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Artigo de método

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

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DOI:

10.3791/67877

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7 de fevereiro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services, Keenan Research Centre, 3Polytech Clermont, 4Department of Medicine, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos aprimoramentos e atualizamos métodos para o ensaio monocito-monocamada (MMA) existente, no qual os macrófagos são usados para ajudar a prever melhor a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos na medicina transfusional e imunologia. Este ensaio é denominado ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA).

Resumo

Derivados de monócitos na medula óssea, os macrófagos são células imunes grandes e inatas que desempenham um papel importante na eliminação de células mortas, detritos, células tumorais e patógenos estranhos. A capacidade fagocítica de monócitos versus macrófagos é um conceito que não é bem compreendido. Aqui, pretendemos examinar uma diferença na fagocitose de monócitos versus macrófagos, especificamente macrófagos M1 / M2, contra vários glóbulos vermelhos opsonizados usando uma versão modificada e atualizada do ensaio de monocamada de monócitos estabelecido (MMA). Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de revestimentos buffy de doadores. Usando monócitos purificados, macrófagos inflamatórios M1 e M2 anti-inflamatórios foram produzidos por cultura in vitro e polarização. As células M1 / M2 foram colhidas e usadas em um ensaio semelhante ao MMA, ao qual nos referimos como M-MA, para decifrar a fagocitose clinicamente significativa de vários anticorpos de glóbulos vermelhos. Um índice fagocítico (IP) > 5 foi considerado fagocitose clinicamente significativa com o uso de monócitos. Um índice fagocítico (IP) > 12 foi considerado fagocitose clinicamente significativa com o uso de macrófagos M1/M2. Os macrófagos M2 demonstram uma capacidade aumentada de fagocitar hemácias opsonizadas em comparação com monócitos e M1s. O mesmo anticorpo fraco (anti-S) produz fagocitose significativa apenas com macrófagos M2 (PI = 43), mas não M1s (PI = 2) ou monócitos (PI = 0), e isso foi demonstrado repetidamente usando vários anticorpos. O uso de macrófagos M2 em vez de monócitos pode permitir resultados mais precisos, pois essas células são mais fagocíticas, oferecendo maior relevância clínica ao ensaio. Estudos adicionais com diferentes anticorpos para glóbulos vermelhos, incluindo a validação do ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA) com anticorpos com significado clínico conhecido, podem mostrar o M-MA mais útil para ajudar a prever aloanticorpos de glóbulos vermelhos clinicamente significativos e reações transfusionais. Este método avançará no campo da medicina transfusional e imunologia.

Introdução

A previsão de reações transfusionais continua sendo um desafio significativo no campo da medicina transfusional. Nas últimas 4 décadas, o ensaio monócito-monocamada (MMA), iniciado por Tong e Branch 1,2, serviu como um valioso ensaio celular in vitro para prever o resultado clínico da hemólise em pacientes transfusionados de sangue1. De fato, este ensaio tem sido fundamental na distinção entre anticorpos de glóbulos vermelhos (RBC) clinicamente significativos e insignificantes2. Embora os monócitos tenham sido tradicionalmente o leucócito padrão usado neste ensaio, nossa pesquisa visa explorar os benefícios potenciais do uso de macrófagos derivados de monócitos como alternativa. Essas células podem aumentar a capacidade dos ensaios de avaliar a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos.

No MMA histórico, os monócitos, que são os precursores dos macrófagos, as células imunes responsáveis pela depuração e destruição dos glóbulos vermelhos durante uma reação transfusional adversa, são introduzidos em um ensaio in vitro junto com hemácias e anticorpos 1,2,3,4,5,6,7 . A fagocitose é então avaliada visualmente pela contagem de hemácias fagocitadas dentro dos monócitos. Um índice fagocítico (IP) de < 5 hemácias fagocitadas por 100 monócitos contados indica que o paciente tem um risco reduzido de sofrer uma reação transfusional adversa, e o anticorpo é considerado clinicamente insignificante 4,5,6,7. Experimentos preliminares demonstram que o uso de monócitos derivados do sangue periférico pode não ser ideal para determinar o significado clínico, pois eles têm uma capacidade fagocítica menor do que os monócitos ativados e certos macrófagos.

Os monócitos são um subconjunto de células encontradas no sangue, baço e medula óssea e representam 10% do total de leucócitos em humanos8. Essas células normalmente circulam por 1-2 dias antes de serem recrutadas por diferentes tecidos, onde passam a se diferenciar em macrófagos8. Isso geralmente acontece durante a hematopoiese, na qual a medula óssea produz monócitos que são liberados na circulação para se tornarem macrófagos teciduais que residem no baço e no fígado2. Conhecidos como a primeira linha de defesa contra patógenos estranhos, os macrófagos são grandes células mononucleares fagocíticas que desempenham um papel na imunidade adaptativa e inata9. Entre os papéis intrincados e complexos do sistema imunológico, entender e caracterizar os fenótipos dos macrófagos apresenta um desafio formidável que ainda não foi totalmente compreendido. Nas últimas duas décadas, a noção de polarização de macrófagos ganhou reconhecimento crescente, com estudos recentes empregando o uso de sequenciamento de RNA de célula única para discernir o espectro em que esses macrófagos existem.

Macrófagos M1 e M1-like classicamente ativados surgem em ambientes inflamatórios dominados por receptores Toll-like (TLRs)10. Essas células podem estar envolvidas em doenças autoimunes e arteriosclerose e apresentar marcadores de superfície como MHC-II, CD80 e CD8611,12. Os macrófagos anti-inflamatórios M2 e M2-like são encontrados em ambientes dominados por respostas Th2, não expressam CD80 e apresentam marcadores de superfície como CD209 e CD20611,12. Macrófagos M1/M2 podem ser cultivados in vitro a partir de células mononucleares do sangue periférico, com lipopolissacarídeo (LPS) e citocinas como GM-CSF e IFNγ (M1) e M-CSF e IL-4 (M2) estimulando sua polarização10,12.

Este manuscrito e estudos associados têm como objetivo demonstrar que os macrófagos M2 exibem maior sensibilidade à fagocitose em comparação com os macrófagos e monócitos M1. Investigar a atividade fagocítica de macrófagos M1/M2 versus monócitos no contexto de aloanticorpos de hemácias e medicina transfusional é uma área que ainda não foi explorada. Aqui, descrevemos o trabalho atual em andamento para a geração de macrófagos M1 / M2 e comparamos o ensaio clássico de monocamada de monócitos (MMA) com o novo ensaio de monócitos-macrófagos, usando a sigla M-MA para distinguir este ensaio de macrófagos do ensaio de monócitos, para melhorar o valor preditivo dos ensaios de fagocitose in vitro .

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Protocolo

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais para a realização de pesquisas éticas envolvendo seres humanos. A aprovação ética foi concedida pelo Conselho Canadense de Ética em Pesquisa de Serviços de Sangue (REB), aprovação CBSREB#2023.008. Todas as etapas deste protocolo devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança em condições estéreis.

1. Isolamento de PBMCs

  1. Obtenha sangue humano total de um doador em um tubo ACD. Armazene o sangue em temperatura ambiente (18 °C a 22 °C) por até 36 h.
  2. Transfira os tubos ACD de sangue total para tubos de centrífuga de 50 mL (um único tubo de 50 mL para cada dois tubos ACD). Adicione o meio completo RPMI-1640 à temperatura ambiente a um volume final de 35 mL.
  3. Adicione 15 mL de meio gradiente de densidade de temperatura ambiente a um novo tubo de 50 mL. Coloque cuidadosamente o sangue total diluído em cima do meio de gradiente de densidade, minimizando a mistura na interface para uma separação ideal do sangue.
  4. Centrifugue a mistura em camadas a 700 x g por 30 min com os freios DESLIGADOS. A centrifugação do gradiente de densidade separará a mistura nas seguintes camadas de cima para baixo: plasma, revestimento Buffy (contendo PBMCs), material de gradiente de densidade, granulócitos e glóbulos vermelhos.
  5. Aspirar e descartar a maior parte da camada superior (plasma). Usando uma pipeta de transferência, recupere cuidadosamente a camada de buffy coat (PBMCs), evitando trazer qualquer material adicional. Transfira os PBMCs recuperados para um novo tubo de 50 mL.
  6. Lave a camada isolada de buffy coat 1x com solução de pH 7,4 PBS por 10 min a 350 x g com os freios totalmente ligados.
  7. Use um filtro de células de 70 μM para eliminar detritos ou material indesejado dos PBMCs antes de transferi-los para um tubo cônico de 15 mL. Lave 2x com solução de pH 7,4 PBS por 10 min a 350 x g com os freios totalmente ligados.
  8. Opcional: lise todos os eritrócitos transportados com tampão de lise ACK. Adicione 5-10 mL de tampão de lise ACK, dependendo do tamanho do pellet, e incube em temperatura ambiente por até 3 min. Após a incubação, complete com pH 7,4 PBS e centrifugue por 10 min a 350 x g com os freios cheios ligados e lave 1x. Execute esta etapa se o número de hemácias for muito alto.
    NOTA: É sempre melhor evitar o uso de ACK para obter melhores resultados. Alternativamente, a água pode ser usada para eliminar hemácias não fagocitadas, incubando com água por não mais de 15 segundos e, em seguida, adicione imediatamente 1X PBS para lavar.
  9. Reconstitua o pellet PBMC em 2-3 mL (use 0,5 mL por tubo ACD inicial) do meio completo RPMI-1640. Conte PBMCs com um hemocitômetro após preparar uma mistura 1:1 com azul de tripano. Conta apenas as células não coradas com azul de tripano. Reconstitua PBMCs em 2 x 106 células/mL em meio completo RPMI-1640.

2. Cultura de macrófagos M1/M2

  1. Dia 0 semeadura de monócitos
    1. Preparar um balão de cultura de células de 25 ml para cada população de macrófagos. Adicione 5 mL de poli-D-lisina (50 mg / 500 mL) a cada um e deixe no capuz por pelo menos 1 h. Lave o frasco com PBS para se livrar da poli-D-lisina residual.
    2. Isole PBMCs do revestimento de Buffy ou amostras de pacientes, como de costume (consulte a etapa 1). Depois que um pellet de PBMCs foi gerado, ressuspenda-o em 10 mL de meio completo RPMI-1640 pré-aquecido.
    3. Determine o número da célula e inicie o isolamento de monócitos com o kit de isolamento de monócitos. Para executar o kit, use pelo menos 50 x 106 células.
    4. Ressuspenda as células a 50 x 106 células/mL em um meio de isolamento. De acordo com o número de células obtido, use o ímã roxo (0,25-2 mL) ou cinza (0,5-8,5 mL) recomendado no kit de isolamento de monócitos.
    5. Siga as instruções do kit e adicione a amostra ao tubo de propileno necessário (5 mL ou 14 mL). Adicione o coquetel de enriquecimento à amostra a 50 μL / mL de amostra.
    6. Pipet para cima e para baixo ou vórtice para misturar a amostra e, em seguida, incubar a 2-8 °C por 10 min em um balde de gelo. Enquanto isso, partículas magnéticas de vórtice por 30 s. Após a incubação, adicione partículas magnéticas à amostra: 100 μL/ml de amostra.
    7. Pipet para cima e para baixo ou vórtice para misturar a amostra e depois incubar a 2-8 °C durante 5 min. Complete com meio de isolamento para 2,5 mL ou 10 mL, de acordo com uma pipeta graduada. Pipete para cima e para baixo 2x-3x para misturar.
    8. Coloque o tubo (sem tampa) no ímã e incube em temperatura ambiente por 2,5 min. Pegue o ímã e, em um movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo, despejando a suspensão da célula em um novo tubo, 5 mL ou 14 mL.
    9. Ressuspenda as células no meio RPMI-1640 e conte-as. Execute esta etapa o mais rápido possível. Semear entre 1 x 106 – 5 x 106 monócitos em cada balão de 25 ml previamente pré-revestido com poli-D-lisina. Traga o volume para 5 mL com RPMI-1640, se necessário.
    10. Incubar a 37 °C, 5% de CO2, durante pelo menos 2 h. Enquanto isso, prepare os meios de diferenciação M1 e M2. Prepare o suficiente para a recarga do Dia 0 (10 mL) e do Dia 4 (2 mL).
      NOTA: Meio de diferenciação M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Meio de diferenciação M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
    11. Após o tempo de incubação, lave cada frasco 1x com PBS e 2x com RPMI-1640 completo. Adicionar 10 ml de meio de diferenciação a cada balão de acordo com o tipo de célula a diferenciar.
    12. Deixe as células se diferenciarem por 6 dias na incubadora a 37 °C, 5% CO2. Devido à evaporação, complete com meio de diferenciação no Dia 4.
  2. Dia 4 - Recarga
    1. Adicionar 2 ml de cada meio de diferenciação ao respectivo balão. Adicionar o meio directamente ao balão.
  3. Dia 6 - Polarização de macrófagos
    1. Prepare os meios de polarização M1 e M2. Para meios de polarização M1, prepare 5 mL de meio de polarização M1 para adicionar ao frasco correspondente. As concentrações finais devem ser de 50 ng/mL de IFNγ, 10 ng/mL de LPS e 2,5 ng/mL GM-CSF em RPMI-1640. O frasco no final terá 15 mL de volume total (10 mL já em + 5 mL a serem adicionados), faça os cálculos de acordo.
    2. Para meios de polarização M2, prepare 5 mL de meio de polarização M2 para adicionar ao frasco correspondente. As concentrações finais devem ser de 20 ng/mL de IL-4 e 50 ng/mL M-CSF em RPMI-1640. Observe que o frasco no final terá 15 mL de volume total (10 mL já em + 5 mL a serem adicionados); Faça os cálculos de acordo.
    3. Adicionar 5 ml de meio de polarização M1 ou M2 a cada balão. Deixe os macrófagos polarizarem por pelo menos 2 dias e não mais de 4 dias na incubadora a 37 °C, 5% CO2.
  4. Dia 8 - Colheita e citometria de fluxo
    1. Antes de colher os macrófagos M1 ou M2, colete o sobrenadante em tubos de 1,5 mL para uso posterior (se necessário). Adicionar 1 ml de solução de descolamento de células ao balão e deixá-lo na incubadora a 37 °C, CO2 % a 5% durante 5 min.
    2. Para interromper a reação, adicione 3 mL de RPMI-1640 completo. Colete a mídia em um tubo de 15 mL. Adicione 3 mL de RPMI-1640 completo ao frasco e use um raspador de células para separar as células do fundo do frasco.
    3. Colete as células em um tubo de 15 mL. Coloque o frasco sob o microscópio a 10x e observe as células para garantir que não haja mais células presas ao fundo do frasco.
    4. Lave as células em PBS 2x. Ressuspenda-os em RPMI-1640 completo e conte usando o hemocitômetro.
    5. Para analisar a qualidade e a quantidade de macrófagos M1 / M2, execute um ensaio de citometria de fluxo. Use 0,5 x 106 células por tubo e core da seguinte forma: M1: CD80 + CCR7 + CD209- M2: CD206 + CD209 + CD80-. Estratégia de gating usada neste ensaio: #1 Forward Scatter (FSC-A) vs. Side Scatter (SSC-A) Dot Plot, #2 Forward Scatter Height (FSC-H) vs. Forward Scatter Area (FSC-A) Dot Plot para Discriminação de Doubleto, #3 Side Scatter (SSC-A) vs. DAPI-A Dot Plot para Discriminação de Células Vivas/Mortas, #4 Side Scatter (SSC-A) vs. Gráfico de Pontos ou Histograma de Parâmetro Único (ou seja, SSC-A vs. FITC-A), #5 Gráfico de pontos de parâmetro duplo (ou seja, FITC-A vs. APC-A).

3. MMA usando macrófagos M1/M2

  1. Após a obtenção dos macrófagos M1/M2, conte-os usando um hemocitômetro na proporção de coloração de 1:1 com azul de tripano. Reconstitua M1/M2 em 1 x 106 células/mL em meio completo RPMI-1640.
  2. Semear 400 μL (400.000 células) de suspensão celular usando uma micropipeta em cada poço da lâmina da câmara de 8 poços e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 por pelo menos 1,5 h em uma incubadora de cultura de tecidos totalmente umidificada. Cada teste deve ser realizado usando um mínimo de poços triplicados.
  3. Opsonização de amostras de teste e hemácias RhD+ R2R2
    1. Lave as hemácias RhD+ R2R2 em pH 7,4 PBS 3x centrifugando a 350 x g por 5 min de cada vez. Preferimos usar R2R2 RhD+ RBCs como nosso controle devido a ter uma densidade de antígeno D mais alta, mas qualquer RhD+ RBCs pode ser substituído. Oponize a amostra de hemácias de teste (por exemplo, paciente ou doador) de hemácias usando anticorpos de interesse. Use uma suspensão de 5% de hemácias adicionando 15 μL de concentrado de hemácias a 300 μL de mistura de anticorpos. Oponize as hemácias R2R2 com Anti-D adicionando 15 μL de concentrado de hemácias R2R2 a 300 μL de mistura de anticorpos Anti-D (100 ng/mL).
    2. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 1 h. Realize a reconstituição intermitente das hemácias assentadas na parte inferior (por exemplo, vórtice a cada 15 minutos). Lave as hemácias opsonizadas com pH 7,4 PBS 3x por centrifugação a 350 x g por 5 min de cada vez.
    3. Para verificar a opsonização das hemácias, realize um teste indireto de antiglobulina (IAT). Adicione um anticorpo anti-humano opsonizante secundário ao anticorpo opsonizante primário. A hemaglutinação ou aglomeração de hemácias pode ser observada em 30 s e interpretada como uma opsonização bem-sucedida13.
    4. Reconstituir hemácias RhD+ R2R2 opsonizadas lavadas em 1,25% (v/v) com meio completo RPMI-1640. Adicione 1.200 μL de meio a 15 μL de hemácias para atingir 1,25% (v/v) por poço.
  4. Fagocitose mediada por receptor Fc
    1. Após a incubação de 1,5 h dos macrófagos M1/M2, para permitir que essas células adiram aos poços da lâmina da câmara, aspire o meio sobrenadante e descarte, seguindo uma técnica suave, garantindo que a ponta da pipeta toque apenas o canto dos poços. Os macrófagos devem ser aderidos aos poços. Evite tocar no meio dos poços com a ponta da pipeta.
    2. Lave suavemente os poços 1x com pH 7,4 PBS. Adicione 400 μL da mistura apropriada de hemácias opsonizadas a 1,25% (v / v) a cada poço do triplicado. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 2 h sem perturbação.
    3. Após a incubação, prepare dois copos com 100 mL de pH 7,4 PBS em cada um.
    4. Remova as câmaras de 8 poços usando os adaptadores do fabricante. Enxugue o excesso em uma toalha de papel, mantendo as lâminas úmidas.
    5. Mergulhe a lâmina no copo com os sobrenadantes descartados e lave-a movendo-a lentamente para a frente e para trás (20-30 traços) para remover quaisquer eritrócitos não fagocitados restantes.
    6. Em seguida, mergulhe a lâmina no segundo copo e lave lentamente por mais 20-30 golpes. Retire a lâmina do PBS e enxugue o excesso em uma toalha de papel. Evite tocar na frente das câmaras. Neste ponto, mergulhe a lâmina na água por 1 min para remover quaisquer hemácias aderentes e não fagocitadas, mas pode não ser necessário se você puder distinguir as hemácias fagocitadas das aderentes. Secar ao ar.
    7. Mergulhe as lâminas em 100% de metanol por 45 s para fixá-las e depois seque ao ar. Monte a corrediça usando um meio de montagem preparado internamente e adicione lamínulas (24 x 75 mm). Deixar secar durante a noite antes da quantificação.
  5. Quantificação da fagocitose
    1. Usando um microscópio de contraste de fase, lente objetiva de 40x e um contador de células manual, quantifique a fagocitose.
    2. Com a ajuda de dois contadores celulares manuais, um em cada mão, conte as hemácias fagocitadas com um contador e o número total de monócitos/macrófagos com o outro. Conte 300 monócitos/macrófagos por poço.
    3. Calcule o índice fagocítico médio (IP) por teste (em triplicatas) dividindo o número de hemácias fagocitadas pelo número de monócitos totais contados e multiplicando por 100. Expresse os dados como PI médio ± erro padrão da média (SEM).
      PI = (hemácias fagocitadas / 300 macrófagos) x 100

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Resultados

Os resultados da Figura 1 são consistentes com a literatura e indicam uma polarização bem-sucedida dos macrófagos de seu estado M0 para seu estado M1/M2 subsequente. Macrófagos M1 e M2 foram cultivados por 8 dias (6 dias com fatores de crescimento e 2 dias de polarização), e hemácias opsonizadas anti-D ou anti-k foram testadas (Figura 2). Os macrófagos M2 demonstram um alto índice fagocítico em comparação com os M1s com hemácias opsonizadas por ...

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Discussão

Para garantir o sucesso do método, deve-se seguir as seguintes etapas críticas: 1) polarização M1/M2 bem-sucedida, 2) geração da camada de macrófagos e controle RhD+ 3) quantificação do índice fagocítico. Embora nossos métodos afirmem o uso de monócitos isolados para a cultura de células, PBMCs podem ser usados, mas recomendamos o uso de monócitos purificados. Sabe-se que as PBMCs contêm vários tipos de células, com essas células secretando várias citocinas e fatores mediadores diferente...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado e financiado pelo Centro Canadense de Serviços de Sangue para Inovação em Toronto, ON. A pesquisa é realizada no Keenan Research Center for Biomedical Sciences no St. Michaels Hospital em Toronto, ON.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1X PBS, pH 7.4, sem Ca2+/Mg2+WisentBioproducts 311-425-CLArmazene a 4 graus ou temperatura ambiente 
AccutaseTMSTEMCELL Technologies Solução de desprendimento de células7920
ACK Lysis Buffer Tecnologias STEMCELL 07850, 07800Armazenar a 4 graus
Anti-Globulina HumanaNOVACLONE, Immunocor. N/ANOVACLONE Anti-IgG para testes de IAT 
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)Saol Therapeutics 1003092Qualquer fonte comercial de globina imune ao Rh será suficiente 
Raspador de CélulasUofT Medstore83.395desprendimento de células 
Filtro de Células 70uM nylonFalcon352350filtro de células 
Corrediça da câmara Nunc. Lab-TekTM II com Tampa, Lâmina de Vidro RS Estéril Thermo Fisher Scientific 154534corrediças de câmara para MMA 
Lamínulas VWR48393-08124 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, densidade 1.077 g/LThermo Fisher Scientific 17-1440-03separação de PBMCS de sangue total; meio de gradiente de densidade
Elvanol Meio de montagemN/AN/ADulbecco' s PBS (D-PBS) sem Ca2+/Mg2+, 15% (p/v) de resina polivinílica e 30% (v/v) de glicerina.
Sangue total fresco (tubo ACD) ou revestimento BuffyCanadian Blood ServicesPode descansar em temperatura ambiente por até 36 horas 
Tecnologias de células-tronco GM-CSF recombinantes humanas78015.1Citocina para polarização de macrófagos M1
Tecnologias de células estaminais IFN-gama recombinanteshumanas 78020Citocina para polarização de macrófagos M1
Tecnologias de células TRONCO IL-4 Recombinantes Humanas 78045.1Citocina para polarização de macrófagos M2
Tecnologias de células-tronco M-CSF recombinantes humanas78057.1Citocina para polarização de macrófagos M2
ID-CellStabBio-Rad005650 05740Solução de armazenamento/estabilização de células hemácias 
Meio de Isolamento N/AN/APBS Ca2+ e Mg2+ livre + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolisaaracide (LPS)Sigma AldrichL3024-5MGCitocina para polarização de macrófagos M1
Metanol (100%)N/AN/AFixação de lâminas 
Kit de Isolamento de Monócitos STEM-cells EasySep Kit de Enriquecimento de Monócitos Humanos sem Depleção de CD16 Tecnologias STEMCELL 19058Isolamento de monócitos de PBMCs
Poli-D-isina UofT Medstore P6407Solução de fixação de células 
Rh(D) positivo R2R2 RBCsCanadian Blood ServicesN/ATambém comercialmente disponível
RPMI-1640Wisent Bioproducts 350-000-CLsuplementado com 10% de FBS inativado pelo calor, 1 mM de suplemento GlutaMAX, 1 mM de HEPES e 1% de penicilina/estreptomicina. Armazene a 4 graus. 
Solução de Trypan BlueThermo Fisher Scientific 15250061Solução de contagem de células 

Referências

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  3. Frias Boligan, K., Sandhu, G., Branch, D. R. Methods to evaluate the potential clinical significance of antibodies to red blood cells. Curr Protoc. 2 (8), e504(2022).
  4. Lemay, A. S., et al. The first case of severe acute hemolytic transfusion reaction caused by anti-Sc2. Transfusion. 58 (11), 2506-2512 (2018).
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  8. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, 514(2014).
  9. Mills, C. M1 and M2 macrophages: Oracles of health and disease. Crit Rev Immunol. 32 (6), 463-488 (2012).
  10. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. Int J Mol Sci. 19 (6), 1801(2018).
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  13. Cohn, C., Delaney, M., Johnson, S. T., Katz, L. M., Schwartz, J. Technical Manual. , 21st Ed, American Association for the Advancement of Blood and Biotherapeutics. Maryland, USA. (2023).

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