Aqui, fornecemos um método para análise de imagem de células vivas que pode ser usado para rastrear manualmente as linhagens de queratinócitos de passagem 0 e que permite a coleta de métricas de proliferação, incluindo o destino da divisão celular e a duração do ciclo celular.
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Artigo de método
Imagens de células vivas com fotografia de lapso de tempo para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos epidérmicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de células vivas é um método em evolução e um tanto desafiador para estudar o comportamento dos queratinócitos in vitro. Historicamente, o comportamento da divisão dos queratinócitos foi investigado por meio de métodos como análise clonal, imunocoloração e análise do ciclo celular. Nenhum desses métodos permite a análise do comportamento dos queratinócitos no nível de uma única célula em tempo real. Na última década, os grupos utilizaram imagens de células vivas para identificar células-tronco de queratinócitos e progenitores comprometidos sem a necessidade de rotulagem. Foram identificadas diferenças no comportamento de divisão de cada grupo respectivo, taxa de diferenciação terminal e duração do ciclo celular. Aqui, um método para imagem de células vivas de queratinócitos com fotografia de lapso de tempo e sua análise é descrito. A utilização de queratinócitos não passados é recomendada para que este método imite mais de perto o comportamento in vivo . A imagem de células vivas fornece uma capacidade única de estudar o comportamento de células-tronco e progenitores comprometidos no nível de uma única célula e determinar o destino da divisão, a duração do ciclo celular, bem como outras métricas de proliferação.
Introdução
A capacidade de visualizar populações de células in vitro em tempo real à medida que se expandem por longos períodos de tempo é um benefício exclusivo da imagem de células vivas. A imagem de células vivas permite que a motilidade, migração e proliferação celular sejam avaliadas no nível de uma única célula. O objetivo deste protocolo é otimizar a visualização de culturas de queratinócitos por meio de fotografia de lapso de tempo, produzindo vídeos que podem ser rastreados manualmente para obter dados granulares sobre o comportamento celular.
Nosso foco está na cinética de proliferação. A partir da análise dos vídeos de imagem de células vivas, as árvores de linhagem podem ser elucidadas, e o tempo entre as divisões (um proxy para a duração do ciclo celular), bem como as proporções de divisões que levam a uma divisão adicional versus diferenciação das células-filhas podem ser avaliadas.
Há uma variabilidade substancial de doador para doador ao lidar com queratinócitos primários e frequentes tentativas fracassadas de propagação celular. Por causa disso, muitos pesquisadores optam por usar queratinócitos altamente proliferativos, como células HaCaT ou queratinócitos neonatais, muitas vezes depois de terem sofrido múltiplas passagens in vitro1. A cultura de queratinócitos primários de pele adulta ou envelhecida para fins de rastreamento de linhagem pode ser um desafio. No entanto, existem problemas com o uso de células passadas de linhagens celulares ou do prepúcio masculino. A passagem repetida resulta em células que são significativamente diferentes de seu estado in vivo 2. Além disso, as células HaCaT demonstraram reagir de maneira diferente dos queratinócitos primários em vários ensaios 3,4,5. Para utilizar células que mais se assemelham às suas contrapartes in vivo, são utilizados queratinócitos de passagem 0 de doadores humanos adultos. As células-tronco de queratinócitos e os progenitores comprometidos exibem diferenças distintas no comportamento, que permitem que as colônias de qualquer população sejam distinguidas por meio de imagens de células vivas6. Essa capacidade relativamente nova de visualizar o comportamento de queratinócitos únicos a longo prazo foi usada em apenas alguns estudos anteriores usando técnicas semelhantes 6,7,8. Este protocolo descreve a imagem de células vivas de queratinócitos primários utilizando o sistema de análise de células vivas IncuCyte S3. A partir das árvores de linhagem que são construídas, o tipo de colônia pode ser determinado (célula-tronco versus progenitor comprometido), bem como a duração do ciclo celular e a proporção de divisões de diferenciação.
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Protocolo
Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. Todo o tecido humano foi obtido após aprovação do conselho de revisão institucional (IRB) da Universidade da Califórnia, São Francisco (UCSF), e o consentimento foi obtido para todos os tecidos usados.
1. Fotografia de lapso de tempo da passagem 0 queratinócitos humanos
NOTA: Este protocolo é específico para o IncuCyte S3 e SX5.
- Certifique-se de que as aprovações apropriadas do comitê de pesquisa humana da instituição tenham sido obtidas para usar tecido humano para o estudo.
- Isole os queratinócitos da pele fresca conforme descrito anteriormente9.
- Determinar a densidade de semeadura do ensaio. Realizar estudos-piloto com amostras em múltiplas diluições de diferentes doadores para entender a densidade de células necessárias para garantir colônias adequadas para estudo, mas evitar colônias excessivas que resultem em sobreposição de colônias durante o período de observação. Execute esses pilotos em condições experimentais idênticas (mesmas placas, reagentes, etc.), pois esses fatores podem alterar os resultados.
NOTA: Uma densidade de semeadura muito baixa resulta em crescimento insuficiente, enquanto uma densidade de semeadura muito alta resulta na incapacidade de rastrear células com precisão devido à aglomeração de células no campo.- Para queratinócitos de passagem 0 de prepúcios neonatais com menos de 48 h de uma coleção armazenada a 4 ° C em meio de coleta, certifique-se de que a densidade de semeadura seja de 1000-5000 / cm2. Para queratinócitos P1, use 500-2000 células/cm2. Quanto mais longe a passagem, menor a densidade de semeadura.
- Células da placa no tamanho da placa selecionado.
NOTA: Placas de 96 poços e microplacas têm um efeito de menisco, resultando em distribuição celular não uniforme, com grande parte do crescimento fora do campo do gerador de imagens. Placas com poços maiores (placas de 24 poços, por exemplo) permitem que mais dados sejam capturados. Placas de 24 poços permitem a visualização de até 36 campos, enquanto placas de 96 poços permitem a visualização de até 5 campos. No entanto, o número de campos capturados em um instrumento é finito e mais campos usarão mais da capacidade do gerador de imagens. Normalmente, uma placa de 24 poços é usada.- Para obter uma distribuição uniforme das células na placa, várias técnicas podem ser usadas. Primeiro, em vez de semear individualmente cada poço, alíquota do meio total necessário para todos os poços em uma diluição específica em um microtubo. Em seguida, pipetar o número total de células necessárias para que a alíquota atinja a densidade desejada e inverter suavemente o tubo para distribuir homogeneamente as células.
- Após o revestimento, mova a placa em um padrão cruzado três vezes (para cima e para baixo, esquerda-direita) e depois transfira para a incubadora com cuidado.
CUIDADO: Se estiver usando uma microplaca, evite as linhas e colunas externas dos poços, pois o microscópio de lapso de tempo gera calor durante a geração de imagens e pode causar evaporação do meio nesses poços. Os poços experimentais devem ser agrupados no centro da placa e cercados por poços contendo PBS ou outro fluido estéril na capacidade máxima para reduzir os efeitos de evaporação / borda.
- Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% de CO2 para permitir a aderência.
- Mude de mídia após 24 h.
NOTA: Não perturbe a monocamada em crescimento durante a sucção. Sempre use meios aquecidos (37 °C) e transmita suavemente os meios para os poços usando a parede lateral. A mídia usada aqui é Epilife / Suplemento S7 / Primocin. O uso de antibióticos em meios para imagens de células vivas de longo prazo é recomendado para esta aplicação. A cultura estendida em uma máquina usada para vários experimentos simultâneos apresenta alto risco de contaminação. Penicilina e estreptomicina são comumente usadas. - Abra a incubadora pressionando o grande botão triangular no canto inferior esquerdo para abrir a bandeja quando a luz estiver verde. Coloque a embarcação em uma baía aberta. Em seguida, feche a bandeja usando o mesmo botão no canto inferior esquerdo. Nunca abra a bandeja quando o botão a ser aberto estiver vermelho, pois isso significa que ele está digitalizando ativamente e a digitalização será interrompida.
CUIDADO: Certifique-se de que não haja varreduras começando olhando para a tela no módulo do controlador. Ele informa o tempo até a próxima varredura e a duração da varredura. Se a digitalização tiver sido iniciada, ele dará o tempo até que a verificação seja concluída. - Abra o aplicativo no computador e faça login usando o ID de usuário e a senha apropriados. Selecione Agendar.
- Pressione o botão + no canto superior esquerdo abaixo da programação para adicionar a placa à programação.
- Selecione Verificar na programação e clique em Avançar.
- Selecione Novo e clique em Avançar.
NOTA: Se esta placa for idêntica a um experimento anterior ou em execução, Copiar anterior ou Copiar atual pode ser usado para agilizar a formatação do experimento. - Selecione Padrão para o tipo de verificação e clique em Avançar.
NOTA: O bloqueio de imagem é uma placa proprietária de 96 poços que ajuda a minimizar a ocorrência de perda de foco/salto de imagem, o que pode ser útil se esses problemas forem enfrentados. Os outros tipos de varredura não são particularmente úteis para rastreamento de linhagem. - Para configurações de varredura, selecione Aderente célula por célula usando o canal de fase na objetiva de 10x e clique em Avançar.
NOTA: Desde que o canal de fase seja escolhido, nenhuma opção de análise precisa ser selecionada neste ponto, pois a análise pode ser iniciada após a captura dos dados. - Selecione a embarcação e clique em Avançar. A maioria dos vasos comuns é compatível com a máquina, embora as não microplacas possam precisar de acessórios especiais para caber nas baias do microscópio de lapso de tempo.
- Selecione um compartimento vazio para colocar a embarcação e clique em Avançar.
- Selecione os poços a serem escaneados, bem como as imagens por poço, e clique em Avançar. A duração estimada da verificação será fornecida no canto inferior esquerdo da tela.
- Nomeie o experimento usando a convenção de nomenclatura desejada. Crie um mapa de placas do experimento para referência futura e clique em OK. Por fim, clique em Avançar.
- Adie a análise até depois da coleta de dados, pois a análise célula a célula deve ser iniciada após a conclusão da verificação. Clique em Avançar.
- Por fim, defina a frequência da imagem. Para rastrear de forma confiável as mitoses, que acontecem ao longo de 30 minutos, verifique em intervalos de 20 minutos se há queratinócitos. Pressione Avançar e confirme as configurações para iniciar o experimento.
NOTA: Os tempos de digitalização não podem se sobrepor e os fabricantes recomendam que a máquina fique em repouso enquanto estiver digitalizando. Com intervalos de 20 minutos, isso significa que no máximo 10 minutos devem ser gastos na digitalização. Se 12 poços de uma placa de 24 poços estiverem sendo fotografados a 36 visualizações por poço, levará 7 minutos para a conclusão da varredura, portanto, esteja sempre atento aos recursos disponíveis para o experimento ao planejar.- Há uma notificação se houver tempo inadequado para a máquina descansar e, se os tempos de varredura se sobrepuserem, a embarcação não poderá ser adicionada à programação. Se a embarcação não couber na programação em um intervalo regular, clique em Reservar local da bandeja e clique em Avançar.
- Clique duas vezes na programação na parte superior da tela e selecione a embarcação na reserva e, em seguida, clique manualmente para adicionar imagens nos horários abertos. Como alternativa, clique com o botão direito do mouse quando o agendamento estiver aberto para excluir todos os horários de verificação agendados e clique com o botão direito do mouse para definir novos horários de verificação para um grupo de verificação em um intervalo regular.
NOTA: Isso interromperia todos os experimentos atualmente na máquina até que novos tempos fossem definidos. Não se esqueça de clicar no ícone do disquete para salvar ou no X vermelho para cancelar as alterações na programação. A seleção dos poços ou visualizações desejados é um processo simples, pois a máquina fornece imediatamente o tempo estimado de varredura após a seleção do parâmetro. A duração da varredura depende do tipo e da marca da placa selecionada, bem como do número de poços ou visualizações a serem digitalizadas. Isso permite que os usuários ajustem os parâmetros de digitalização para corresponder à capacidade da máquina.
- Para queratinócitos, trocar de meio a cada 48 h. Para garantir a orientação correta da placa, aguarde a conclusão da primeira varredura cada vez que um recipiente for colocado na máquina (se o tempo permitir). É um erro simples de cometer. Coloque a placa na máquina de forma que as letras que denotam as linhas fiquem no lado esquerdo da baia.
- Para exibir as verificações, pressione o botão Exibir com o ícone de olho e clique duas vezes no experimento. Considere mudar o meio precocemente se houver uma mudança repentina na cor do meio (meio contendo vermelho de fenol tornando-se amarelo devido à acidificação), se houver excesso de células mortas presentes (pode interferir na proliferação de colônias vivas) ou se for observada morfologia anormal.
- Quando todos os poços estiverem inativos ou atingirem a confluência, exporte o experimento. Siga as colônias adultas por ~ 2 semanas e neonatais por ~ 10 dias, momento em que a aglomeração causa retornos decrescentes para as análises.
- Para exportar, clique na guia Exibir e clique duas vezes no experimento na lista de verificações recentes (o padrão é que elas sejam ordenadas a partir do retrocesso mais recente). Clique no ícone Paisagem com a seta e aguarde a inicialização da ferramenta de exportação.
- Clique em Como exibido e, em seguida, clique em Avançar.
- Clique manualmente em cada campo de exibição a ser exportado e clique em Avançar.
- Selecione se um filme ou uma série de imagens é desejado e, em seguida, selecione os tempos de digitalização a serem exportados. Para rastreamento de linhagem de queratinócitos, use a opção de filme e selecione todas as digitalizações (há um ícone rápido Selecionar tudo com uma linha tracejada para agilizar isso). Clique em Avançar.
- Exporte a 1 quadro por segundo com qualidade máxima (defina isso usando a barra ao lado de qualidade). Clique em Avançar.
- Escolha a pasta de destino e o tipo de arquivo. Nomeie o arquivo e clique em Exportar.
NOTA: Pode levar muito tempo, dependendo da velocidade da conexão com a Internet e do computador envolvido, para exportar vídeos. Esteja preparado para esperar vários dias para exportar todos os arquivos de vídeo para experimentos maiores. Ter a capacidade de fazer login no microscópio de lapso de tempo remotamente é extremamente conveniente.
2. Usando imagens de lapso de tempo para construir árvores de linhagem e gerar folhas de dados
- Abra o arquivo de vídeo usando um reprodutor de mídia. O VLC media player é recomendado.
- Percorra os vídeos e identifique as colônias em crescimento. Com o VLC, use a tecla de seta para pular quadros para frente e para trás. Faça uma captura de tela da colônia a ser rastreada e rotule a colônia.
- Identifique uma colônia de interesse no final ou após alguns dias de gravação de vídeo, depois retroceda o vídeo e identifique a célula formadora de colônia.
NOTA: É aqui que é importante ter a densidade de semeadura apropriada. Se muitas colônias se desenvolverem próximas umas das outras, elas se expandem e se fundem, tornando impossível rastrear com precisão as divisões celulares. - Quando uma célula está prestes a se dividir, ela parece se condensar (Figura 1). Pause o vídeo quando ocorrer a divisão. Registre o tempo da divisão (um carimbo de data/hora está no canto inferior esquerdo). Faça uma captura de tela dessa divisão inicial e dê a ela o mesmo rótulo da colônia. Registre as divisões em um diagrama de linhagem desenhado à mão (consulte Resultados representativos). Continue rastreando e documentando o maior número possível de gerações.
NOTA: O rastreamento automatizado de células foi / está sendo desenvolvido para agilizar esse processo e rastrear as célulascom mais precisão 7. Mesmo em condições de cultura de baixo cálcio com diferenciação mínima, os modelos de aprendizado de máquina atualmente não têm sensibilidade para rastrear com precisão as divisões de queratinócitos. - Transcreva a árvore de linhagem manual em folhas de dados - assim chamadas de "folhas verdes" por causa da cor da planilha (Arquivo Suplementar 1).
- Use as folhas verdes para calcular as proporções de divisões proliferativas e de diferenciação, identificar colônias de células-tronco e progenitoras comprometidas e a duração do ciclo celular (ver resultados representativos).
NOTA: A máquina é capaz de analisar dados por meio de seus próprios analisadores básicos e célula por célula para executar vários outros ensaios (confluência, risco). No entanto, isso está além do escopo deste protocolo.
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Resultados
Os queratinócitos primários crescem de forma estereotipada, que pode ser rastreada por meio de imagens de células vivas. O VLC media player é usado para pesquisar gravações. O tempo até a primeira divisão é variável e pode ser de vários dias, dependendo das características do doador, como idade, estado de saúde ou fatores de crescimento presentes no ambiente in vitro . Na semeadura inicial, os queratinócitos têm uma aparência pequena e arredondada (Figura 1<...
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Discussão
A imagem de células vivas de queratinócitos é um método sem marcação para rastrear o comportamento de divisão de células-tronco e progenitores comprometidos. Dado que a manutenção da epiderme depende da cinética de proliferação de células-tronco e progenitores comprometidos10, ter uma compreensão granular das mudanças nessas populações de queratinócitos e como elas são afetadas em várias condições facilita o desenvolvimento de terapias para melhorar os defeitos de...
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Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Revisão de Mérito Número I01 CX001816 dos Estados Unidos (EUA) Departamento de Assuntos de Veteranos Ciências Clínicas Serviço de P & D (CSRD). O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos. Agradecemos ao Dr. Michael Rosenblum por nos fornecer acesso ao seu microscópio de lapso de tempo para conduzir nossos experimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Imagelock de 96 Poços | Sartorius | BA-04856 | Sugeri microplaca compatível com máquina se estiver usando uma placa de 96 poços. |
| Placa de 24 poços | Corning | 3524 | Sugero microplacas compatíveis com máquina se estiver usando uma placa de 24 poços. |
| Anfotericina B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Dilua para 5x (vem em 100x original) para 5x PSA - 1x para trocas de mídia |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Adicione a S7, considere a primocin |
| IncuCyte S3 | Sartorius | 4637 | Imager (alternativas aceitáveis para Zoom/SX5) |
| Penicilina/Estreptomicina, 100 mL | Corning | 30-002-CL | Diluir para 5x (vem em 100x de estoque) |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 mL por meio de 500 mL |
| Suplemento S7 | Gibco | S0175 | Adicionado à epivida |
Referências
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Reimpressões e permissões
