complicações a jusante para o revestimento, a imagem e o ensaio de lipólise. Além disso, a presença sustentada da camada lipídica livre durante todo o procedimento resultará em morte adicional de adipócitos devido à lipotoxicidade, afetando drasticamente o rendimento e a qualidade geral. Embora a maximização da eficiência do isolamento de adipócitos maduros seja geralmente desejada, a remoção da camada lipídica livre, mesmo às custas de alguns dos adipócitos maduros, resultará em um aumento geral no rendimento de adipócitos maduros no final do protocolo.

As limitações do procedimento incluem o número de amostras. Devido ao rigor e ao tempo consumido pela remoção do meio e da camada lipídica livre, o procedimento geralmente é limitado a seis amostras por vez. O processamento de um número significativamente maior de amostras resultará na exposição de adipócitos primários a lipídios livres por muito tempo e diminuirá o rendimento geral. No entanto, pessoal adicional pode permitir um aumento no número de amostras. O tempo desde a picagem até o ensaio funcional é crítico, pois atrasos excessivos na remoção do meio e da camada lipídica livre resultam em ruptura adicional de adipócitos maduros. O protocolo é ainda mais limitado na capacidade de separar subpopulações de adipócitos maduros.

Os métodos atuais para estudar adipócitos maduros dependem principalmente do isolamento de APCs e da subsequente diferenciação ex vivo dessas células. Métodos adicionais, incluindo modelo organ-on-a-chip e co-culturas de poços trans, começaram a ser desenvolvidos 18,24. No entanto, esses adipócitos diferenciados ex vivo demonstraram ser transcricional e morfologicamente distintos dos adipócitos maduros no tecido adiposo17. Morfologicamente, os adipócitos diferenciados ex vivo são multiloculares, enquanto os adipócitos isolados in vivo são uniloculares. Este protocolo foi modificado e otimizado a partir de relatórios anteriores17,25 para isolar e cultivar com sucesso adipócitos maduros de apenas 0,5 g de tecido adiposo em comparação com outros protocolos que requerem pelo menos 5 g de tecido adiposo25. Finalmente, este estudo teve como objetivo ilustrar visualmente a conclusão bem-sucedida das principais etapas do protocolo em vez de tempos de concreto, temperaturas de centrifugação e quantidades de colagenase, embora as diretrizes estejam incluídas na Tabela 1. Esses parâmetros precisam ser ajustados de acordo com fatores como o depósito de tecido adiposo, o sexo e a adiposidade do animal, que podem afetar a eficiência da digestão e a separação limpa dos adipócitos maduros neste protocolo.

No total, o procedimento leva de 3 a 4 horas, dependendo do número de camundongos agrupados e do número de amostras individuais de tecido adiposo. Prevê-se que a capacidade de cultivar e avaliar o papel funcional dos adipócitos maduros permitirá muitas aplicações a jusante para o estudo da própria biologia dos adipócitos (por exemplo, metabolismo, utilização de nutrientes e rastreamento) e a interação dos adipócitos com outros tipos de células, como APCs, células cancerígenas e células do sistema imunológico.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer o apoio financeiro do 5 For The Fight and Huntsman Cancer Institute (KIH), da V Foundation for Cancer Research (KIH) e do DK133455 (KIH). Esquemas do protocolo criado com Biorender. Além disso, os autores gostariam de agradecer a Stephanie Giagnocavo e ao Cell Imaging Core da Universidade de Utah pela ajuda na imagem, e a Mark Lee pelo feedback sobre o manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100x Solução Poloxamer 188SigmaP5556-100mL
15 mL cônicoCellstar188261
21 G AgulhaBD305165
Seringa de 5 mLBD309646
50 mLCônico Cellstar227261
6,5 mm Transwell com 0,4 µ m Inserção de membrana de policarbonato de porosCorning3413
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2< / sub>SigmaC1016-500gm
CellMask Manchas de membrana de plasmaThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 sal dissódicoTocris1499
Pó de colagenaseSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM sem pheonol RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher científico
Pipeta de Carregamento de GelFisher scientific02-707-181
Suplemento GlutaMAXGibco35050061
Kit de Ensaio de GlicerolSolução SalarAB133130
Hanks (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Centrífuga Megafuge 16RThermo Scientific 
Hoechst 33342 SoluçãoThermo Fisher Scientific62249
Mini Agitador IncubadorVWR12620-942
Médio 199Sigma-AldrichM4530
Óculos de Cobertura para MicroscópioVWR16004-302
PBSGibco10010023
Penicilina-EstreptomicinaEspaçadores de Imagem SecureSeal Gibco15140-122
Grace Biolabs654006
Seive (Coador de Coquetel de Malha Fina SteeL)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
Ponta de 1518848 Balanceada Abcam 75004271

Referências

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