Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

Resumo

A citometria de fluxo multicolorida para plaquetas pode identificar novos subtipos de plaquetas dentro de subpopulações clássicas de plaquetas, como plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Isso permite a comparação de diferentes padrões de subpopulação induzidos por vários agonistas plaquetários. Aqui, um procedimento para estabelecer um painel de citometria de fluxo multicolorido é descrito em detalhes.

Resumo

As plaquetas, ou trombócitos, são pequenas células sanguíneas anucleadas que desempenham um papel crucial na hemostasia e trombose. Defeitos nas funções plaquetárias podem causar sangramento ou eventos trombóticos em pacientes com doenças cardiovasculares. Portanto, é importante caracterizar as plaquetas fenotipicamente para poder atribuir subpopulações plaquetárias à função plaquetária. A estimulação de plaquetas humanas com agonistas e ativadores plaquetários induz alterações morfológicas e fisiológicas nas plaquetas, acompanhadas por alterações na população de receptores de superfície. Isso leva a subpopulações de plaquetas funcionalmente diversas. As subpopulações plaquetárias classicamente definidas são plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Para caracterizar o efeito dos agonistas nos subtipos plaquetários, estabelecemos um ensaio usando citometria de fluxo multicolorida consistindo de 10 anticorpos e corantes diferentes (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-Integrina_αIIbβ3 (clone: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Anexina V, Zombie NIR). Plaquetas humanas isoladas foram incubadas com agonistas plaquetários e coradas com anticorpos e corantes específicos conjugados com fluoróforo. Em seguida, foram medidas por citometria de fluxo. Isso nos permite definir subtipos específicos de agonistas dentro das quatro subpopulações clássicas. Em conclusão, a combinação de marcadores de ativação (anti-CD62P, anti-CD63, anti-Integrin_αIIbβ3 (clone: PAC-1)), marcadores inflamatórios (anti-CXCR4, anti-ACKR3) e marcadores apoptóticos (Anexina V, Zombie NIR) que compõem o painel de citometria de fluxo de 10 cores descrito neste manuscrito abre a possibilidade de definir outros subtipos de plaquetas que podem estar ligados a uma função plaquetária específica. Este método pode ser aplicado em pesquisas básicas sobre função e fisiologia plaquetária, bem como na definição de novos subtipos plaquetários em modelos de doenças e estudos com pacientes.

Introdução

Os trombócitos, também chamados de plaquetas, são pequenas células sanguíneas livres de núcleo, essenciais para a hemostasia e o desenvolvimento de trombose ^1,2. Eles podem ser ativados por vários agonistas plaquetários. Os agonistas plaquetários fisiológicos clássicos são o difosfato de adenosina (ADP), que se liga aos receptores P2Y12 e P2Y1, a trombina que ativa as plaquetas por meio dos receptores PAR1 e PAR4 e o colágeno que interage com a glicoproteína VI. O colágeno pode ser substituído em experimentos in vitro pelo peptídeo relacionado ao colágeno (CRP-XL)

Protocolo

A coleta e o manuseio de sangue para fins de pesquisa foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard Karls e do Hospital Universitário de Tübingen (voto de ética 238/2018B02), e as metodologias do estudo estavam em conformidade com os padrões estabelecidos pela Declaração de Helsinque. Doadores saudáveis deram consentimento informado por escrito para coleta de sangue. As características basais para doadores saudáveis estão listadas na Tabela 1. A Figura 1 fornece uma visão geral do protocolo de citometria de fluxo.

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Resultados

Existem duas opções para analisar os dados brutos coletados por um painel de citometria de fluxo multicolorido. Uma opção é analisá-lo manualmente com o software de análise (Figura 3 e Figura 4). Portanto, os dados brutos precisam ser arrastados e soltos na janela do software. Primeiro, as células precisam ser encontradas ajustando a escala SSC/FSC no modo de exibição do gráfico de dispersão para mostrar a população de plaquetas como uma nuvem de pontos distinta.......

Discussão

A citometria de fluxo multicolorida permite definir agrupamentos/subpopulações plaquetárias distintas associadas a funções discretas 12,17,18. Decisivo para os resultados das subpopulações e da expressão superficial do receptor é a qualidade das plaquetas humanas isoladas. Portanto, uma etapa fundamental no protocolo apresentado é a preparação das plaquetas. Eles precisam ser isolados suavemente.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x Buffer de Ligação	Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA	88-8103-74	Buffer
Difosfato de adenosina (ADP)	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Alemanha	70212	Agonista plaquetário
Anexina V PE-Cyanine7	Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA	88-8103-74	corante
anti-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, EUA	303728	anticorpo
anti-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, EUA	303727	anticorpo
anti-CD42b PerCP/Cianina5.5	BioLegend, San Diego, CA, EUA	303918	anticorpo
anti-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	744382	anticorpo
anti-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA	IM1759U	anticorpo
anti-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambrigde, UK	ab 234251	anticorpo
anti-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	740599	anticorpo
anti-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	566234	anticorpo
anti-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, EUA	340507	anticorpo
Albumina de soro bovino (BSA)	Applichem, Darmstadt, Alemanha	A1391-Ácido
citrital	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories, Ely, Reino Unido	CRP-XL	agonista plaquetário
D-(+)-Glicose	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA	G7528-Dubecco
' s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, EUA	Agonista plaquetário	H9039-10G
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	9105.3-Cloreto	de
potássio	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	6781.3-Cloreto	de
sódio	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	3957.1-Hidrogenocarbonato	de
sódio	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, EUA
401676-Trombina	Roche	10602400001	agonista plaquetário
citrato-di-hidrato tri-sódico	Applichem, Darmstadt, Alemanha		1416551211-Zombie
NIR	BioLegend, San Diego, CA, EUA	423105	corante reativo à amina