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Os trombócitos, também chamados de plaquetas, são pequenas células sanguíneas livres de núcleo, essenciais para a hemostasia e o desenvolvimento de trombose 1,2. Eles podem ser ativados por vários agonistas plaquetários. Os agonistas plaquetários fisiológicos clássicos são o difosfato de adenosina (ADP), que se liga aos receptores P2Y12 e P2Y1, a trombina que ativa as plaquetas por meio dos receptores PAR1 e PAR4 e o colágeno que interage com a glicoproteína VI. O colágeno pode ser substituído em experimentos in vitro pelo peptídeo relacionado ao colágeno (CRP-XL)3,4. Recentemente, a hemina demonstrou induzir a ativação plaquetária pela interação do receptor tipo C semelhante à lectina (CLEC-2) e da glicoproteína VI (GPVI), estabelecendo a hemina como um novo ativador/agonista plaquetário endógeno 5,6. Várias situações patológicas podem levar à hemólise, resultando na liberação de hemina livre contendo ferro férrico. Todos esses agonistas plaquetários alteram a expressão do receptor de superfície nas plaquetas. A alteração dos receptores de superfície e da membrana plasmática depende da força e concentração do agonista plaquetário 7,8,9. Portanto, é importante caracterizar fenotipicamente as plaquetas para poder atribuir subpopulações plaquetárias à função plaquetária.
Métodos de alta dimensão, como a citometria de fluxo, revelaram que as plaquetas formam subpopulações com funções distintas. As subpopulações podem ser classificadas por diferentes marcadores de superfície. Na literatura, sabe-se que duas subpopulações plaquetárias distintas estão presentes: o pró-coagulante, que é caracterizado pela externalização da fosfatidilserina, e o fenótipo agregador que ativa a integrina αIIIbβ3. Além dos marcadores de ativação clássicos, corantes de fluorescência como a glutationa-S-arilóxido (GSAO), que detecta a função mitocondrial e o estresse oxidativo, podem ser usados para categorização adicional, por exemplo, plaquetas pró-coagulantes por seu estado metabólico10. Isso permite que seja feita uma distinção entre o balonismo e o fenótipo plaquetário pró-coagulante de formação de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP)11.
Heemskerk e col. mostraram, analisando a exposição à fosfatidilserina (PS) e a atividade da integrina αIIbβ3, que diferentes populações de plaquetas podem controlar etapas distintas da coagulação e que ativadores fortes, como trombina e colágeno, são necessários para a exposição à fosfatidilserina12. Além disso, a ativação das plaquetas pelo GPVI com colágeno ou o agonista específico do GPVI convulxina é a principal responsável pela formação de plaquetas pró-coagulantes aderentes. Da mesma forma, o ácido araquidônico, que leva à ativação plaquetária pela produção de tromboxano A2 pela ciclooxigenase, induz a exposição ao PS13. No entanto, o ácido araquidônico é, em comparação com a trombina ou o colágeno, um fraco ativador plaquetário14. Van Velzen e col. também avaliaram antígenos de superfície plaquetária (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) e marcadores de ativação (PAC-1, CD63, CD62P) em duas medidas separadas15. Além disso, van Velzen et al. foram capazes de analisar o sangue de pacientes com trombastenia e comparar as subpopulações entre pacientes saudáveis e doentes. Hindle et al. mediram a influência da prostaciclina nas subpopulações plaquetárias após o tratamento com trombina e PCR-XL com dois painéis individuais constituídos por quatro marcadores cada (PAC-1, Anexina V, CD62P, CD42b ou CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. Recentemente, a citometria de fluxo multicolorida tem sido usada para definir subpopulações plaquetárias em repouso (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Anexina V-), agregatórias (CD42b+, PAC1+, CD62P+, Anexina V-) procoagulantes (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Anexina V+) e apoptóticas (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Anexina V+) 7,17. Laspa et al. estenderam / refinaram a abordagem de citometria de fluxo multicolorida pela adição de anticorpos contra os receptores de quimiocinas CXCR4 e ACKR318. Com base na literatura disponível, este é o primeiro painel de citômetro de fluxo de 10 cores para plaquetas humanas isoladas que permite a detecção de 10 antígenos diferentes em uma plaqueta individual (nível de célula única) dentro de uma população de plaquetas humanas isoladas em um tubo. Assim, é possível medir simultaneamente o potencial de ativação, adesão e agregação, receptores de quimiocinas e potencial apoptótico de uma única célula para distinguir ainda mais a subpopulação existente. Assim, complementa Johnson et al., que definiram as quatro principais subpopulações com quatro marcadores (repouso, pró-coagulante, agregador, apoptótico)17. Assim, o estabelecimento de um ensaio de citometria de fluxo multicolorido permite a comparação de diferentes agonistas plaquetários em relação ao seu padrão de ativação e à formação de subtipos plaquetários dentro de subpopulações plaquetárias clássicas.
O método pode ser usado para pesquisas básicas sobre a análise da função e fisiologia plaquetária. Além disso, o ensaio de citometria de fluxo multicolorido estabelecido para plaquetas humanas pode ser realizado com plaquetas adquiridas em estudos de pacientes, por exemplo, pesquisando doenças cardiovasculares e eventos trombóticos, para decodificar as subpopulações de plaquetas induzidas por essas doenças e os efeitos dos tratamentos nesses fenótipos induzidos. Por exemplo, Mueller e col. mostraram que as subpopulações plaquetárias podem diferir em pacientes com estenose aórtica19. O conhecimento adquirido pode oferecer novas aberturas para intervenções farmacêuticas.