Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

Resumo

A citometria de fluxo multicolorida para plaquetas pode identificar novos subtipos de plaquetas dentro de subpopulações clássicas de plaquetas, como plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Isso permite a comparação de diferentes padrões de subpopulação induzidos por vários agonistas plaquetários. Aqui, um procedimento para estabelecer um painel de citometria de fluxo multicolorido é descrito em detalhes.

Resumo

As plaquetas, ou trombócitos, são pequenas células sanguíneas anucleadas que desempenham um papel crucial na hemostasia e trombose. Defeitos nas funções plaquetárias podem causar sangramento ou eventos trombóticos em pacientes com doenças cardiovasculares. Portanto, é importante caracterizar as plaquetas fenotipicamente para poder atribuir subpopulações plaquetárias à função plaquetária. A estimulação de plaquetas humanas com agonistas e ativadores plaquetários induz alterações morfológicas e fisiológicas nas plaquetas, acompanhadas por alterações na população de receptores de superfície. Isso leva a subpopulações de plaquetas funcionalmente diversas. As subpopulações plaquetárias classicamente definidas são plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Para caracterizar o efeito dos agonistas nos subtipos plaquetários, estabelecemos um ensaio usando citometria de fluxo multicolorida consistindo de 10 anticorpos e corantes diferentes (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-Integrina_αIIbβ3 (clone: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Anexina V, Zombie NIR). Plaquetas humanas isoladas foram incubadas com agonistas plaquetários e coradas com anticorpos e corantes específicos conjugados com fluoróforo. Em seguida, foram medidas por citometria de fluxo. Isso nos permite definir subtipos específicos de agonistas dentro das quatro subpopulações clássicas. Em conclusão, a combinação de marcadores de ativação (anti-CD62P, anti-CD63, anti-Integrin_αIIbβ3 (clone: PAC-1)), marcadores inflamatórios (anti-CXCR4, anti-ACKR3) e marcadores apoptóticos (Anexina V, Zombie NIR) que compõem o painel de citometria de fluxo de 10 cores descrito neste manuscrito abre a possibilidade de definir outros subtipos de plaquetas que podem estar ligados a uma função plaquetária específica. Este método pode ser aplicado em pesquisas básicas sobre função e fisiologia plaquetária, bem como na definição de novos subtipos plaquetários em modelos de doenças e estudos com pacientes.

Introdução

Os trombócitos, também chamados de plaquetas, são pequenas células sanguíneas livres de núcleo, essenciais para a hemostasia e o desenvolvimento de trombose ^1,2. Eles podem ser ativados por vários agonistas plaquetários. Os agonistas plaquetários fisiológicos clássicos são o difosfato de adenosina (ADP), que se liga aos receptores P2Y12 e P2Y1, a trombina que ativa as plaquetas por meio dos receptores PAR1 e PAR4 e o colágeno que interage com a glicoproteína VI. O colágeno pode ser substituído em experimentos in vitro pelo peptídeo relacionado ao colágeno (CRP-XL)^3,4. Recentemente, a hemina demonstrou induzir a ativação plaquetária pela interação do receptor tipo C semelhante à lectina (CLEC-2) e da glicoproteína VI (GPVI), estabelecendo a hemina como um novo ativador/agonista plaquetário endógeno ^5,6. Várias situações patológicas podem levar à hemólise, resultando na liberação de hemina livre contendo ferro férrico. Todos esses agonistas plaquetários alteram a expressão do receptor de superfície nas plaquetas. A alteração dos receptores de superfície e da membrana plasmática depende da força e concentração do agonista plaquetário ^7,8,9. Portanto, é importante caracterizar fenotipicamente as plaquetas para poder atribuir subpopulações plaquetárias à função plaquetária.

Métodos de alta dimensão, como a citometria de fluxo, revelaram que as plaquetas formam subpopulações com funções distintas. As subpopulações podem ser classificadas por diferentes marcadores de superfície. Na literatura, sabe-se que duas subpopulações plaquetárias distintas estão presentes: o pró-coagulante, que é caracterizado pela externalização da fosfatidilserina, e o fenótipo agregador que ativa a integrina α_IIIbβ_3. Além dos marcadores de ativação clássicos, corantes de fluorescência como a glutationa-S-arilóxido (GSAO), que detecta a função mitocondrial e o estresse oxidativo, podem ser usados para categorização adicional, por exemplo, plaquetas pró-coagulantes por seu estado metabólico¹⁰. Isso permite que seja feita uma distinção entre o balonismo e o fenótipo plaquetário pró-coagulante de formação de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP)¹¹.

Heemskerk e col. mostraram, analisando a exposição à fosfatidilserina (PS) e a atividade da integrina α_IIbβ₃, que diferentes populações de plaquetas podem controlar etapas distintas da coagulação e que ativadores fortes, como trombina e colágeno, são necessários para a exposição à fosfatidilserina¹². Além disso, a ativação das plaquetas pelo GPVI com colágeno ou o agonista específico do GPVI convulxina é a principal responsável pela formação de plaquetas pró-coagulantes aderentes. Da mesma forma, o ácido araquidônico, que leva à ativação plaquetária pela produção de tromboxano A2 pela ciclooxigenase, induz a exposição ao PS¹³. No entanto, o ácido araquidônico é, em comparação com a trombina ou o colágeno, um fraco ativador plaquetário¹⁴. Van Velzen e col. também avaliaram antígenos de superfície plaquetária (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) e marcadores de ativação (PAC-1, CD63, CD62P) em duas medidas separadas¹⁵. Além disso, van Velzen et al. foram capazes de analisar o sangue de pacientes com trombastenia e comparar as subpopulações entre pacientes saudáveis e doentes. Hindle et al. mediram a influência da prostaciclina nas subpopulações plaquetárias após o tratamento com trombina e PCR-XL com dois painéis individuais constituídos por quatro marcadores cada (PAC-1, Anexina V, CD62P, CD42b ou CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)¹⁶. Recentemente, a citometria de fluxo multicolorida tem sido usada para definir subpopulações plaquetárias em repouso (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P^-, Anexina V^-), agregatórias (CD42b⁺, PAC1⁺, CD62P⁺, Anexina V^-) procoagulantes (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P⁺, Anexina V⁺) e apoptóticas (Cd42b^-, PAC1^-, CD62P^-, Anexina V⁺) ^7,17. Laspa et al. estenderam / refinaram a abordagem de citometria de fluxo multicolorida pela adição de anticorpos contra os receptores de quimiocinas CXCR4 e ACKR3¹⁸. Com base na literatura disponível, este é o primeiro painel de citômetro de fluxo de 10 cores para plaquetas humanas isoladas que permite a detecção de 10 antígenos diferentes em uma plaqueta individual (nível de célula única) dentro de uma população de plaquetas humanas isoladas em um tubo. Assim, é possível medir simultaneamente o potencial de ativação, adesão e agregação, receptores de quimiocinas e potencial apoptótico de uma única célula para distinguir ainda mais a subpopulação existente. Assim, complementa Johnson et al., que definiram as quatro principais subpopulações com quatro marcadores (repouso, pró-coagulante, agregador, apoptótico)¹⁷. Assim, o estabelecimento de um ensaio de citometria de fluxo multicolorido permite a comparação de diferentes agonistas plaquetários em relação ao seu padrão de ativação e à formação de subtipos plaquetários dentro de subpopulações plaquetárias clássicas.

O método pode ser usado para pesquisas básicas sobre a análise da função e fisiologia plaquetária. Além disso, o ensaio de citometria de fluxo multicolorido estabelecido para plaquetas humanas pode ser realizado com plaquetas adquiridas em estudos de pacientes, por exemplo, pesquisando doenças cardiovasculares e eventos trombóticos, para decodificar as subpopulações de plaquetas induzidas por essas doenças e os efeitos dos tratamentos nesses fenótipos induzidos. Por exemplo, Mueller e col. mostraram que as subpopulações plaquetárias podem diferir em pacientes com estenose aórtica¹⁹. O conhecimento adquirido pode oferecer novas aberturas para intervenções farmacêuticas.

Protocolo

A coleta e o manuseio de sangue para fins de pesquisa foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard Karls e do Hospital Universitário de Tübingen (voto de ética 238/2018B02), e as metodologias do estudo estavam em conformidade com os padrões estabelecidos pela Declaração de Helsinque. Doadores saudáveis deram consentimento informado por escrito para coleta de sangue. As características basais para doadores saudáveis estão listadas na Tabela 1. A Figura 1 fornece uma visão geral do protocolo de citometria de fluxo.

1. Isolamento de plaquetas humanas do sangue total

NOTA: As diretrizes do ISTH foram seguidas em termos de coleta de amostras, torniquetes e escolha do anticoagulante, a fim de garantir uma forma padronizada de isolamento de plaquetas²⁰.

1. Preparação do tampão
   1. Tampão anticoagulante ácido-citrato-dextrose (ACD): Dissolver 12,50 g de Na_3-Citrat (85 mM C₆H₅Na₃O₇ x 2 H₂O), 6,82 g de ácido citrato (71 mM) e 10,00 g de glicose (111 mM) em 475 mL de aqua destillata. Ajuste o pH com 1 M NaOH para 4,69. Encha até 500 mL com aqua destillata. Em seguida, esterilize o tampão com filtro e armazene a 4 °C até o uso.
      NOTA: Todas as soluções são esterilizadas por filtro com um sistema de filtro acionado a vácuo, que usa uma membrana de poliéter sulfona de fluxo rápido de tamanho de poro de 0,22 μm.
   2. Tampão de Tyrode (10x): Pesar 80,00 g de NaCl, 10,15 g de NaHCO₃ e 1,95 g de KCl e adicionar aqua destillata a 1 L. Esterilizar o tampão e conservar a 4 °C até à utilização.
   3. Tampão Tyrode's-HEPES (1x; 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 5 mM de glicose, 10 mM HEPES): Misture 10 mL de 10x tampão Tyrode e 90 mL de aqua destillata. Dissolver 0,1 g de glicose e 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA). Ajustar o pH com ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico (HEPES) para 7,4. Defina 10 mL de tampão de Tyrode para pH 7,4 e ajuste o pH dos 90 mL residuais de Tyrode para 7,4 com 1 N HCl para pH 6,5.
      NOTA: A BSA pode eliminar alguns produtos químicos, como a hemina. Nesse caso, é importante preparar o buffer do Tyrode 1x sem BSA. Todos os tampões devem ser aquecidos até à temperatura ambiente ou 37 °C antes da utilização.
2. Coleta de amostras de sangue
   1. Prepare para cada doador uma seringa de 10 mL com 2 mL de anticoagulante ACD e deixe-a ajustar à temperatura ambiente ou 37 ° C usando uma incubadora. Mantenha o fator de diluição de 1:5 (ACD: sangue).
      NOTA: Use seringas menores ou maiores para coletar amostras de sangue. O tampão ACD frio pode pré-ativar as plaquetas e prejudicar seus resultados.
   2. Use uma agulha borboleta (21G) para coletar lentamente o sangue do doador nas seringas pré-aquecidas de ACD. Abra a mangueira do torniquete antes de encher a seringa para evitar a pré-ativação.
      NOTA: Seringas com agulha de calibre maior podem minimizar a ativação de plaquetas induzida por cisalhamento.
   3. Transfira lentamente o sangue ACD para um tubo de reação de 15 mL. Use o sangue imediatamente para evitar a pré-ativação das plaquetas.
3. Isolamento plaquetário
   1. Centrifugue o sangue ACD por 20 min a 209 x g (temperatura ambiente, RT) sem freios. Prepare 25 mL de tampão Tyrode's-HEPES pH 6,5 em um tubo de reação de 50 mL.
   2. Transfira suavemente o plasma rico em plaquetas resultante (PRP, camada superior) para o tubo de reação de 50 mL contendo o tampão Tyrode's-HEPES, pH 6,5.
   3. Deixe aproximadamente 1 mL de PRP acima do revestimento leucocitário e eritrócitos para evitar a contaminação com outras células sanguíneas.
   4. Centrifugue a suspensão a 430 x g por 10 min em RT para pellet as plaquetas. Ressuspenda cuidadosamente o pellet resultante em 200-300 μL de tampão de Tyrode, pH 7,4.
   5. Use um contador de células para determinar a contagem de plaquetas. Ajuste a contagem de plaquetas com o tampão HEPES de Tyrode, pH 7,4 a 200 x 10,³ plaquetas/μL. Consulte a etapa 3 para processamento adicional da coloração plaquetária.

2. Seleção e titulação de anticorpos para citometria de fluxo

1. Seleção de anticorpos e corantes
   1. Selecionar os anticorpos e corantes com fluoróforos adequados para o citómetro^{de fluxo 21}. Observe a configuração do filtro recomendada pelo fabricante do citômetro de fluxo. Um exemplo de marcadores plaquetários e configuração de fluoróforo é dado na Tabela 2 e na Figura 2 para o seguinte citômetro: BD LSR Fortessa com configuração de laser: violeta (402 nm), azul (488 nm), amarelo/verde (561 nm), vermelho (640 nm).
      NOTA: Use fluorocromos mais brilhantes para antígenos de menor expressão. Por exemplo, os fluorocromos brilhantes BV412 e BV650 foram usados para os receptores de quimiocinas fracamente expressos (ACKR3 e CXCR4) ^{22 , 23 , 24} .
2. Titulação de anticorpos e corantes
   1. Titular os anticorpos para encontrar a concentração de trabalho correta. Para a titulação, utilizar plaquetas humanas isoladas da etapa 1 e uma série de concentrações do anticorpo.
      NOTA: As concentrações de trabalho fornecidas pelo fabricante são geralmente um bom ponto de partida para a série de concentrações.
      1. Se estiver trabalhando com antígenos que só são expressos sob tratamento, ative as plaquetas antes da coloração para ter certeza de que as células negativas e positivas também podem ser detectadas. Por exemplo, o PAC-1 se liga apenas à integrina ativada α_IIbβ₃. Portanto, ative fortemente as plaquetas para obter um sinal brilhante e positivo, por exemplo, com 10 μg / mL de peptídeo relacionado ao colágeno (PCR; ver Figura 3).
3. Titulação das amostras
   1. Isole as plaquetas humanas como na etapa 1 e ajuste a contagem de plaquetas para 1 x 10⁶ plaquetas por amostra.
      1. Para receptores que não precisam de ativação antes da coloração: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4, use uma amostra não corada e uma corada por anticorpo. Para receptores/marcadores que precisam ser ativados com, por exemplo, 10 μg/mL de PCR-XL antes da coloração: PAC1, CD63, CD62P, Anexina V, Zombie NIR, use uma amostra ativada e uma não ativada 15,25,26.
   2. Ative as plaquetas (1 x 10,⁶ plaquetas por amostra), se necessário, por 30 min com 10 μg/mL CRP-XL. Em seguida, incube as plaquetas isoladas (1 x 10⁶ plaquetas por amostra) por 30 min com diferentes concentrações do anticorpo ou corante conjugado com fluorocromo e adicione 300 μL de 1x Anexin Binding Buffer para diluir a amostra (exemplos de concentrações são dados na Tabela 3).
   3. Meça 10.000 eventos para cada amostra.
   4. Calcule o índice de coloração que mostra a separação ideal das populações positivas e negativas para cada anticorpo, conforme mostrado na Figura Suplementar 1.
   5. Plote o índice de coloração para cada concentração de anticorpo para encontrar a concentração ideal.

3. Coloração para citometria de fluxo

NOTA: Consulte a Tabela 4 para obter um exemplo de coloração com quatro ativadores plaquetários diferentes (CRP-XL, ADP, trombina, hemina).

1. Hemin precisa ser preparado na hora. Dissolver o pó em NaOH 1,4 M numa solução 3 M e aquecê-lo a 96 °C durante 5 min a 450 rpm. Em seguida, diluí-lo com H₂O destilado para uma solução de reserva de 3 mM.
2. Após o ajuste da contagem de plaquetas (por amostra: 1 x 10⁶ plaquetas), ative as plaquetas em um tubo com os ativadores plaquetários por 30 min em RT, conforme indicado na Tabela 4.
3. Adicione 43,3 μL de coquetel de anticorpos às amostras e incube as plaquetas por 30 min em RT no escuro.
4. Após a incubação, dilua as amostras com 300 μL de 1x tampão de ligação de anexina (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂) para que a proteína Anexina V possa se ligar à fosfatidilserina no lado externo da membrana celular. Meça as amostras imediatamente.
   NOTA: Meça as amostras imediatamente após a preparação. Como as amostras não são fixas, atrasar a preparação e a medição da amostra pode aumentar a variabilidade dos resultados. A fixação prejudica a encadernação do Anexo V.

4. Configuração de compensação e medição de fluorescência menos um controle (FMO)

NOTA: Antes de gravar dados, execute uma configuração de compensação. Um citômetro de fluxo calcula automaticamente as configurações de compensação; Consulte os manuais usuais do citômetro de fluxo para o procedimento de compensação específico. No entanto, use controles de compensação com células ou com contas.

1. Configuração de compensação
   1. Para compensação com grânulos, prepare 150 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para cada fluoróforo com uma gota de grânulos e 1 μL do anticorpo conjugado com fluorescência.
   2. Monitore a reatividade das espécies das contas. Use IgGκ anti-mouse e o controle negativo de micropartículas de poliestireno. Para compensar a anexina V, rotule as esferas PE / Cy7 com o anticorpo PE / Cy7 anti-CD62L humano que conjuga o mesmo fluoróforo da anexina V.
   3. Use contas de compensação reativas à amina para o corante reativo à amina. Use duas gotas de grânulos positivos e uma gota de negativos em 150 μL de PBS com 1 μL do corante. Verifique se os grânulos de compensação reativos à amina reagem com o corante e mostram um sinal positivo. Verifique se as esferas negativas não reagem com o corante reativo à amina e apresentam um sinal negativo.
      NOTA: Para Zombie NIR APC-Cy7, use esferas reativas de amina negativa e positiva.
   4. Incubar as amostras de compensação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
   5. Execute cada tubo de compensação separadamente e gate na população de contas singlete com base no FSC e SSC. A população de contas aparece como uma pequena população concentrada. Desenhe um portão ao redor dessa população.
   6. Exiba os histogramas para cada tubo de compensação e ajuste os valores de compensação até que os picos positivos dos diferentes anticorpos e corantes não se sobreponham. Em seguida, meça cada tubo de compensação e deixe o transbordamento dos fluoróforos ser calculado de acordo com o SOP do fabricante.
   7. Prossiga com a aquisição do experimento de coloração real com as plaquetas humanas isoladas (consulte a etapa 3 e a Tabela 4). Ajuste a tensão SSC/FSC antes da medição para encontrar a população de plaquetas. Como o CD61 é expresso de forma onipresente nas plaquetas, verifique com esse limite de fluorescência se todos os tamanhos de plaquetas podem ser detectados.
   8. Em seguida, meça 20.000 eventos por amostra.
2. Medição FMO
   1. Prepare para cada marcador um controle FMO conforme a Tabela 5. Para poder determinar as sobreposições de todos os marcadores, prepare amostras não estimuladas e estimuladas.

5. Análise dos dados

1. Análise com um software de análise de dados de citometria de fluxo (Figura 4)
   1. Arraste e solte os arquivos FSC no software. Defina com o controle FMO a população positiva para cada marcador.
      1. Determine FMOs plotando cada controle FMO em relação a cada marcador em um gráfico de pontos. Isso torna visível o transbordamento para outros canais. Use a porta FMO com o maior transbordamento de fluorescência como limite para a população positiva para as amostras de 10 cores tratadas.
2. Analisando com uma análise de citometria de fluxo baseada em nuvem (Figura 5)
   1. Abra o software e crie um novo conjunto de dados. Arraste e solte os arquivos FCS adquiridos com o citômetro de fluxo.
   2. Inicie a análise criando um fluxo de trabalho. A matriz de compensação é criada automaticamente a partir dos arquivos de dados brutos.
   3. Execute uma análise UMAP com as seguintes configurações: Vizinhos: 15, Distância mínima: 0,4; Componentes: 2; Métrica: Euclidiana; Taxa de aprendizagem: 1; Épocas: 200; Inicialização de incorporação: espectral. Selecione todos os arquivos e todos os 10 marcadores (recursos).
   4. Adicione a análise Phenopraph como uma nova tarefa e execute a análise com as seguintes configurações: K Vizinhos mais próximos: 20; Métrica de distância: euclidiana; Louvain corre: 1; Número de resultados: 1.
   5. Adicione uma tarefa de restrição para indicar os clusters gerados. Após executar a análise, é possível apresentar os dados em diferentes borrões, que podem ser exportados.

Resultados

Existem duas opções para analisar os dados brutos coletados por um painel de citometria de fluxo multicolorido. Uma opção é analisá-lo manualmente com o software de análise (Figura 3 e Figura 4). Portanto, os dados brutos precisam ser arrastados e soltos na janela do software. Primeiro, as células precisam ser encontradas ajustando a escala SSC/FSC no modo de exibição do gráfico de dispersão para mostrar a população de plaquetas como uma nuvem de pontos distinta...

Discussão

A citometria de fluxo multicolorida permite definir agrupamentos/subpopulações plaquetárias distintas associadas a funções discretas 12,17,18. Decisivo para os resultados das subpopulações e da expressão superficial do receptor é a qualidade das plaquetas humanas isoladas. Portanto, uma etapa fundamental no protocolo apresentado é a preparação das plaquetas. Eles precisam ser isolados suavemente...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x Buffer de Ligação	Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA	88-8103-74	Buffer
Difosfato de adenosina (ADP)	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Alemanha	70212	Agonista plaquetário
Anexina V PE-Cyanine7	Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA	88-8103-74	corante
anti-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, EUA	303728	anticorpo
anti-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, EUA	303727	anticorpo
anti-CD42b PerCP/Cianina5.5	BioLegend, San Diego, CA, EUA	303918	anticorpo
anti-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	744382	anticorpo
anti-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA	IM1759U	anticorpo
anti-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambrigde, UK	ab 234251	anticorpo
anti-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	740599	anticorpo
anti-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	566234	anticorpo
anti-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	340507	anticorpo
Albumina de soro bovino (BSA)	Applichem, Darmstadt, Alemanha	A1391-Ácido
citrital	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories, Ely, Reino Unido	CRP-XL	agonista plaquetário
D-(+)-Glicose	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA	G7528-Dubecco
' s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA	Agonista plaquetário	H9039-10G
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	9105.3-Cloreto	de
potássio	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	6781.3-Cloreto	de
sódio	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	3957.1-Hidrogenocarbonato	de
sódio	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, EUA
401676-Trombina	Roche	10602400001	agonista plaquetário
citrato-di-hidrato tri-sódico	Applichem, Darmstadt, Alemanha		1416551211-Zombie
NIR	BioLegend, San Diego, CA, EUA	423105	corante reativo à amina