Artigo de método

Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células

DOI:

10.3791/67852

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13 de junho de 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este método mede a propensão de uma célula a romper duplex de DNA imobilizado que apresenta ligantes para relatar forças de tração celular relativas. Oligos fluorescentes rompidos são entregues na célula e analisados por citometria de fluxo, registrando a história mecânica da célula. Isso permite a medição de alto rendimento da geração de força celular no contexto da mecanofenotipagem celular.

Resumo

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As forças mecânicas guiam muitos processos celulares críticos, e o fenótipo mecânico celular, ou mecanótipo, é interrompido em muitas doenças. O método mais amplamente utilizado para quantificar as forças celulares é a microscopia de força de tração, que tradicionalmente captura as forças que as células exercem em seus arredores por microscopia de alta resolução de células deformando substratos elásticos contendo esferas fluorescentes, desviando micropostes ou alterando a conformação de sensores de tensão molecular imobilizados. Apresentamos aqui um método de alto rendimento para medir as forças de tração celular relativas usando sondas de tensão de DNA estabelecidas e quantificadas por citometria de fluxo. Existem cinco etapas gerais envolvidas neste método descritas abaixo. Primeiro, expressão e purificação do ligante de integrina de alta afinidade equistatina fundido a um HUH-tag de ligação ao DNA; segundo, preparação das sondas duplex de DNA contendo repórteres e ligante; terceiro, preparação de superfície e imobilização de sondas; quarto, execução do experimento de tensão "Rupture and Deliver" e leitura de fluxo. Por fim, descreveremos a análise dos dados e a interpretação dos resultados experimentais.

Introdução

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As forças mecânicas guiam muitos processos celulares críticos, desde a migração1 para a diferenciação de células-tronco2 até a capacidade de uma célula T de se ligar e ser ativada pela célula apresentadora de antígeno correta3. As variáveis mecânicas são desreguladas na doença, resultando em diferenças mensuráveis no fenótipo mecânico celular, ou mecanótipo, das células 4,5. Mecanotipo é um termo genérico para as propriedades mecânicas de células e tecidos e pode incluir parâmetros como contratilidade, migração, adesão e deformabilidade. A rigidez celular ou tecidual é o aspecto mais comum do mecanótipo medido, pois pode ser medido em alto rendimento. Por exemplo, as células cancerígenas costumam ser mais rígidas do que as células normais, enquanto as células metastáticas costumam ser mais complacentes 6,7. A geração de força pelas células é um aspecto importante do mecanótipo alterado na doença8 porque investiga interações específicas célula-ambiente. A microscopia de força de tração é o método mais comum para medir a geração de força celular e envolve o revestimento de células em substratos elásticos deformáveis embutidos com esferas fluorescentes ou em matrizes de micropostes e o rastreamento de mudanças no movimento do cordão ou pós-deflexão para calcular as forças exercidas pelas células. Sensores de tensão molecular também têm sido usados para medir forças de tração e oferecem a vantagem de sensibilidade a magnitudes menores de força e forças de medição geradas por pares ligante-receptor específicos 9,10. No entanto, a medição de forças celulares com TFM tradicional e sensores de tensão molecular depende de imagens de alta resolução, limitando o rendimento da medição.

Recentemente, adaptamos sondas de tensão DNA-duplex em uma leitura de alto rendimento da geração de força celular no contexto da mecanofenotipagem celular11 (Figura 1). Resumidamente, os duplex de DNA adaptados das sondas12 de calibre de tensão (TGT) amplamente utilizadas são imobilizados nos poços de placas de 96 poços por meio da química de biotina-neutravidina da fita "âncora"13. A força de ruptura necessária dos duplexes TGT pode ser ajustada variando a posição da biotina no fio de ancoragem, o que altera a geometria do duplex, resultando em uma conformação de descompactação de baixa força de ruptura (Figura 2A) ou uma conformação de cisalhamento de alta força de ruptura (Figura 2B). A fita âncora contém biotina e um atenuador de fluorescência, enquanto a fita "ligante" de DNA contém uma sonda fluorescente e um ligante que reconhece um receptor de superfície celular envolvido na mecanosenização, como uma integrina. O ligante está covalentemente ligado ao DNA (Figura 3) por meio do uso de uma etiqueta de fusão de ligação ao DNA chamada etiqueta HUH fundida ao ligante14,15. As tags HUH são pequenos domínios de endonuclease HUH envolvidos na replicação viral e outros processos que reconhecem uma sequência/estrutura de 9 pb de DNA de fita simples, cortam-na e formam um aduto de fosfotirosina covalente na extremidade 5' do DNA cortado.

As células revestidas no topo dessas sondas se ligam ao ligante e rompem uma porcentagem das sondas proporcional às forças que geram. A fita ligante fluorescente ligada ao seu receptor é posteriormente entregue à célula. Assim, a história mecânica das células é registrada nas células de interesse por meio da magnitude de sua fluorescência. A fluorescência pode ser quantificada usando citometria de fluxo. Chamamos esse método de Ruptura e Entrega-TGTS ou RAD-TGTs. Este método não apenas mede a fluorescência e, portanto, a força relativa gerada por milhares de células de uma só vez, mas também a leitura por citometria de fluxo oferece o potencial de classificar as células por seu mecanótipo, permitindo leituras ômicas a jusante, bem como CRISPR-KO ou triagens de drogas que podem identificar genes ou drogas que alteram o mecanótipo celular.

No protocolo abaixo, demonstramos como preparar e executar um experimento RAD-TGT. Destacaremos a expressão e purificação de um tipo de HUH conhecido como WDV (do vírus anão do trigo) por si só para servir como controle negativo e fundido à equistatina, um ligante que se liga fortemente a uma família de receptores de adesão que transduzem força entre a célula e o ambiente conhecidos como integrinas de ligação a RGD, para servir como uma condição experimental. A partir disso, demonstraremos como preparar RAD-TGTs para uso experimental. Explicaremos como proceder com os experimentos e como analisar os dados resultantes. Também destacaremos uma aplicação de RAD-TGTs medindo como um inibidor de ROCK altera as forças mediadas por integrina em células CHO-K1 (Figura 4). Em suma, esperamos que este protocolo sirva como uma entrada para a mecanobiologia, independentemente da experiência anterior; O campo está em seu estágio inicial e todas as origens são essenciais para uma compreensão mais aprofundada.

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Protocolo

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1. Expressão e purificação de HUH

  1. Transforme Escherichia coli com plasmídeo WDV (± Echistatin), aproximadamente 1,5 μL de ~ 50 ng / μL de plasmídeo por transformação, e cresça em placas de ágar ampicilina.
  2. Inocular 5 ml de LB com uma única colónia e crescer durante a noite a 37 °C.
  3. Inocular 1 L de LB com a cultura durante a noite e crescer até que o OD600 atinja ~0,8.
  4. Abaixe a temperatura para 18 °C, induza com 500 μM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e incube durante a noite.
  5. Pulverizar as células por centrifugação a 3.750 × g durante 30 min. Ressuspenda o pellet com 40 mL de tampão de lise (300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA).
  6. Lisar as células com sonicação de 3 x 90 s no gelo a 70% do ciclo de trabalho, potência 7. Centrifugar a 24.000 × g durante 30 min a 4 °C e deitar o sobrenadante num novo tubo de 50 ml.
  7. Coloque a pasta de resina Ni-NTA em um tubo cônico de 15 mL (1 mL de suspensão de grânulos/L de cultura), gire a 700 × g por 2 min e remova o sobrenadante.
  8. Adicione 6 mL de água à resina e repita o processo de lavagem na etapa 1.7.
  9. Repita a lavagem duas vezes com tampão de lavagem (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 20 mM Imidazol) em vez de água. Ressuspenda os grânulos em 5 mL de tampão de lavagem.
  10. Adicione a pasta de esferas (etapa 1.9) às células lisadas (etapa 1.6) e misture bem. Rodar as células lisadas e os grânulos durante, pelo menos, 1 h a 4 °C.
    NOTA: Para o restante deste protocolo, nunca deixe a resina secar e colete todas as amostras que fluem pela coluna.
  11. Despeje a mistura em uma coluna de 20 mL e colete o fluxo. Lave a coluna com 4 x 25 mL de tampão de lavagem.
  12. Eluir com 1 x 10 mL de tampão de eluição (300 mM de NaCl, 50 mM de Tris [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 250 mM de Imidazol) em um tubo novo de 15 mL, coletando a eluição precoce e tardia separadamente (a eluição precoce é o primeiro 1 mL, a eluição tardia é o 1 mL final).
  13. Analise todas as frações coletadas por meio de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para garantir que o HUH foi coletado durante a eluição (ver Figura Suplementar S1). Para obter melhores resultados, carregue um gel de 4-20% e deixe-o funcionar por 45 min a 35 W e 200 V.
  14. Adicione a proteína eluída ao tubo de diálise e incube durante a noite em tampão de diálise (o mesmo que o tampão de lise) a 4 °C. Para remover a etiqueta HIS, adicione ULP1 sem agente redutor diretamente à proteína eluída antes de colocar a proteína no tubo de diálise.
  15. Na manhã seguinte, prepare a resina Ni-NTA conforme descrito nas etapas 1.7-1.9 e incube com a proteína dialisada. Despeje a mistura da proteína e da resina Ni-NTA em uma coluna e colete o fluxo. Lave a coluna com 10 mL de tampão de diálise e colete qualquer fluxo.
  16. Avalie a fração coletada em SDS-PAGE seguindo as configurações acima para garantir que a proteína esteja presente e concentre na concentração desejada usando um filtro ultracentrífugo de 15 mL com um corte de peso molecular de 10 kDa (consulte a Figura Suplementar S1).
    NOTA: A concentração final ideal de proteína está entre 40 μM e 100 μM.

2. Preparação RAD-TGT

  1. Monte duplexes em uma proporção molar de 1,1:1 de fita âncora (com atenuante) para fita ligante (com fluoróforo) a uma concentração final de 40 μM de fita ligante em uma solução de 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl e 1 mM EDTA.
  2. Recozimento por incubação a 98 °C durante 5 min, seguido de arrefecimento à temperatura ambiente durante 1 h; proteger da luz.
    NOTA: Amostras de baixo volume evaporam facilmente e podem ser difíceis de recuperar completamente. Prepare um volume maior do que o necessário.
  3. Reagir os duplex recozidos com HUH (utilizando a concentração da fita menos abundante durante o recozimento; neste caso, a fita ligante) numa proporção molar de 1:2 a uma concentração final de 10 μM duplex e 20 μM HUH numa solução contendo 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8), 50 mM NaCl.
  4. Incube a reação por 30 min a 37°C em um termociclador ou bloco de calor protegido contra luz. Após a incubação, retire do fogo e use uma minifunga de bancada para girar os TGTs agora montados. Coloque os TGTs imediatamente em placas ou armazene a 4 ° C no escuro.

3. Preparação da superfície

  1. Imediatamente após abrir uma placa de fundo de vidro de 96 poços, cubra todos os poços com folha adesiva de placa PCR para preservar os poços não utilizados para uso posterior. Use uma lâmina de barbear para cortar a folha sobre os poços de interesse (de preferência poços sem borda) e adicione 100 μL de PBS frio aos poços desejados.
    NOTA: Depois que o líquido for adicionado aos poços, não deixe os poços secarem. Se ocorrer secagem, a adsorção não específica de biomoléculas na superfície afetará negativamente os dados. Mantenha 100 μL de excesso de volume continuamente no poço para evitar qualquer secagem.
  2. Adicione 200 μL de PBS frio aos poços, pipete suavemente a mistura 2-5x e remova 200 μL de PBS. Repita para um total de três lavagens.
    NOTA: Ao adicionar e remover líquido dos poços, mantenha a ponta da pipeta na borda do poço em um ângulo de 45° para evitar perturbar a superfície. Faça isso para todo o manuseio da placa, exceto ao revestir células.
  3. Para poços experimentais, prepare uma solução de 0,1 mg / mL de Biotinilated-BSA em PBS e adicione 80 μL da solução aos poços desejados. Para poços controle, prepare a mesma solução com a adição de 18,75 μg/mL de fibronectina e adicione 80 μL aos respectivos poços. Pipete delicadamente, misture todos os poços usados, coloque a tampa no prato e cubra com papel alumínio. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Remova 80 μL de volume dos poços e lave os poços repetindo a etapa 3.2. Adicione 80 μL de neutravidina 0,1 mg / mL na solução de PBS da mesma maneira que na etapa 3.3.
  5. Após a incubação, remova 80 μL de volume dos alvéolos e repita a etapa 3.2. Dilua os TGTs montados (etapa 2 de preparação RAD-TGT) a 0,1 μM em PBS e solução de 80 μL para os poços de maneira semelhante à etapa 3.3. Cobrir os alvéolos com uma folha adesiva e conservá-los à escura a 4 °C ou proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante 1 h antes de prosseguirem as experiências.
    NOTA: Recomendamos tratar a etapa 3.5 como um ponto de parada e esperar até o dia seguinte para prosseguir com os experimentos.

4. Protocolo experimental RAD-TGT

  1. Após os TGTs terem tido tempo adequado para aderir, lave os poços (consulte a etapa 3.2) 3x com PBS, seguido de duas lavagens com meio sem soro. Deixe a mídia nos poços após a lavagem final. Adicione 200 μL de PBS aos poços periféricos para mitigar quaisquer efeitos de borda e transfira a placa para uma incubadora a 37 °C para pré-aquecer a placa.
  2. Recupere as células de interesse em ~ 80% de confluência e aspire o meio seguido pela adição e aspiração de PBS para lavar as células. Adicione um volume apropriado de tripsina e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C até que as células se dissociem (~ 5-10 min).
  3. Uma vez dissociadas as células, adicionar o volume original do meio celular completo utilizado para manter as células à placa e ressuspender com uma pipeta serológica. Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL.
  4. Centrifugue as células a 300 × g por 4 min, aspire o meio e ressuspenda o pellet em PBS. Repita a centrifugação e a aspiração e, em seguida, ressuspenda em 5 mL de meio sem soro e repita a centrifugação e a aspiração. Ressuspenda as células em ~ 2 mL de meio sem soro.
  5. Determine a densidade das células ressuspensas e ajuste a concentração conforme desejado.
    NOTA: Nosso objetivo é plaquear ~ 15.000 células por poço, então preparamos as células para uma concentração de 150.000 células / mL, o que permite que 15.000 células sejam revestidas com 100 μL de células ressuspensas.
    1. Opcional: Se o efeito de drogas ou outros agentes farmacológicos for testado, adicione a concentração apropriada de droga às células e devolva as células à incubadora. Aguarde um tempo de pré-incubação adequado antes de prosseguir para a próxima etapa.
  6. Recupere a placa da incubadora (etapa 4.1) e remova o volume de mídia restante da lavagem dos poços experimentais na placa pré-aquecida. Lave uma vez com a mídia desejada. Pipetar cuidadosamente 100 μL das células ressuspensas para os poços desejados. Transfira as células plaqueadas para a incubadora por 90 min.
    NOTA: Pipete as células para o centro dos poços suavemente, tentando manter a pipeta na vertical.
  7. Após a incubação, remova ~ 125-170 μL de volume dos poços. Se necessário, lave as células suavemente com 200 μL de PBS aquecido. Adicione 50 μL de tripsina a cada poço e retorne a placa à incubadora até que as células comecem a se dissociar (5-10 min).
    NOTA: Certifique-se de que o poço nunca fique seco e que não ocorra supertripsinização.
  8. Adicione 160 μL de tampão de fluxo recém-preparado (1 mM EDTA, 2% p / v de albumina de soro bovino, em PBS frio) aos poços. Pipete suavemente para cima e para baixo para dissociar as células, adicione 196 μL desta suspensão celular aos tubos de PCR seguidos por 4 μL de iodeto de propídio e misture suavemente. Preparar uma amostra de controlo sem iodeto de propídio para servir de controlo da viabilidade
  9. Coloque os tubos em um balde de gelo com a tampa bloqueando a luz e prossiga para medir a intensidade de fluorescência com um citômetro de fluxo.

5. Coleta e análise de dados

  1. Analise cada amostra com um citômetro de fluxo. Procure coletar pelo menos 2.000 células individuais vivas por amostra.
    NOTA: Minimize a exposição à luz para samples que ainda não foram analisados e mantenha no gelo.
  2. Depois que todos os dados forem coletados, transfira os arquivos para o software de sua escolha e bloqueie as células.
    1. Porta para células por área de dispersão direta (FSC-A) versus área de dispersão lateral (SSC-A).
    2. Portão para singlets dentro da população de células por FSC-A vs altura de dispersão direta (FSC-H).
    3. Porta para células vivas da população singlete, definindo uma porta vertical no histograma da intensidade da área de iodeto de propídio no valor mais alto para o controle sem iodeto de propídio preparado na etapa 4.8. Quaisquer eventos que não excedam o portão são células vivas
    4. Defina uma porta vertical em um histograma da intensidade da área Cy5 (Cy5-A) dos singlets para remover qualquer evento não fluorescente no canal Cy5-A causado por detritos celulares. Certifique-se de que essa porta vertical esteja em um valor menor que as células não rotuladas analisadas, mas maior que 0 intensidade fluorescente.
    5. Para analisar as populações de células, defina uma porta bissetriz no percentil 99 de cada respectivo controle negativo.
    6. Aplicar uma porta na mesma intensidade que as condições experimentais correspondentes e coletar a porcentagem de células que excedem a porta de controle negativo para cada condição.
      NOTA: As porcentagens podem ser comparadas diretamente entre réplicas biológicas por meio de análise estatística apropriada; Veja dados representativos.
  3. Analise os dados usando a fluorescência média de Cy5, dividindo a intensidade média do ligante-WDV pela mediana do WDV sozinho e compare esses valores entre as réplicas.

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Resultados

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Para demonstrar a utilidade e facilidade de uso dos RAD-TGTs, analisamos os efeitos dos inibidores da Rho Quinase (ROCK) no mecanótipo das células CHO-K1. A via ROCK está envolvida na organização da actina e na ativação da miosina. Estudos anteriores usando TGTs mostraram que a inibição de ROCK diminui a ruptura de TGTs de cisalhamento 16,17,18. Os TGTs de cisalhamento ou de alta força relatam as forças contráteis exercidas por ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fornecemos protocolos sobre como configurar e realizar experimentos RAD-TGT com o objetivo de incentivar cientistas de ciências da vida a incorporar a mecanotipagem em seu fluxo de trabalho. Uma das principais vantagens dos RAD-TGTs, particularmente para aqueles com capacidade de produção de proteínas, é o uso de endonucleases HUH para ligar ligantes a duplex de DNA com alta fidelidade sem qualquer reticulação química e/ou purificação. As endonucleases HUH abrangem uma família de nucleas...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. reconhece o financiamento do NIH R35GM119483. Biorender foi usado para fazer esquemas de figuras.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo Cônico de 15 mLSarstedt62.554.205
Placa de fundo de vidro de 96 poços Placa PCRCellvisP96-1.5H-N
ThermoFisher ScientificAB-0626
AmpicilinaApex Produtos de Biopesquisa 25-530
Bio-Rad Coluna de 20 mLBio-Rad7321010
Biotinilada BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Competente E. coliNew England BiolabsC2527H
Albumina de soro bovinoThermo Fisher ScientificIncubadora de cultura de células BP9703100
Thermo Fisher Centrífuga51030284
Thermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Tubulação de diáliseThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow CitômetroBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazolThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Ligante StandTecnologias integradas de DNAoligo projetadopelo usuárioGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lysogeny Broth (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
Proteína NeutrAvidinaThermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA resina Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
VWR25384-342
Solução de Iodeto de PropídioCayman Chemicals10008351
gel SDS-PAGEBio-Rad4561096
Serum Free MediaThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Usado, meios alternativos sem soro são bons para usar
Cordão de Ancoragemde Corte Tecnologias integradas de DNAoligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
TermocicladorBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
corte de 10 kDaAmikon
Descompactando Anchor StrandTecnologias integradas de DNAprojetadas pelo usuário oligo/ 5IAbRQ / GG GTG GTC GCT GCG GGC C / 3Bio /
WDV PlasmídeoAddGene226983
WDV-Equistatina PlasmídeoAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Reconstituído em DMSO
adesiva CientíficaPlaca de Petri Filtro ultracentrífugo ,

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

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