$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Neste estudo, segmentamos tomogramas contendo mitocôndrias e organelas membranosas adicionais (por exemplo, vesículas, retículo endoplasmático) usando syGlass. Os tomogramas foram inicialmente reconstruídos em Warp usando projeção ponderada a 16,00 Å / pixel e foram submetidos à correção de cunha ausente e redução de ruído utilizando o software IsoNet. Os tomogramas a seguir foram submetidos a processamento adicional para importação, conforme mostrado na Figura 1A (consulte também Vídeo Suplementar S1, Vídeo Suplementar S2, Vídeo Suplementar S3 e Vídeo Suplementar S4).
Após o pré-processamento, os tomogramas no formato MRC foram convertidos em pilhas TIFF usando ImageJ, com inversão de contraste aplicada para fazer as membranas parecerem brancas em um fundo preto. A equalização do histograma foi então realizada para aumentar ainda mais o contraste; Isso também permite um limite mais eficaz. As pilhas TIFF foram importadas e visualizadas em 3D em um ambiente imersivo de RV, fornecendo inspeção detalhada de estruturas membranosas utilizando a ferramenta de corte no software mostrado na Figura 1B.
A segmentação manual foi realizada no software, com janelas definidas para automático e ajustes de brilho/limite feitos para otimizar a visibilidade do recurso celular. As ROIs em torno das mitocôndrias e outras estruturas foram definidas usando os controladores de RV. A ferramenta de segmentação permitiu o delineamento preciso dos limites da membrana, com erros corrigidos usando a função de apagamento. A navegação fatia a fatia ou em 3D usando a ferramenta ROI para encaixotar regiões em todo o tomograma, combinada com a ferramenta pincel ajustável, garantiu a segmentação precisa das membranas mitocondriais e outras organelas, conforme mostrado na Figura 1C.
Os dados segmentados foram visualizados gerando uma malha usando a opção de superfícies da ferramenta ROI, com iterações de suavização definidas como 12 e nível de resolução definido como 3. As renderizações 3D finais demonstram claramente as estruturas mitocondriais, incluindo as membranas externa e interna, cristas e depósitos de fosfato de cálcio, conforme mostrado na Figura 1D (consulte também o Vídeo Suplementar S5, o Vídeo Suplementar S6, o Vídeo Suplementar S7 e o Vídeo Suplementar S8).

Figura 1: Fluxo de trabalho de visualização de tomograma, segmentação e renderização 3D usando syglass. (A) Fatias tomográficas de células RPE1 de borda fina. Tomografias corrigidas por IsoNet reconstruídas em Warp e usadas para segmentação com syGlass, visualizadas com IMOD25. Os tomogramas foram coletados em um microscópio Titan-Krios de 300 keV equipado com um detector K3 e focados nas bordas finas das células do epitélio retiniano. Cada tomograma contém pelo menos uma mitocôndria junto com várias outras organelas ligadas à membrana. Essas imagens são imagens estáticas de vídeos mostrados no Vídeo Suplementar S1, Vídeo Suplementar S2, Vídeo Suplementar S3 e Vídeo Suplementar S4. (B) Tomografias correspondentes visualizadas no software. Corte tomográfico criado usando a ferramenta de corte no software VR após otimizar o limite, o brilho e as janelas, revelando estruturas celulares distintas. (C) Tomografias visualizadas no software com membranas segmentadas. Corte tomográfico criado com a ferramenta de corte no software VR, sobreposto com a segmentação correspondente. Os depósitos de fosfato de cálcio são mostrados em amarelo, as membranas mitocondriais em ciano e outras membranas, como vesículas e a membrana plasmática em roxo. (D) Renderização 3D das membranas segmentadas em syGlass. As membranas mitocondriais, incluindo as cristas, as membranas mitocondriais externas e internas, são mostradas em ciano. Os depósitos de fosfato de cálcio estão em amarelo ou verde, as vesículas e a membrana plasmática estão em roxo e o retículo endoplasmático está em bronzeado. Essas imagens são imagens estáticas de vídeos mostrados em Vídeos Suplementares S5, Vídeo Suplementar S6, Vídeo Suplementar S7 e Vídeo Suplementar S8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo Suplementar S1: Tomografia da amostra RPE-1_1 usada para segmentação neste estudo. Este tomograma é reconstruído a 16 Å / pixel usando Warp, depois removido e corrigido para a cunha ausente com IsoNet. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S2: Tomografia da amostra RPE-1_2 usada para segmentação neste estudo. Este tomograma é reconstruído a 16 Å / pixel usando Warp, depois removido e corrigido para a cunha ausente com IsoNet. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S3: Tomografia da amostra RPE-1_3 usada para segmentação neste estudo. Este tomograma é reconstruído a 16 Å / pixel usando Warp, depois removido e corrigido para a cunha ausente com IsoNet. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S4: Tomografia da amostra RPE-1_4 usada para segmentação neste estudo. Este tomograma é reconstruído a 16 Å / pixel usando Warp, depois removido e corrigido para a cunha ausente com IsoNet. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S5: A segmentação resultante da amostra RPE-1_1 após a geração de superfícies. As membranas mitocondriais são mostradas em ciano; os fosfatos de cálcio dentro das mitocôndrias são representados em amarelo; o retículo endoplasmático é mostrado em bronzeado; e outras membranas são exibidas em roxo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S6: A segmentação resultante da amostra RPE-1_2 após a geração de superfícies. As membranas mitocondriais são mostradas em ciano; os fosfatos de cálcio dentro das mitocôndrias são representados em amarelo; o retículo endoplasmático é mostrado em bronzeado; e outras membranas são exibidas em roxo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S7: A segmentação resultante da amostra RPE-1_3 após a geração de superfícies. As membranas mitocondriais são mostradas em ciano; os fosfatos de cálcio dentro das mitocôndrias são representados em amarelo; o retículo endoplasmático é mostrado em bronzeado; e outras membranas são exibidas em roxo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo suplementar S8: A segmentação resultante da amostra RPE-1_4 após a geração de superfícies. As membranas mitocondriais são mostradas em ciano; os fosfatos de cálcio dentro das mitocôndrias são representados em amarelo; o retículo endoplasmático é mostrado em bronzeado; e outras membranas são exibidas em roxo. Clique aqui para baixar este arquivo.