A citometria de fluxo multicolorida para plaquetas pode identificar novos subtipos de plaquetas dentro de subpopulações clássicas de plaquetas, como plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Isso permite a comparação de diferentes padrões de subpopulação induzidos por vários agonistas plaquetários. Aqui, um procedimento para estabelecer um painel de citometria de fluxo multicolorido é descrito em detalhes.
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Artigo de método
Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida
Neste artigo
Resumo
Resumo
As plaquetas, ou trombócitos, são pequenas células sanguíneas anucleadas que desempenham um papel crucial na hemostasia e trombose. Defeitos nas funções plaquetárias podem causar sangramento ou eventos trombóticos em pacientes com doenças cardiovasculares. Portanto, é importante caracterizar as plaquetas fenotipicamente para poder atribuir subpopulações plaquetárias à função plaquetária. A estimulação de plaquetas humanas com agonistas e ativadores plaquetários induz alterações morfológicas e fisiológicas nas plaquetas, acompanhadas por alterações na população de receptores de superfície. Isso leva a subpopulações de plaquetas funcionalmente diversas. As subpopulações plaquetárias classicamente definidas são plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Para caracterizar o efeito dos agonistas nos subtipos plaquetários, estabelecemos um ensaio usando citometria de fluxo multicolorida consistindo de 10 anticorpos e corantes diferentes (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-IntegrinaαIIbβ3 (clone: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Anexina V, Zombie NIR). Plaquetas humanas isoladas foram incubadas com agonistas plaquetários e coradas com anticorpos e corantes específicos conjugados com fluoróforo. Em seguida, foram medidas por citometria de fluxo. Isso nos permite definir subtipos específicos de agonistas dentro das quatro subpopulações clássicas. Em conclusão, a combinação de marcadores de ativação (anti-CD62P, anti-CD63, anti-IntegrinαIIbβ3 (clone: PAC-1)), marcadores inflamatórios (anti-CXCR4, anti-ACKR3) e marcadores apoptóticos (Anexina V, Zombie NIR) que compõem o painel de citometria de fluxo de 10 cores descrito neste manuscrito abre a possibilidade de definir outros subtipos de plaquetas que podem estar ligados a uma função plaquetária específica. Este método pode ser aplicado em pesquisas básicas sobre função e fisiologia plaquetária, bem como na definição de novos subtipos plaquetários em modelos de doenças e estudos com pacientes.
Introdução
Os trombócitos, também chamados de plaquetas, são pequenas células sanguíneas livres de núcleo, essenciais para a hemostasia e o desenvolvimento de trombose 1,2. Eles podem ser ativados por vários agonistas plaquetários. Os agonistas plaquetários fisiológicos clássicos são o difosfato de adenosina (ADP), que se liga aos receptores P2Y12 e P2Y1, a trombina que ativa as plaquetas por meio dos receptores PAR1 e PAR4 e o colágeno que interage com a glicoproteína VI. O colágeno pode ser substituído em experimentos in vitro pelo peptídeo relacionado ao colágeno (CRP-XL)
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Protocolo
A coleta e o manuseio de sangue para fins de pesquisa foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard Karls e do Hospital Universitário de Tübingen (voto de ética 238/2018B02), e as metodologias do estudo estavam em conformidade com os padrões estabelecidos pela Declaração de Helsinque. Doadores saudáveis deram consentimento informado por escrito para coleta de sangue. As características basais para doadores saudáveis estão listadas na Tabela 1. A Figura 1 fornece uma visão geral do protocolo de citometria de fluxo.
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Resultados
Existem duas opções para analisar os dados brutos coletados por um painel de citometria de fluxo multicolorido. Uma opção é analisá-lo manualmente com o software de análise (Figura 3 e Figura 4). Portanto, os dados brutos precisam ser arrastados e soltos na janela do software. Primeiro, as células precisam ser encontradas ajustando a escala SSC/FSC no modo de exibição do gráfico de dispersão para mostrar a população de plaquetas como uma nuvem de pontos distinta.......
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Discussão
A citometria de fluxo multicolorida permite definir agrupamentos/subpopulações plaquetárias distintas associadas a funções discretas 12,17,18. Decisivo para os resultados das subpopulações e da expressão superficial do receptor é a qualidade das plaquetas humanas isoladas. Portanto, uma etapa fundamental no protocolo apresentado é a preparação das plaquetas. Eles precisam ser isolados suavemente.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O projeto foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) - Projeto número 335549539 - GRK 2381.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x Buffer de Ligação | Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA | 88-8103-74 | Buffer |
| Difosfato de adenosina (ADP) | Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Alemanha | 70212 | Agonista plaquetário |
| Anexina V PE-Cyanine7 | Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA | 88-8103-74 | corante |
| anti-CD41 AF 700 | BioLegend, San Diego, CA, EUA | 303728 | anticorpo |
| anti-CD41 Alexa Fluor 700 | BioLegend, San Diego, CA, EUA | 303727 | anticorpo |
| anti-CD42b PerCP/Cianina5.5 | BioLegend, San Diego, CA, EUA | 303918 | anticorpo |
| anti-CD61 BV605 | BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA | 744382 | anticorpo |
| anti-CD62P PE | Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA | IM1759U | anticorpo |
| anti-CD63 PE/Cy5 | Abcam, Cambrigde, UK | ab 234251 | anticorpo |
| anti-CXCR4 BV650 | BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA | 740599 | anticorpo |
| anti-CXCR7 BV421 | BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA | 566234 | anticorpo |
| anti-PAC-1 FITC | BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA | 340507 | anticorpo |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Applichem, Darmstadt, Alemanha | A1391-Ácido | |
| citrital | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 6490.1-CRP-XL | |
| CambCol Laboratories, Ely, Reino Unido | CRP-XL | agonista plaquetário | |
| D-(+)-Glicose | Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA | G7528-Dubecco | |
| ' s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA | D8537-Hemin | |
| Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA | Agonista plaquetário | H9039-10G | |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 9105.3-Cloreto | de |
| potássio | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 6781.3-Cloreto | de |
| sódio | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 3957.1-Hidrogenocarbonato | de |
| sódio | Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, EUA | ||
| 401676-Trombina | Roche | 10602400001 | agonista plaquetário |
| citrato-di-hidrato tri-sódico | Applichem, Darmstadt, Alemanha | 1416551211-Zombie | |
| NIR | BioLegend, San Diego, CA, EUA | 423105 | corante reativo à amina |
Referências
- Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
- Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
- van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. ....
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Reimpressões e permissões
