Artigo de método

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

DOI:

10.3791/67869

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25 de abril de 2025

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1Surgical Oncology Program, NCI, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), NIBIB, NIH, 3Center for Immuno-Oncology, NCI, NIH

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve um protocolo de imunofluorescência multiplex otimizado para caracterizar a arquitetura tridimensional de metástases peritoneais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A heterogeneidade espacial do microambiente tumoral (TME) é um determinante crítico da resposta terapêutica, particularmente para agentes imuno-oncológicos, onde o sucesso depende da distribuição de subpopulações específicas de células imunes. Na última década, várias tecnologias sofisticadas foram introduzidas para obter uma resolução detalhada do TME usando seções bidimensionais de tecidos fixados em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou congelados fixos. Embora essas seções finas sejam mais fáceis de obter e analisar, elas não têm a arquitetura tridimensional necessária para caracterizar um tumor de forma confiável e abrangente. Para suprir essa limitação, foi desenvolvida uma técnica de montagem e imagem de tecido para permitir a análise tridimensional de lesões tumorais em seu estado nativo in vivo . Este protocolo descreve a obtenção de tecido tumoral humano, a montagem de amostras em plataformas impressas personalizadas e os procedimentos de coloração para amostras pós-fixação. A técnica de imunofluorescência multiplexada, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), foi adaptada para caracterizar o TME tridimensional com até 15 marcadores para células tumorais, imunes e estromais usando anticorpos disponíveis comercialmente. Profundidades de imagem de até 100 μm foram alcançadas usando um microscópio confocal a laser de luz branca invertida com um adaptador de imagem impresso personalizado e placas comerciais com fundo de vidro para garantir a orientação ideal do tecido. Este protocolo destaca o potencial do método IBEX para expandir os estudos de imunofluorescência multiplexada, fornecendo uma compreensão mais abrangente da composição do TME.

Introdução

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Os tumores sólidos são altamente variáveis, com uma composição intrincada de tipos celulares (malignos e não malignos), proteínas da matriz extracelular e fatores solúveis 1,2. Em última análise, esse microambiente tumoral (TME) heterogêneo e altamente complexo determina a suscetibilidade a tratamentos como a imunoterapia 3,4. Como tal, tecnologias como imunofluorescência altamente multiplexada 5,6 e transcriptômica espacial7 têm sido aplicadas para caracterizar a complexidade do TME em seções de espessura de camada celular (~ 4 μM).

Ao contrário das abordagens de dispersão celular, como sequenciamento de célula única e citometria de fluxo 8,9,10, essas técnicas preservam relações espaciais para contribuir com informações críticas sobre crosstalk celular e podem ser empregadas para identificar biomarcadores potenciais para previsão da resposta ao tratamento 11,12,13. No entanto, as lesões tumorais são estruturas inerentemente tridimensionais (3D), e abordagens 2D como as mencionadas acima não capturam adequadamente a complexa paisagem celular. A importância da biologia 3D tem sido apreciada no campo, como evidenciado pela ampla utilização de culturas organoides tumorais derivadas de pacientes14. No entanto, os organoides não retêm a complexidade celular do TME in vivo original, o que limita a aplicabilidade para uso com drogas imunomoduladoras ou para caracterização das diversas populações de células TME.

Embora seja possível realizar análises em seções 2D seriais e "costurar" computacionalmente as imagens para uma renderização 3D, essa técnica é proibitiva e desafiadora de realizar com alta fidelidade15. Para caracterizar tecidos 3D de maneira econômica (por exemplo, tumores) de maneira reprodutível, um método exclusivo para a preparação e coloração/análise de imunofluorescência multiplex foi desenvolvido e demonstrado usando lesões tumorais peritoneais de um paciente com câncer peritoneal primário.

Com base em uma adaptação da técnica IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity)16,17, este protocolo detalha a impressão 3D de um suporte de tecido e adaptador de imagem, aquisição e montagem de tecido peritoneal, vários ciclos de coloração com vários marcadores de tumor e tipo de célula e imagens 3D confocais de alta resolução.

Protocolo

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O estudo foi conduzido com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional do National Institutes of Health sob o protocolo NCT01915225. O tecido humano foi obtido com consentimento informado por escrito no momento da laparoscopia diagnóstica. Todo o tecido era portador de tumor, conforme determinado por inspeção visível e confirmado por exame histopatológico final. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais. Uma ilustração esquemática de todo o fluxo de trabalho é fornecida na Figura 1.

1. Plataformas de impressão, adaptador de imagem e placa de incubação

  1. Procedimentos de fatiamento/impressão 3D/pós-processamento para a plataforma e peças de placa de 9 poços (descritos na Figura 2A-C)
    1. Fatiamento: Abra o software de fatiamento e importe os arquivos de design em . STL (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Oriente os modelos para uma impressão ideal e adicione suportes. Selecione a impressora de grau médico, selecione a resina transparente e a altura da camada de 50 μm . Verifique a capacidade de impressão e envie o trabalho para a impressora.
    2. Impressão 3D: Verifique se a impressora está pronta (cartucho de resina correto, tanque e plataforma no lugar). Na tela sensível ao toque da impressora, selecione o trabalho carregado no software de fatiamento para iniciar a impressão. Quando a impressão estiver concluída, use a ferramenta de remoção para separar a peça impressa da plataforma.
    3. Pós-processamento: Enxágue a peça na unidade de lavagem com álcool isopropílico 99% (IPA) por 15 min. Remova as peças da unidade de lavagem e mergulhe em IPA fresco por 5 min.
    4. Pós-polimerize a peça por 60 min a 60 °C. Remova os suportes usando cortadores nivelados. Lixe todas as marcas de suporte usando uma lixa de grão fino, se necessário.
  2. Procedimentos de fatiamento/impressão 3D/pós-processamento para ajustador de altura e tampa externa (descritos na Figura 2A-C)
    1. Fatiamento: Abra o software de impressão e importe os arquivos de design em . STL (Arquivo Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 4). Oriente os modelos e atribua materiais. Selecione o modo de impressão desejado (alta mistura, alta velocidade) e defina as configurações do modelo para terminar como fosco. Verifique a capacidade de impressão e envie o trabalho para a impressora.
    2. Impressão 3D: Certifique-se de que a impressora tenha os materiais corretos carregados e que a bandeja de construção esteja limpa. Na interface do monitor da impressora, selecione o trabalho carregado para iniciar a impressão. Quando a impressão estiver concluída, use a ferramenta raspadora para remover cuidadosamente a peça impressa da bandeja de construção.
    3. Pós-processamento: Coloque as peças impressas em um limpador a jato de água ou em um sistema de limpeza por agitação para remover o material de suporte. Execute qualquer remoção manual do suporte, se necessário, usando ferramentas como pinças ou alicates.
  3. Corte a laser do controle deslizante da plataforma (mostrado na Figura 2A, C)
    1. Preparando o design: Importe o *. DWG no software vetorial (Arquivo Suplementar 5). Defina as cores da linha como vermelho (RGB) para corte vetorial. Envie o trabalho para o cortador a laser.
    2. Configurando o cortador a laser: Abra o software do cortador a laser e importe o arquivo de design. Selecione o tipo de material e ajuste as configurações de potência, velocidade e resolução para acrílico de 1/32" de espessura. Coloque o material no leito do laser, certifique-se de que esteja alinhado corretamente e foque o laser.
    3. Corte a laser: Inicie o processo de corte a laser e monitore para garantir que o material esteja sendo cortado corretamente.

2. Montagem de tecido em plataformas impressas

  1. Preparação do meio de colheita e mesa de preparação
    1. Suplementar 100 mL de DMEM (baixo teor de glicose) com Anti-Anti e colocar em uma incubadora a 37 °C até que seja necessário (meio de colheita).
    2. Monte uma "mesa de preparação" na sala de cirurgia com os seguintes itens: plataformas impressas em 3D autoclavadas, pacote de 2-0 laços de sutura de seda, placa de aquecimento, copo de amostra com 50 mL de meio de colheita pré-aquecido, placa de cultura de 15 cm contendo 30 mL de meio de colheita pré-aquecido e uma placa de 24 poços com 4 poços cada um contendo 1,5 mL de meio de colheita (coloque tudo na placa de aquecimento), 1 par de pinças e 1 par de tesouras cirúrgicas.
  2. Ressecção e montagem de tecido
    NOTA: O tecido é obtido na sala de cirurgia. Áreas de peritônio com focos de tumor menores que 0,5 mm de espessura e diâmetro são identificadas na inspeção visual (Figura 2D). É importante notar que ~ 2 cm2 de tecido (peritônio) são necessários para preparar uma plataforma.
    1. Separe cuidadosamente o peritônio portador do tumor da musculatura e fáscia da parede abdominal subjacente (realizado pelo cirurgião). Transfira as folhas de tecido resultantes para um copo de amostra contendo meio de colheita quente e coloque em uma placa de aquecimento (mesa de preparação).
    2. Montar o tecido em plataformas na placa de 15 cm que contém o meio de colheita. Coloque cuidadosamente o tecido portador do tumor (lado mesotelial voltado para cima) sobre o pequeno orifício da plataforma e prenda-o no lugar com uma sutura de seda 2-0. Coloque a plataforma de tecido preparada inversamente (submersa) em uma placa de 24 poços contendo meio de colheita (Figura 2E-G).
      NOTA: Monte o tecido ensinado o suficiente para evitar dobras na superfície da plataforma, mas não gere tensão, pois isso induzirá alterações biomecânicas e fisiológicas indesejadas.

3. Procedimento de fixação/coloração/branqueamento

NOTA: As alterações do protocolo original adaptado para FFPE de 4 μm de espessura ou seções congeladas fixas são descritas na Figura 3. A Tabela 1 fornece uma lista de anticorpos (com diluições) usados para as rodadas IBEX 1-6.

  1. Fixação
    1. Prepare 40 mL de tampão de fixação adicionando 10 mL de estoque de fixador a um tubo cônico de 50 mL contendo 30 mL de PBS 1x frio.
    2. Com uma pinça, transferir o tecido montado em plataformas para o tampão de fixação e incubar durante 24 h a 4 °C.
    3. Transvase o fixador e substitua-o por 40 mL de PBS 1x frio e incube por 10 min a 4 °C.
  2. Mancha
    1. Adicione 1 mL de tampão de bloqueio (1% BSA, 0,3% Triton-X-100, 1% Fc Block em 1x PBS filtrado com filtro de seringa de 0,22 μm) a cada poço e insira plataformas de tecido. Bloqueie por pelo menos 2 h em temperatura ambiente em um balancim ajustado para baixa velocidade (30 rpm).
      NOTA: Certifique-se de que o entalhe na plataforma e o sulco no poço estejam alinhados. Esta etapa não é sensível ao tempo e pode ser feita durante a noite a 4 °C.
    2. Prepare 0,8 mL de solução de anticorpo/corante em um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 10.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Transfira 0,75 mL para um poço limpo da placa de incubação de 9 poços e insira uma plataforma lavada.
    3. Embrulhe a placa em papel alumínio e incube por pelo menos 2 h em temperatura ambiente em um balancim ajustado para baixa velocidade (30 rpm).
    4. Lave a plataforma em um tubo cônico de 50 mL com 40 mL de 1x PBS por 10 min a 4 °C. A plataforma agora está pronta para ser inserida no adaptador de imagem.
  3. Branqueamento
    1. Após cada rodada de coloração e imagem, branqueie os fluoróforos usando o agente redutor de éster borohidreto de lítio (LiBH4). Este tratamento eliminará os sinais de fluorescência do Alexa Fluor (AF) 488, AF647 e AF750, mas não do AF594 e do corante nuclear Hoechst.
      CUIDADO: O borohidreto de lítio é extremamente reativo com a água. Gases hidrogênio inflamáveis são liberados ao entrar em contato com a água; Borohidreto de lítio usado e descartáveis contaminados com borohidreto de lítio precisam ser descartados como resíduos perigosos.
    2. Prepare 5 mL de solução de LiBH4 1,5 mg/mL em água destilada (em uma coifa química) e incube por 30 min em temperatura ambiente.
      NOTA: A solução LiBH4 perderá sua eficácia de redução/branqueamento quando preparada >4 h antes do uso.
    3. Transfira 1 mL de solução de LiBH4 para um poço limpo da placa de incubação de 9 poços e insira a plataforma lavada por 60 min em temperatura ambiente.
    4. Lave a plataforma brevemente em 20 mL de 1x PBS em um tubo cônico e verifique o sinal de fluorescência restante usando a configuração de laser mais alta para compensação Z na rodada de imagem anterior antes de prosseguir para as rodadas subsequentes de coloração.
    5. Repita o bloqueio da amostra por 2 h à temperatura ambiente antes de prosseguir para a próxima etapa de incubação de anticorpos.

4. Procedimento de imagem

  1. Montagem de adaptadores/plataformas de imagem
    1. Adicione 0,1 mL de 1x PBS ao centro do fundo de vidro de uma placa de imagem de 3,5 cm e reserve. Aparafuse o anel de ajuste de altura frouxamente no sentido horário na tampa externa e monte a plataforma no suporte de plástico interno (alinhamento entalhe-sulco). Prenda a plataforma com o controle deslizante.
    2. Coloque o adaptador de imagem montado no prato de fundo de vidro e abaixe cuidadosamente o anel de ajuste de altura até que o tecido toque o tampão. Evite girar a plataforma no fundo do vidro.
    3. Quando a distância ideal do vidro for atingida, adicione 0,2 mL de 1x PBS no tecido (agora com o lado inferior para cima) para evitar a desidratação do tecido durante a imagem.
  2. Imagem confocal
    1. Ligue todos os componentes do microscópio confocal invertido, incluindo o computador, o microscópio, o laser e a fonte de luz LED para uso da ocular. Inicie o software de aquisição de imagem .
    2. Selecione a objetiva apropriada (por exemplo, 20x ou 40x) e adicione o meio de imersão apropriado. Por exemplo, uma objetiva de água 20x é usada neste estudo; ~200 μL de água são adicionados à objetiva para evitar o ressecamento durante aquisições de imagens longas.
    3. Coloque o prato de imagem montado no suporte de amostra no microscópio stage e certifique-se de que a amostra esteja segura (não se mova).
      NOTA: Ao colocar a amostra montada no microscópio stage, observe a posição do entalhe e use a mesma posição para ciclos iterativos para facilitar o alinhamento da imagem. É importante manter o adaptador de imagem na configuração de altura ideal para rodadas consecutivas.
    4. Centralize a amostra usando o controle XY e traga a objetiva até a lamínula. Olhando através da ocular e usando o sinal Hoechst como referência, mova a objetiva para obter um foco fino no tecido.
    5. Selecione as linhas de laser apropriadas ou ajuste o WLL aos espectros de excitação e emissão dos fluoróforos usados para corar a amostra de tecido. Elimine a sobreposição entre os canais ajustando as configurações e adicione sequências se os fluoróforos tiverem espectros de excitação semelhantes.
    6. Escolha os seguintes parâmetros de aquisição de imagem: velocidade de digitalização 600 Hz, resolução XY 1024 x 1024, médias de 3 linhas e digitalização bidirecional .
    7. Escolha os seguintes parâmetros da pilha Z: (1) use o tamanho da etapa Z otimizado para a objetiva que está sendo usada, (2) defina o início e o fim da pilha, (3) ajuste os parâmetros de compensação Z para obter brilho igual em toda a pilha e (4) adquira uma pilha de teste de 1 bloco com uma média.
    8. Defina a região a ser criada e adquira uma pilha Z de bloco de alta resolução.

Resultados

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O peritônio é uma estrutura membranosa com menos de 1 mm de espessura que reveste a superfície da parede abdominal e é contígua às superfícies dos órgãos abdominais. É composto de mesotélio superficial e tecido conjuntivo subjacente que é intercalado com células adiposas, linfócitos, macrófagos e fibroblastos, bem como vasos sanguíneos e linfáticos. As neoplasias peritoneais geralmente resultam de metástases tumorais abdominais (por exemplo, câncer de ovário ou câncer gástrico)18 ou, menos frequentemente, podem ser tumores primários do peritônio (por exemplo, mesotelioma)19. Essas lesões tumorais geralmente pequenas (<1 cm) são altamente complexas, mas são passíveis de caracterização 3D usando a técnica descrita. Uma projeção máxima de cinco seções confocais é usada para visualizar toda a amostra montada em uma plataforma (Figura 4, inserida no canto superior esquerdo). Três anticorpos conjugados primários (AF488-CD44, AF594-CD45 e AF647-Podoplanina) juntamente com o corante nuclear Hoechst foram usados para a primeira rodada de IBEX (IBEX1, Figura 4). As lesões tumorais tornam-se evidentes pelas estruturas em forma de roseta que são duplamente positivas para CD44 e Podoplanina e mostram um arranjo de núcleos característico do mesotelioma papilar.

As células tumorais foram identificadas usando morfologia celular e dois anticorpos, uma vez que tanto a anti-podoplanina quanto o anti-CD44 reconhecem células não tumorais, como evidenciado pela detecção de vasos linfáticos via anti-podoplanina e a ligação do anticorpo CD44 a subconjuntos de células imunes. Regiões de interesse (ROIs) menores são então capturadas usando um formato de varredura de bloco em resolução mais alta em tamanhos de passo Z otimizados para renderizar projeções 3D (Figura 5A). As plataformas foram levadas através dos procedimentos de coloração iterativos e as mesmas ROIs foram visualizadas nos ciclos IBEX 1-6. Imagens representativas para interfaces tumorais (caixa amarela) e tumor-estrutura linfóide terciária (TLS) (caixa azul) são montadas na Figura 5B-M.

A presença de TLS e a densidade de células CD3-positivas indicam infiltração significativa de células imunes20 e possivelmente capacidade de resposta a drogas imunomoduladoras21. É importante notar que o TLS e a maior parte das lesões tumorais estão presentes em diferentes profundidades Z do tecido, conforme demonstrado na comparação de projeções de pilha de diferentes seções ópticas na Figura 6, destacando os benefícios da imagem 3D e a potencial biologia perdida quando a imagem 2D é aplicada a estruturas 3D. O caráter 3D dessas lesões torna-se mais evidente nos arquivos de filme (Filme 1-12), que retratam representações de volume das lesões individuais na Figura 5.

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Figura 1: Fluxo de trabalho da impressão 3D para a imagem 3D de tumores peritoneais. O protocolo consiste em uma sequência de cinco etapas para preparar imagens multiplexadas em 3D a partir de tecido peritoneal portador de tumor. (1) Impressão de plataformas receptoras de tecidos, peças adaptadoras de imagem e placa de incubação. (2) Procedimentos de colheita e montagem de tecidos. (3) Fixação com paraformaldeído. (4) Ciclos de coloração e imagem IBEX. (5) Reconstrução 3D usando software de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Componentes de hardware com interface de tecido para imagens 3D. (A) Diagrama esquemático da montagem da plataforma dentro do adaptador de imagem. (B) Uma placa de incubação de 9 poços. (C) Fotografias de componentes do adaptador de imagem com montagem. (D) Peritônio com mesotelioma observado durante a laparoscopia diagnóstica. (E) Montagem de tecido na plataforma. (F, G) Peritônio portador de tumor montado em plataformas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Esquema da linha do tempo dos ciclos IBEX. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Visão geral da plataforma após a incubação com o painel IBEX1. Projeção máxima de toda a plataforma após incubação com painel IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 e AF647-Podoplanina). O círculo tracejado destaca o tumor. Inserção: Fotografia do peritônio portador de tumor montado na plataforma de imagem. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Imagens de imunofluorescência de alta resolução de regiões selecionadas da plataforma. (A) Projeção máxima da imagem mesclada da pilha Z de 56 blocos adquirida após incubação com o painel IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 e AF647-Podoplanina). Retângulo amarelo: lesão tumoral mostrada em painéis (B-G). Retângulo azul: interface tumor-estrutura linfoide terciária mostrada em (H-M). (BG) Uma lesão tumoral individual com painel IBEX 1-6 em renderização de volume. (B) IBEX1, verde: CD44, vermelho: CD45, ciano: Podoplanina. (C) IBEX2, verde: CD20, vermelho: F-actina, ciano: CD3. (D) IBEX3, verde: CD8, vermelho: CD4, ciano: panCK. (E) IBEX4, verde: CD31, ciano: CD68. (F) IBEX5, verde: CD206, ciano: Calretinina. (G) IBEX6, verde: Vimentina, vermelho: HLADR. (H-M) Uma interface individual de estrutura linfóide tumor-terciária com o painel IBEX 1-6 em renderização de volume. (H) IBEX1, verde: CD44, vermelho: CD45, ciano: Podoplanina. (I) IBEX2, verde: CD20, vermelho: F-actina, ciano: CD3. (J) IBEX3, verde: CD4, vermelho: panCK, ciano: CD8. (K) IBEX4, verde: CD31, vermelho: SMA, ciano: CD68. (L) IBEX5, verde: CD206, ciano: Calretinina. (M) IBEX6, verde: HLADR, ciano: Vimentina. Todos os painéis, azul: Hoechst. Barras de escala: (A, 1 mm); (B-M, 250 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Imagem 2D simulada. A comparação das projeções limitadas (10 seções ópticas) e full stack (102 seções ópticas) confirma a perda de contexto do tecido na simulação 2D. (A) Projeção máxima das seções 30-40 (10 μm). (B) Projeção máxima das seções 85-95 (10 μm). (C) Projeção máxima das seções 1-102 (~ 100 μm). Todos os painéis, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-faloidina). Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Anticorpos usados para os painéis IBEX individuais. Clique aqui para baixar esta tabela.

Filme 1: Renderização de volume animado da lesão individual com o painel IBEX 1 (azul: Hoechst, verde: CD44, vermelho: CD45, ciano: Podoplanina). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 2: Renderização de volume animado da lesão individual com o painel IBEX 2 (azul: Hoechst, verde: CD20, vermelho: F-actina, ciano: CD3). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 3: Renderização de volume animado da lesão individual com o painel IBEX 3 (azul: Hoechst, verde: CD8, vermelho: CD4, ciano: panCK). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 4: Renderização de volume animado da lesão individual com o painel IBEX 4 (azul: Hoechst, verde: CD31, ciano: CD68). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 5: Renderização de volume animado da lesão individual com o painel IBEX 5 (azul: Hoechst, verde: CD206, ciano: Calretinina). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 6: Renderização de volume animado da lesão individual com o painel IBEX 6 (azul: Hoechst, verde: Vimentin, vermelho: HLADR). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 7: Renderização de volume animado da interface estrutura-lesão linfoide terciária com o painel IBEX 1 (azul: Hoechst, verde: CD44, vermelho: CD45, ciano: Podoplanina). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 8: Renderização de volume animado da interface estrutura-lesão linfóide terciária com o painel IBEX 2 (azul: Hoechst, verde: CD20, vermelho: F-actina, ciano: CD3). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 9: Renderização de volume animado da interface estrutura-lesão linfóide terciária com o painel IBEX 3 (azul: Hoechst, verde: CD8, vermelho: CD4, ciano: panCK). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 10: Renderização de volume animado da interface estrutura-lesão linfóide terciária com o painel IBEX 4 (azul: Hoechst, verde: CD31, vermelho: SMA, ciano: CD68). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 11: Renderização de volume animado da interface estrutura-lesão linfóide terciária com o painel IBEX 5 (azul: Hoechst, verde: CD206, ciano: Calretinina). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 12: Renderização de volume animado da interface estrutura-lesão linfoide terciária com o painel IBEX 6 (azul: Hoechst, verde: Vimentin, vermelho: HLADR). Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Arquivo suplementar 1: Arquivo de impressão para a placa de incubação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Arquivo de impressão para as 36 plataformas individuais. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3: Imprima o arquivo para o anel de ajuste de altura. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 4: Imprima o arquivo para a tampa externa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 5: Arquivo de corte a laser para o controle deslizante. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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As técnicas multiplex atuais para imagens de fluorescência são restritas a seções finas e não fornecem contexto 3D. O presente estudo descreve um protocolo para aplicar o método de imagem IBEX16,17 a tumores intactos montados em plataformas personalizadas. As lesões tumorais peritoneais foram escolhidas para destacar a técnica, pois os pacientes geralmente apresentam múltiplos depósitos tumorais de tamanho ideal que são retirados junto com o peritônio normal circundante como parte da cirurgia de citorredução padrão realizada na maioria dos centros de referência terciários em todo o mundo22,23. O protocolo é, no entanto, aplicável a metástases parenquimatosas e tumores em modelos de camundongos usando fatias tumorais, como descrito anteriormente24,25. Além disso, o diâmetro do anel de montagem nas plataformas pode ser ajustado às necessidades experimentais/teciduais, embora áreas maiores sejam propensas à flacidez do tecido e tempos de imagem prolongados. Independentemente da fonte e tamanho do tecido, o tempo entre a colheita e a preservação deve ser mínimo para garantir a qualidade ideal26. A configuração de uma mesa de preparação na sala de cirurgia garante um processamento rápido quando os pacientes estão envolvidos. O tempo desde a colheita até a fixação do tecido deve ser observado para garantir a comparabilidade entre os experimentos.

As amostras de tecido são coletadas através do protocolo IBEX à medida que montagens inteiras, ou seja, as etapas de fixação e imagem, bem como de clareamento, são realizadas com o tecido intacto afixado à plataforma. Isso garante a preservação da amostra por meio dos ciclos iterativos de coloração/imagem/branqueamento, uma vez que não há interface semipermanente de vidro de seção e não há necessidade de colocar/remover repetidamente uma lamínula do tecido, o que pode levar à perda de tecido. Para economizar em reagentes, a placa de 9 poços projetada sob medida garante um ajuste ideal da plataforma com o mínimo de "volume morto". Todos os anticorpos usados para coloração são anticorpos conjugados primários, e todos os conjugados de fluoróforo usados (exceto o corante Hoechst) são corantes Alexa Fluor, que foram escolhidos por seu excelente brilho27. Outros fluoróforos Os painéis de anticorpos foram projetados de acordo com dados depositados da comunidade de imagens IBEX, um repositório aberto e global que coleta conjuntos de dados, protocolos e feedback de um grupo internacional de cientistas que usam o IBEX (https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/). A sequência de painéis de anticorpos foi cuidadosamente escolhida. Em geral, alvos com baixa abundância foram colocados em ciclos anteriores. O ciclo 1 do IBEX (CD45, CD44 e Podoplanina) é uma exceção, pois esses três marcadores foram usados para identificar lesões tumorais na rodada inicial de coloração.

Os painéis de anticorpos são comparativamente pequenos para reduzir a diafonia do canal em configurações de alta intensidade de laser, o que é necessário para obter imagens mais profundas do tecido usando um microscópio confocal. Os conjugados AF750 foram incluídos sempre que possível para expandir o painel de 2 para 3 anticorpos. É importante notar que não há muitos conjugados AF750 disponíveis comercialmente, e o fato de que o alvo para este canal deve ser altamente abundante limita o uso deste fluoróforo. Um exemplo é o anticorpo anti-SMA conjugado com AF750 que foi usado neste protocolo. Embora este seja um clone que funciona de forma confiável conjugado ao AF488 ou AF594, a intensidade do sinal para este anticorpo conjugado com o AF750 é significativamente menor, o que dificulta a geração de pilhas Z de alta qualidade.

As incubações de anticorpos de 3 h à temperatura ambiente são curtas em comparação com o protocolo original e refletem provavelmente a menor densidade celular em amostras de tecido peritoneal. Em contraste, a etapa de clareamento com borohidreto de lítio 1,5 mg/mL por 60 min foi mais rigorosa. Esses parâmetros foram determinados empiricamente e podem variar com o tecido e os anticorpos usados. É importante notar que, devido à incubação na solução de branqueamento reativa, pequenas bolhas de ar podem ficar presas no tecido. Sempre que isso se tornava evidente durante a etapa de imagem do procedimento, as amostras eram desgaseificadas expondo a plataforma na placa de incubação de 9 poços ao vácuo usando um recipiente de sucção. Registros simples de amostras ITK, frequentemente aplicados em estudos IBEX, não puderam ser realizados devido à entrada de dados esmagadora no software de análise de imagens. No entanto, populações de células idênticas são facilmente identificadas comparando conjuntos de dados individuais. No geral, os ciclos iterativos foram cronometrados de forma que um ciclo pudesse ser concluído em um dia, com a imagem ocupando a maior parte de um ciclo inteiro (~ 8 h).

A técnica tem limitações que merecem menção. O requisito de tempo do protocolo torna improvável que esse método seja adotado amplamente, mas sim em circunstâncias selecionadas. Prevemos que este protocolo seja melhor utilizado para caracterizar alterações no microambiente imunológico do tumor pré e pós-tratamento (por exemplo, anticorpos biespecíficos para imunoterapia contra o câncer) ou para prever os resultados gerais do tratamento. Embora este protocolo ofereça caracterização 3D, não se sabe quanta área deve ser interrogada para descrever efetivamente um tumor, incluindo suas populações de células complexas28. O acesso a tecido humano fresco também pode ser difícil em certos centros, mas prevemos que esse protocolo também seja aplicável a modelos animais29.

As aplicações para este protocolo são diversas, desde pesquisa básica analisando a composição do TME em vários tumores sólidos até biópsias pré/pós-tecido para pacientes inscritos em ensaios clínicos. Embora os dados obtidos de uma única seção de tecido espesso da camada de células sejam imensos, a biologia 3D pode ser facilmente negligenciada. Vemos a imagem 3D como um complemento a outras técnicas de biologia espacial, provavelmente auxiliando na seleção de seções 2D para análises subsequentes. Além disso, um protocolo para incorporar um componente de imagem ao vivo ao longo de várias horas usando a montagem de tecido descrita e a configuração de imagem está ativamente em andamento.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde e do Instituto Nacional do Câncer (NCI). Esta pesquisa também foi parcialmente apoiada pelo CAT-I, uma colaboração de pesquisa entre o NIAID e o NCI, liderada por Ronald Germain. Gostaríamos de estender nossa gratidão a Andrea Radtke por seus esforços entusiasmados e colaborativos. Sua experiência beneficiou muito este estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor Plus 750 FaloidinaInvitrogenA30105Corante F-actina
Alexa Fluor 488 anti-CD206 humano (MMR) AnticorpoBioLegend321114
Anticorpo Alexa Fluor 488 anti-CD31 humano AnticorpoBioLegend303110Anticorpo
Alexa Fluor 488 Anticorpo anti-CD4 humanoBioLegend300519anticorpo
Alexa Fluor 488 anticorpo anti-humano HLA-DRBioLegend307656anticorpo
Alexa Fluor 488 anti-camundongo/humano CD44 AnticorpoBioLegend103016
Alexa Fluor 594 anti-humano CD45 AnticorpoBioLegend304060
Anticorpo Alexa Fluor 647 Anti-Calretinina [EP1798]Abcamab214244
anticorpo Alexa Fluor 647 anti-humano CD3Anticorpo 300416 BioLegend
Anticorpo anti-CD8 humano Alexa Fluor 647 Anticorpo344726
BioLegend Anticorpo anti-podoplanina humana Alexa Fluor 647 Anticorpo337007BioLegend
Anticorpo anti-Vimentina Alexa Fluor 647Anticorpo677807
Alexa Fluor 647 Anticorpo CD68 (KP1)Santa Cruzsc-20060AF647anticorpo
Alexa Fluor 750 Citoqueratina, pan Anticorpo (AE-1 / AE-3)NovusNBP2-33200AF750
Anticorpo Alexa Fluor 750 Humano alfa-Smooth Muscle Actina R& DIC1420Santicorpo
Alexa Fluor 488 CD20 Anticorpo monoclonal (L26) eBioscienceThermo Fisher53-0202-82anticorpo
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240096suplemento meio de colheita
BioMed Resina Transparente (Forma 3)Resina FormLabsRS-F2-BMCL-01usada para plataforma + placa de incubação
BSASigmaA7906-500gComponente da solução de bloqueio
Material de acrílico fundido de 1/32" de espessurausado para cortar o slider
CleanStation DT3 Pós-processamento StratasysDT3para ajustador de altura e tampa externa
Recipiente, EspécimeMcKesson870203transferência de tecido da mesa de peração para a mesa de preparação
CorelDraw CorelDRAWSoftware para preparar o arquivo de design baseado em vetor para corte a laser
Fixadorde 554655CytofixBD Bioscience
353025Falconde 15 cmusado durante a montagem
Prato de 35 mm Nº 1.5 Lamínula 14 mm Diâmetro do vidro Prato de imagem não revestidoMatekP35G-1.5-14-C
DMEM (sem glicose)Gibco11966025meio de colheita
Fc BlockBD Bioscience564220componente de solução de bloqueio
Form 3B +FormlabsForm 3B +impressora usada para plataforma + placa de incubação
Form CureFormlabsFH--01 pós-processamentopara plataforma + placa de incubação
Form WashFormlabsFH-WA-01 pós-processamentopara plataforma + placa
GrabCAD PrintGrabCADGrabCADSoftware de impressão para preparar modelos para impressoras Stratasys
Hoechst 33342 10 mg/mLBiotium40046corante nuclear
J826 Prime Impressora 3DImpressora StratasysJ826usada para ajustador de altura e tampa externa
LAS XLeicaLAS XSoftware confocal
Sistema de corte a laser Universal Laser SystemsULS PLS6.150DCO2 Corte a laser usado para slider
Borohidreto de lítioSTREM Chemicals93-0397branqueamento químico
PBS, pH 7.4Base de 10010023 GibcoTampão para lavar, bloquear, manchar
PreFormFormLabsSoftware PreForm para preparar modelos para impressoras Formlab
Suturas de seda  2-0 EthiconA305. O35fixa tecido à plataforma
Stellaris 8 WLL microscópio confocalLeicaSTELLARIS 8Imagem Confocal 
de seringasolução ab Triton
X-100American BioAB02025-00100reagente permeabelizante, componente de solução de bloqueio
Vero ContactClearStratasysCTT610, 4 KGresina usada para ajustador de altura e tampa externa
Mola da bandeja de aquecimentoEUAST-1220mantém a mídia e o tecido aquecidos
Água destiladaDiluente Gibco15230-170para LiBH4
Prato de de incubaçãoFiltro

Referências

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