Aqui, fornecemos um método para análise de imagem de células vivas que pode ser usado para rastrear manualmente as linhagens de queratinócitos de passagem 0 e que permite a coleta de métricas de proliferação, incluindo o destino da divisão celular e a duração do ciclo celular.
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Artigo de método
Imagens de células vivas com fotografia de lapso de tempo para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos epidérmicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de células vivas é um método em evolução e um tanto desafiador para estudar o comportamento dos queratinócitos in vitro. Historicamente, o comportamento da divisão dos queratinócitos foi investigado por meio de métodos como análise clonal, imunocoloração e análise do ciclo celular. Nenhum desses métodos permite a análise do comportamento dos queratinócitos no nível de uma única célula em tempo real. Na última década, os grupos utilizaram imagens de células vivas para identificar células-tronco de queratinócitos e progenitores comprometidos sem a necessidade de rotulagem. Foram identificadas diferenças no comportamento de divisão de cada grupo respectivo, taxa de diferenciação terminal e duração do ciclo celular. Aqui, um método para imagem de células vivas de queratinócitos com fotografia de lapso de tempo e sua análise é descrito. A utilização de queratinócitos não passados é recomendada para que este método imite mais de perto o comportamento in vivo . A imagem de células vivas fornece uma capacidade única de estudar o comportamento de células-tronco e progenitores comprometidos no nível de uma única célula e determinar o destino da divisão, a duração do ciclo celular, bem como outras métricas de proliferação.
Introdução
A capacidade de visualizar populações de células in vitro em tempo real à medida que se expandem por longos períodos de tempo é um benefício exclusivo da imagem de células vivas. A imagem de células vivas permite que a motilidade, migração e proliferação celular sejam avaliadas no nível de uma única célula. O objetivo deste protocolo é otimizar a visualização de culturas de queratinócitos por meio de fotografia de lapso de tempo, produzindo vídeos que podem ser rastreados manualmente para obter dados granulares sobre o comportamento celular.
Nosso foco está na cinética de proliferação. A partir da ....
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Protocolo
Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. Todo o tecido humano foi obtido após aprovação do conselho de revisão institucional (IRB) da Universidade da Califórnia, São Francisco (UCSF), e o consentimento foi obtido para todos os tecidos usados.
1. Fotografia de lapso de tempo da passagem 0 queratinócitos humanos
NOTA: Este protocolo é específico para o IncuCyte S3 e SX5.
- Certifique-se de que as aprovações apropriadas do comitê de pesquisa humana da instituição tenham sido obtidas para usar tecido humano para o estudo.
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Resultados
Os queratinócitos primários crescem de forma estereotipada, que pode ser rastreada por meio de imagens de células vivas. O VLC media player é usado para pesquisar gravações. O tempo até a primeira divisão é variável e pode ser de vários dias, dependendo das características do doador, como idade, estado de saúde ou fatores de crescimento presentes no ambiente in vitro . Na semeadura inicial, os queratinócitos têm uma aparência pequena e arredondada (Figura 1<.......
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Discussão
A imagem de células vivas de queratinócitos é um método sem marcação para rastrear o comportamento de divisão de células-tronco e progenitores comprometidos. Dado que a manutenção da epiderme depende da cinética de proliferação de células-tronco e progenitores comprometidos10, ter uma compreensão granular das mudanças nessas populações de queratinócitos e como elas são afetadas em várias condições facilita o desenvolvimento de terapias para melhorar os defeitos de.......
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Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Revisão de Mérito Número I01 CX001816 dos Estados Unidos (EUA) Departamento de Assuntos de Veteranos Ciências Clínicas Serviço de P & D (CSRD). O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos. Agradecemos ao Dr. Michael Rosenblum por nos fornecer acesso ao seu microscópio de lapso de tempo para conduzir nossos experimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Imagelock de 96 Poços | Sartorius | BA-04856 | Sugeri microplaca compatível com máquina se estiver usando uma placa de 96 poços. |
| Placa de 24 poços | Corning | 3524 | Sugero microplacas compatíveis com máquina se estiver usando uma placa de 24 poços. |
| Anfotericina B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Dilua para 5x (vem em 100x original) para 5x PSA - 1x para trocas de mídia |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Adicione a S7, considere a primocin |
| IncuCyte S3 | Sartorius | 4637 | Imager (alternativas aceitáveis para Zoom/SX5) |
| Penicilina/Estreptomicina, 100 mL | Corning | 30-002-CL | Diluir para 5x (vem em 100x de estoque) |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 mL por meio de 500 mL |
| Suplemento S7 | Gibco | S0175 | Adicionado à epivida |
Referências
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T.
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Reimpressões e permissões
