Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

Summary

O protocolo descreve o método de hibridização in situ de fluorescência sensível a polimorfismos de nucleotídeo único (SNP-FISH) para distinguir transcritos de RNA ribossômico derivados do locus de DNA ribossômico do cromossomo X ou Y em Drosophila melanogaster.

Abstract

Para garantir que o RNA ribossômico (rRNA) suficiente seja transcrito para a função do ribossomo, os genomas contêm centenas de duplicações em tandem das sequências que codificam rRNAs, compondo regiões chamadas loci de DNA ribossômico (rDNA). Os genomas de muitos organismos contêm mais de um locus de rDNA distribuído em diferentes cromossomos, e o rRNA pode ser transcrito de vários loci de rDNA ou apenas de um único locus. Alterações nas fontes de transcrição do rRNA geralmente indicam sofrimento ribossômico. No entanto, a homogeneidade do rRNA obstrui a distinção se o rRNA é transcrito de múltiplos ou de um único locus de rDNA. Aqui, descrevemos um método que usa hibridização in situ de fluorescência sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único (SNP-FISH) para distinguir a transcrição de rRNA entre loci de rDNA de Drosophila melanogaster nos cromossomos X e Y. Este método aproveita as variantes de rRNA específicas do locus para permitir a fácil detecção da fonte de transcrição de rRNA com resolução de célula única. Este ensaio pode ser aplicado a qualquer tipo de célula de Drosophila e pode ser adaptado para uso em outros sistemas.

Introduction

Os RNAs ribossômicos 18S, 5.8S e 28S (rRNAs) necessários para a função do ribossomo são co-transcritos em um único cistron chamado pré-rRNA 45S. Os três rRNAs são separados dentro do pré-rRNA 45S por duas sequências espaçadoras transcritas internas (ITS) e flanqueadas por sequências espaçadoras transcritas externas (ETS) nas extremidades 5' e 3'. Todas essas sequências espaçadoras são removidas do pré-rRNA 45S para que os rRNAs maduros sejam incorporados aos ribossomos (ver¹). Para atender à alta demanda por produção de rRNA necessária para suportar a atividade do ribossomo, todos os genomas eucarióticos contêm centenas de cópias da sequência 45S. Essas cópias são agrupadas em repetições em tandem, formando regiões genômicas chamadas loci de DNA ribossômico (rDNA). A maioria dos genomas eucarióticos contém vários loci de rDNA espalhados por cromossomos separados (ver²). A alta redundância das cópias 45S significa que normalmente há muito mais cópias 45S do que o necessário para a transcrição, e a maioria das cópias 45S são transcricionalmente silenciosas e enterradas na heterocromatina³. A atividade transcricional não é uniforme entre os loci de rDNA, e a variação na transcrição do locus de rDNA é amplamente observada em organismos ^4,5,6, indicando que a transcrição 45S é regulada diferencialmente em loci de rDNA individuais. O silenciamento de rDNA em todo o locus foi observado em plantas, invertebrados e vertebrados 7,8,9,10, sugerindo que o silenciamento de rDNA em todo o locus é um mecanismo importante para regular a dosagem de rRNA ¹¹. A transcrição de rRNA é uma etapa regulatória fundamental na produção de ribossomos, e as alterações na transcrição de rRNA que modulam a atividade translacional são uma característica importante tanto da diferenciação normal quanto das condições de doença¹². Alterações na transcrição do locus do rDNA também estão associadas a reduções no número total de cópias do rDNA¹³. Assim, a transcrição alterada do rDNA específico do locus pode ser um importante indicador de fisiologia celular interrompida.

Embora o silenciamento específico do locus pareça ser uma importante fonte de regulação transcricional do rRNA, os mecanismos que estabelecem esse silenciamento e direcionam quais loci de rDNA são transcricionalmente ativos são amplamente desconhecidos. A homogeneidade das sequências de rDNA dificulta a avaliação da transcrição individual do locus do rDNA, impedindo a análise generalizada da atividade transcricional do rDNA específico do locus. Este desafio pode ser possível de superar aproveitando a variação estrutural e da sequência de nucleotídeo único entre as cópias de rDNA dentro do mesmo genoma 4,5,6,13. Algumas dessas variantes podem ser compartilhadas entre a maioria ou todas as cópias em um locus individual, criando haplótipos únicos de locus de rDNA de múltiplas variantes que distinguem um locus de rDNA. De fato, o mapeamento recente de variantes de rDNA para loci específicos pelo consórcio telômero a telômero revelou variantes de rDNA compartilhadas específicas do locus no genoma humano¹⁴. Esses mapas de locus de rDNA podem permitir a identificação da transcrição específica do locus a partir de conjuntos de dados de sequenciamento; no entanto, a disponibilidade desses mapas atualmente permanece limitada e não é fácil de produzir. Como os loci de rDNA residem apenas nos cromossomos sexuais em Drosophila melanogaster (um locus em cada cromossomo X e Y) ¹⁵, o locus de rDNA do cromossomo Y está ausente em mulheres XX. Esse isolamento natural do locus do cromossomo Y significa que as variantes de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) entre os loci de rDNA X e Y podem ser facilmente identificadas no sequenciamento de leitura curta como quaisquer variantes presentes nos homens (XY), mas ausentes nas mulheres (XX). SNPs previamente identificados podem ser rapidamente testados em cepas de Drosophila não genotipadas por meio de PCR simples e sequenciamento de Sanger de DNA de machos e fêmeas. Além disso, a disponibilidade de cepas de Drosophila com um cromossomo X que não possui locus¹⁶ de rDNA significa que os loci de rDNA X e Y individuais podem ser isolados individualmente para uma caracterização ainda mais precisa do SNP de rDNA. Essa fácil identificação de variantes de SNP entre os loci de rDNA de Drosophila torna possível determinar haplótipos SNP de loci de rDNA X e Y^{exclusivos 13}. Os loci de rDNA do cromossomo X também são tipicamente completamente silenciosos em homens de Drosophila, mas ambos os loci do cromossomo X são transcritos em fêmeas^10,17, tornando a Drosophila um sistema útil para estudar o silenciamento de rDNA em todo o locus.

A hibridização in situ fluorescente (FISH) é uma ferramenta poderosa para visualizar a presença de sequências específicas de RNA ou DNA dentro das células individuais de um tecido. Os rótulos FISH têm como alvo sequências de RNA ou DNA por meio de sondas de oligonucleotídeos antisense conjugadas a fluoróforos. As sondas FISH normalmente precisam ter ~ 20 nucleotídeos de comprimento para fornecer ligação de alvo estável o suficiente para serem visualizadas, mas sondas tão longas também podem se ligar facilmente a sequências não-alvo que diferem em apenas um único nucleotídeo (Figura 1A). Por outro lado, as sondas curtas o suficiente para conferir especificidade de nucleotídeo único não se ligam de forma estável o suficiente para visualização. Para equilibrar especificidade e estabilidade, o FISH sensível a SNP (SNP-FISH) combina uma sonda fluorescente antisense longa de ~ 26 nucleotídeos com um oligonucleotídeo de máscara de detecção não fluorescente que se liga a todos, exceto à extremidade 5 'da sonda¹⁸. Esta máscara deixa apenas os 10 nucleotídeos 5 'da sonda de fita simples e disponíveis para ligação ao alvo (Figura 1B). Essa porção curta de fita simples da sonda confere especificidade ao alvo, mas evita a reatividade cruzada com RNAs que têm até mesmo uma única incompatibilidade com esses 10 nucleotídeos ( Figura 1B ). Uma vez que a extremidade 5' da sonda se liga ao seu alvo, o deslocamento passivo da fita retira a máscara da sonda, permitindo que a região 3' se ligue ao alvo e criando uma rotulagem estável do alvo (Figura 1B)¹⁸. Portanto, o SNP-FISH pode visualizar diferencialmente RNAs que diferem em um único SNP usando um par de sondas que possuem fluoróforos diferentes, cada um complementando um SNP diferente, mas compartilhando uma máscara comum (Figura 1C). Embora este método recrute apenas uma única sonda conjugada com fluoróforo para o SNP alvo, o agrupamento de vários conjuntos de sonda-máscara para vários SNPs dentro de um haplótipo de rDNA compartilhado pode ser usado para amplificar a detecção sensível ao SNP de um único rRNA (Figura 1D). Além disso, como o rRNA é tão abundantemente transcrito, os transcritos de rRNA podem ser facilmente visualizados em experimentos FISH usando um pequeno número de marcadores fluorescentes por RNA. Essa baixa necessidade de fluoróforo por RNA significa que o SNP-FISH pode visualizar rRNAs de um locus específico com apenas alguns SNPs exclusivos. Este método pode detectar facilmente a transcrição de rRNA específica do locus em uma variedade de tecidos de Drosophila e estágios de desenvolvimento¹⁷. É particularmente eficaz em células-tronco germinativas masculinas de Drosophila, que mudam entre a transcrição exclusiva do Y-rDNA e a co-expressão dos loci de rDNA dos cromossomos X e Y durante o envelhecimento¹³. Aqui, fornecemos um protocolo SNP-FISH para visualizar transcritos de rRNA X e Y distintos no testículo de Drosophila para atingir o objetivo geral de avaliar o silenciamento de rRNA específico do locus. Este método usa quatro SNPs previamente caracterizados entre os loci de rDNA nos cromossomos X e Y da cepa comum de Drosophila de laboratório y¹w¹ (Figura 1D).

Protocol

1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: A técnica sem RNase deve ser usada nas etapas 1, 3 e 4, e reagentes certificados sem RNase devem ser usados.

1. Em uma capa química, prepare 40 mL de formaldeído a 4% em 1x solução de fixação de PBS adicionando 10 mL de formaldeído a 16% e 4 mL de PBS 10x sem RNase a 26 mL de água livre de RNase. Distribua em alíquotas de 1 mL e armazene a -20 °C dentro de 30 minutos após o preparo. A solução de fixação pode ser conservada a -20 °C até 6 meses.
   CUIDADO: A solução contém formaldeído. Manuseie com luvas e EPI apropriado e descarte-o com segurança.
2. Prepare 10 mL de tampão de hibridização misturando 1 mL de 20x solução salina livre de RNase-citrato de sódio (SSC), 1 g de sulfato de dextrana, 100 μL de 100 mg/mL de tRNA de Saccharomyces cerevisiae , 100 μL de 200 mM de complexo ribonucleosídeo vanadil, 1 mL de BSA livre de RNase a 5%, 1 mL de formamida deionizada combinada com 6 mL de água livre de RNase. Distribua em alíquotas de 1 mL em tubos de microcentrífugas de 1,5 mL e armazene a -20 ° C por até 1 mês.
3. Prepare 50 mL de tampão de lavagem adicionando 5 mL de SSC livre de 20x RNase, 5 mL de formamida deionizada, 50 μL de Triton-X a 40 mL de água livre de RNase. Armazene em temperatura ambiente no escuro por até 1 mês.
4. Prepare 10 mL de tampão de isolamento de DNA adicionando 100 μL de 1M Tris-HCl pH 7,5-8,0, 20 μL de EDTA 0,5M e 50 μL de NaCl 5M a 9,8 mL de água.

2. Genotipagem de amostra para SNPs de rRNA específicos de X e Y

1. Colete fêmeas e machos X homozigotos individuais não acasalados que abrigam o mesmo cromossomo X em tubos de 0,2 mL e resfrie no gelo.
2. Combine 50 μL de tampão de isolamento de DNA com 0,5 μL de 20 mg / mL de proteinase K por amostra.
3. Adicione 50 μL de tampão de isolamento de DNA / Proteinase K à amostra de Drosophila e homogeneize a amostra usando uma ponta de pipeta.
4. Incubar amostras a 37 ° C por 30 minutos, seguido de 95 ° C por 2 minutos. Transfira 40 mL de amostra (evite detritos de animais) para um tubo limpo de 1,5 mL.
5. Amplificar separadamente cada região-alvo SNP de cada amostra de ADN por PCR utilizando a concentração de 10 μM dos seguintes pares de iniciadores: SNP 18S Direto + Reverso; ITS1 SNP Direto + Reverso; 28S SNP Direto + Reverso. A sequência do primer e o tamanho esperado do amplicon de PCR são encontrados na Tabela 1.
6. Use eletroforese em gel para separar toda a amostra de PCR em um gel TAE de agarose 1x a 1% para confirmar o produto de PCR esperado. Os tamanhos esperados dos produtos estão listados na Tabela 1.
7. Isole o produto de PCR do gel usando qualquer kit de extração de gel disponível comercialmente.
8. Sequenciar produtos de PCR por sequenciamento Sanger. Sequencie as amostras em ambas as direções usando reações individuais separadas para o primer F e R para cada alvo.
9. Determine a variante SNP do cromossomo X nas posições da Tabela 2 em uma amostra de DNA feminino não acasalada. O haplótipo X esperado está descrito na Tabela 2.
10. Observe as posições do SNP no cromatograma de sequenciamento de amostras de DNA masculino. Inferir a variante SNP do cromossomo Y com base na variante X SNP já determinada em cada posição SNP. O haplótipo Y esperado está descrito na Tabela 2.

Nome do primer	Seqüenciar	Tamanho esperado do amplicon
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 pb
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTGTTTC	955 pb
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598 pb
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

Tabela 1: Sequências de primers para sequenciamento de SNPs de rDNA. Pares de primers para amplificar regiões de rDNA que contêm SNPs previamente caracterizados nas regiões de rDNA 18S, ITS1 e 28S. A sequência de oligonucleotídeos do primer e o tamanho esperado do amplicon de PCR são listados.

Haplótipo	Posição do SNP	Seqüenciar
DNA X	18S	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA	18S	1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tabela 2: Haplótipos de rDNA esperados. SNPs esperados nos loci de rDNA dos cromossomos X e Y na cepa y¹w¹ Drosophila. SNP indicado em negrito e sublinhado. Posição listada com base na sequência de rRNA 45S de consenso (arquivo suplementar 1).

3. Dissecção, fixação e permeabilização dos testículos

1. Limpe o estereomicroscópio, a estação de trabalho, o prato de dissecação e a pinça de dissecação com etanol a 70% (ou outro tratamento com RNase).
2. Sob um estereomicroscópio, disseque Drosophila para isolar testículos em PBS livre de 1x RNAse. Segure o meio do abdômen do animal com um par de pinças e segure a extremidade do abdômen com outro par de pinças para separar suavemente o animal. Os testículos se dissociarão do animal e podem ser separados ainda mais usando uma pinça. Colete 30 - 40 testes por amostra.
3. Usando uma pinça, pegue os testículos e transfira-os da placa de dissecação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 0,5 mL de PBS livre de RNase.
4. Aspire PBS e adicione 1mL de solução de fixação. Incubar à temperatura ambiente num agitador de nutatas durante 30 min.
5. Lave 2x com 1 mL de 1x PBS sem RNase por 5 min cada em um agitador de nutação. Aspire 1x PBS e adicione 1 mL de etanol a 70% (EtOH) livre de RNase. Incubar a 4 °C durante a noite num agitador de nutação.

4. RNA ribossômico sensível a SNP

1. Aspirar etanol e adicionar 1 ml de tampão de lavagem. Incube em temperatura ambiente por 3 min em um agitador de nutação, seguido de 2 min de tubo em repouso na posição vertical.
2. Misture sondas e máscaras com tampão de hibridização, perfazendo 100 μL de volume total por amostra. As sequências de sonda, máscara e rótulos de fluoróforo estão listados na Tabela 3. Ao usar todos os 4 SNPs, prepare 80 μL de tampão de hibridização, 1 μL de cada sonda Y-SNP de 10 μM (4 μL no total), 1 μL de cada sonda X-SNP de 10 μM (4 μL no total) e 3 μL de máscara comum de 10 μM (12 μL no total)
3. Aspire o tampão de lavagem e, em seguida, adicione 100 μL de solução de hibridização. Aplique filme transparente nas bordas do tubo, embrulhe em papel alumínio para proteger da luz e incube em banho-maria a 37 °C por pelo menos 24 h.
4. Adicione 1 mL de tampão de lavagem à amostra sem aspirar a solução de hibridização. Incubar em banho-maria a 37 °C durante 30 min no escuro.
5. Aspire o tampão de lavagem e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lavagem à amostra. Incubar em banho-maria a 37 °C durante 30 min no escuro.
6. Aspire o tampão de lavagem e adicione 50 μL de meio de montagem. As amostras podem ser imediatamente montadas em lâminas ou armazenadas por até 1 semana a 4 °C antes da montagem.

Posição do SNP	Oligonucleotide	Seqüenciar		3' fluoróforo conjugado
18S	Sonda X SNP	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 488
	Sonda Y SNP	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 647
	Máscara	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1	Sonda X SNP	AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 488
	Sonda Y SNP	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 647
	Máscara	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2	Sonda X SNP	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 488
	Sonda Y SNP	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 647
	Máscara	GTTTCGAACATGAAAA
28S	Sonda X SNP	TTAGGCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		Alexa 488
	Sonda Y SNP	TTAGCCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		Alexa 647
	Máscara	TTTTCAAGTAAAACAA

Tabela 3: Sequências de sonda e máscara para rDNA SNP-FISH. As posições do SNP são destacadas em negrito. A porção da sonda que se liga ao oligonucleotídeo da máscara é sublinhada. Exemplos de fluoróforos conjugados 3 'adequados são listados, mas quaisquer fluoróforos compatíveis podem ser usados.

5. Preparação de amostras para imagem

1. Trabalhando sob um estereomicroscópio de dissecação, use uma pipeta de orifício largo para transferir a amostra para uma lâmina de microscópio.
2. Usando uma pinça, organize os testículos em uma linha para facilitar a localização de amostras durante a imagem (sem necessidade de orientação específica). Cubra a amostra com uma lamínula. Seque as bordas da lamínula com um lenço de papel para remover o excesso de mídia de montagem.
3. Sele as bordas da lamínula com esmalte. Deixe deslizar no escuro em temperatura ambiente por 10 min para que o esmalte seque. As lâminas podem ser usadas imediatamente para imagens confocais ou armazenadas por até um mês a 4 °C antes da imagem^.

Results

Espera-se que os resultados do sequenciamento da genotipagem de SNP detectem diferenças de SNP entre os loci de rDNA X e Y. Esses SNPs são detectados avaliando diretamente as posições dos SNPs nos cromatogramas de sequenciamento (Figura 2). Espera-se que o sequenciamento de amostras femininas tenha um único sinal de sequenciamento na posição SNP, indicando homozigosidade SNP entre os dois cromossomos X (Figura 2A). Espera-se que os resultados do sequenciamento de amostras masculinas tenham um pico duplo na posição SNP (Figura 2B). Com base no genótipo do cromossomo X determinado a partir do sequenciamento da amostra feminina, a variante não-X é inferida como um SNP de rDNA do cromossomo Y (ou seja, X = T, Y = C para o sequenciamento do SNP 18S na Figura 2). Alternativamente, um único pico de sequenciamento em uma posição SNP na amostra masculina indicaria homozigosidade entre loci de rDNA masculino e feminino nessa posição SNP, e essa posição não seria utilizável para rRNA SNP-FISH.

Seguindo o protocolo para SNP FISH, as amostras podem ser visualizadas montando em lâminas e colocadas sob uma lamínula selada, seguida de microscopia confocal. Usando as sondas listadas na Tabela 3, o sinal de rRNA derivado de Y é detectado pela emissão de Alexa Fluor 647 e o sinal de rRNA derivado de X é detectado pela emissão de Alexa Fluor 488. Espera-se que os sinais de rRNA sejam observados no nucléolo, que pode ser identificado como o buraco pobre em DAPI no núcleo ( Figura 3A ). O nucléolo é particularmente fácil de identificar em células germinativas devido ao seu grande núcleo e nucléolo (Figura 3A). O sinal fraco normalmente também pode ser encontrado no citoplasma (Figura 3), mas este é um sinal inespecífico que também pode ser detectado em amostras sem rRNA contendo um SNP complementar (ou seja, sinal Y em células sem Y rDNA ou sinal X em células sem X rDNA; Figura 3B-C). Além disso, a co-marcação artificial de RNr X e Y às vezes pode ser detectada no centro somático, mesmo em amostras sem loci de rDNA X ou Y (Figura 3B-C, setas amarelas). Assim, apenas sinais nucleares devem ser usados para avaliar a transcrição específica do locus. Espera-se que a maioria das células, particularmente as células somáticas, tenha apenas um sinal Y rRNA, indicando que o rRNA é transcrito exclusivamente do locus Y rDNA (Figura 3A, círculo pontilhado amarelo e seta vermelha) ^{10 , 17} . No entanto, a co-expressão de rRNA X e Y é freqüentemente detectada em células germinativas, particularmente células-tronco germinativas¹³ (Figura 3A, círculos pontilhados brancos). Os sinais de rRNA X e Y em células que co-expressam podem ser adjacentes e formar um único nucléolo ( Figura 3A célula superior ) ou podem ser separados, formando dois nucléolos ( Figura 3A célula inferior ). Os exemplos na Figura 3 são fornecidos a partir do rDNA SNP-FISH usando conjuntos de sondas direcionados a apenas dois SNPs (os dois SNPs ITS1), demonstrando que apenas dois SNPs são necessários para o rDNA SNP-FISH. No entanto, sinais mais robustos são observados ao usar sondas direcionadas a todos os quatro SNPs¹³.

Os controles negativos são uma inclusão importante para este ensaio para confirmar que as sondas não reagem de forma cruzada com o alvo SNP errado, especialmente ao solucionar o problema do método pela primeira vez. Os controles negativos do cromossomo X incluem qualquer condição que não tenha rDNA do cromossomo X, como homens que abrigam um cromossomo X com deleção de rDNA. Espera-se que os controles negativos do cromossomo X detectem apenas o sinal Y rRNA e nenhum X rRNA (Figura 3B). Os controles negativos do cromossomo Y incluem qualquer condição que não tenha rDNA do cromossomo Y. Alguns exemplos dessas condições são quaisquer tecidos femininos XX, tecidos de homens sem cromossomo Y ou homens que abrigam um cromossomo Y com deleção de rDNA¹⁵. Espera-se que os controles negativos do cromossomo Y detectem apenas o sinal X rRNA e não tenham sinal Y rRNA detectável ( Figura 3C ). Observe que esses controles não são importantes apenas para determinar a especificidade da sonda, mas também para determinar qualquer fundo de sinal ou artefatos. Quaisquer novas sondas ou condições de ensaio que forneçam especificidade em tais controles podem ser usadas com precisão para detectar a transcrição de rDNA específica do locus.

Diferentes condições genéticas, de desenvolvimento ou ambientais podem alterar a probabilidade de que o rDNA seja transcrito exclusivamente do locus do rDNA do cromossomo Y ^13,17. A frequência de transcrição do rDNA de um único locus ou de vários loci pode ser quantificada e comparada diretamente entre as amostras. Para comparar quantitativamente as diferenças na transcrição do locus do rDNA, cada célula deve ser categorizada individualmente como dominante em Y, codominante ou dominante em X. As células só são categorizadas como dominantes em Y e X se apenas o respectivo sinal for detectado. Qualquer célula com sinais de rRNA Y e X é considerada co-dominante, mesmo que um sinal seja muito mais fraco que o outro. Assim, as células que contêm sinais X e Y muito fortes são qualitativamente consideradas iguais às células com sinais Y forte e X fraco ou X forte e Y fraco. A porcentagem total de todas as células em todas as amostras em cada categoria pode ser comparada entre amostras pelo teste qui-quadrado. Embora este ensaio funcione bem para determinar qualitativamente se um determinado locus de rDNA é transcrito ou não, não observamos avaliações consistentes entre amostras ao quantificar diretamente a intensidade de fluorescência de sinais SNP-FISH individuais. Assim, não recomendamos fazer avaliações quantitativas da intensidade do sinal FISH entre amostras ou da intensidade relativa dos sinais X e Y rDNA dentro de uma única célula. A fonte dessa inconsistência na intensidade da fluorescência não é clara, embora possa ser devido à ligação ineficiente de sondas mascaradas que não se ligam a todos os rRNAs alvo.

Figura 1: Diagrama do método SNP-FISH. (A) As sondas tradicionais de oligonucleotídeos antisense FISH reagem de forma cruzada com RNAs não-alvo que diferem em apenas um nucleotídeo. (B) O método SNP-FISH usa oligonucleotídeo de máscara complementar ligado à região 3 'da sonda de oligonucleotídeos. A máscara deixa apenas 10 nucleotídeos livres para se ligar à sequência alvo. Uma região de sonda não mascarada não se liga de forma estável a sequências não-alvo que diferem em um ou mais nucleotídeos. A máscara se dissocia da sonda após a sonda se ligar ao alvo, permitindo a ligação estável entre a sonda e o alvo. (C) Sondas SNP emparelhadas marcadas de forma diferente, combinadas com uma máscara comum, ligam especificamente alvos que diferem por um único nucleotídeo sem reação cruzada. (D) Várias sondas podem ser agrupadas para rotular especificamente haplótipos de rRNA distintos. Quatro diferenças de SNP foram caracterizadas entre os loci de rDNA X e Y na cepa y¹w¹ Drosophila melanogaster . Um SNP no rRNA 18S, um no rRNA 28S e dois na porção ITS1 do pré-rRNA. Os haplótipos de rRNA específicos de X e Y usados para SNP-FISH são exibidos. As sondas direcionadas à variante X rDNA nos quatro SNPs de rRNA são conjugadas a um fluoróforo comum (verde) e as sondas direcionadas às variantes Y rDNA são conjugadas a um fluoróforo diferente (magenta). Uma máscara comum é usada para cada SNP (quatro no total). A ligação da sonda específica do SNP em cada posição do SNP no rRNA pode rotular especificamente o rRNA dos loci de rDNA X e Y com até quatro sondas de oligonucleotídeos FISH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de resultados de sequenciamento de SNP de rDNA homozigotos e heterozigotos. Exemplo de sequenciamento de cromatogramas de 18S SNP sequenciamento de DNA de (A) amostras femininas e (B) masculinas. Posição do SNP 18S indicada por um asterisco (*). O sinal de timina (T) único para a posição SNP na amostra feminina indica uma timina na posição SNP no locus rDNA do cromossomo X. O sinal duplo na posição do SNP dividido entre timina e citosina (C) na amostra masculina indica uma citosina na posição do SNP no locus do rDNA do cromossomo Y (inferido pelo conhecimento de que a timina está no locus do cromossomo X). Os resultados do sequenciamento foram visualizados usando ApE - um software editor de plasmídeo¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplos de resultados de SNP-FISH no testículo de Drosophila usando apenas dois conjuntos de sondas SNP-FISH. Exemplos de SNP FISH no testículo de animais com (A) x e Y rDNA, (B) apenas Y rDNA ou (C) apenas X rDNA. Esses exemplos usaram apenas conjuntos de sondas rotulando os dois SNPs de rRNA ITS1, demonstrando que o rRNA SNP FISH funciona com apenas dois SNPs alvo. As células germinativas são identificadas por seu grande núcleo redondo e as células somáticas por seu núcleo menor e menos redondo. As células-tronco germinativas são identificadas por sua posição diretamente ao lado do centro somático, marcadas por um asterisco (*). As células germinativas que transcrevem o rDNA dos loci X e Y do rDNA são identificadas por sinais nucleares FISH X e Y (círculos pontilhados brancos, AA ''). As células germinativas que transcrevem DNA apenas do locus Y rDNA têm apenas um sinal FISH nuclear Y (círculo pontilhado amarelo). As células somáticas que expressam apenas Y são marcadas com uma seta vermelha. A co-marcação artificial de loci de rDNA X e Y pode ser observada no centro somático (seta amarela). A barra de escala é de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: sequência de rRNA do locus do cromossomo X. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Aqui, descrevemos um método para usar SNP-FISH para distinguir transcritos de rRNA 45S derivados dos loci de rDNA dos cromossomos X e Y em tecidos de Drosophila melanogaster . A etapa mais crítica neste protocolo é a genotipagem precisa de SNPs 45S para serem usados como alvos SNP-FISH. Fornecemos primers e protocolo para genotipar quatro SNPs conhecidos de Drosophila 45S, mas outros métodos de sequenciamento podem revelar novos SNPs que poderiam ser usados alternativamente para o ensaio. Quaisquer posições de SNP idênticas entre os loci de rDNA dos cromossomos X e Y (ou seja, há um único pico de sequenciamento em amostras de DNA masculino) não podem ser usadas para SNP FISH. Algumas posições de SNP podem ser consideradas heterogêneas dentro de um único locus de rDNA (ou seja, os resultados do sequenciamento não fornecem uma única variante de SNP para amostras XX ou apenas um segundo pico de sequenciamento muito pequeno em amostras XY). SNPs heterogêneos dentro de um único locus de rDNA também não são adequados para este ensaio, uma vez que uma das variantes seria compartilhada entre os dois loci de rDNA, tornando a transcrição de um único locus ou de vários loci indistinguível. Além disso, devido ao armazenamento de espermatozóides femininos²⁰, o DNA isolado de fêmeas acasaladas pode conter rDNA do cromossomo Y. Assim, é fundamental que as fêmeas não acasaladas sejam usadas para análise de sequenciamento XX. É importante ressaltar que este método requer pelo menos dois SNPs específicos do cromossomo para permitir que pelo menos duas sondas específicas do locus se liguem a cada molécula de rRNA para detecção, limitando sua aplicação a loci de rDNA com pelo menos dois SNPs distintos entre eles. A disponibilidade de mais SNPs permite que mais sondas se liguem a cada rRNA e pode fornecer maior eficácia de sinal. Curiosamente, este método rotula apenas o rRNA no nucléolo, apesar de dois pares de sondas direcionados a SNPs nos rRNAs 18S e 28S que são exportados para o citoplasma (o rRNA contendo os dois locais-alvo ITS1 existe apenas no nucléolo). A falta de sinal citoplasmático FISH sugere duas possibilidades não exclusivas: 1) as sondas 18S e 28S sozinhas são insuficientes para detectar rRNA citoplasmático, talvez porque o rRNA esteja mais disperso por todo o citoplasma do que no nucléolo, ou 2) há menor eficiência de ligação da sonda aos rRNAs integrados nas subunidades ribossômicas maduras do que ao rRNA 45S não processado. SNPs adicionais dentro dos rRNAs 18S e 28S podem permitir a detecção de rRNAs citoplasmáticos por FISH sensíveis a SNP.

Outros métodos para avaliar a transcrição de rRNA específica do locus incluem abordagens de sequenciamento de rRNA que diferenciam a expressão de variantes de rRNA atribuídas a loci específicos⁶. Da mesma forma, o qPCR pode avaliar diferencialmente a expressão de variantes de rRNA que são distintas o suficiente para permitir a detecção única ^5,21, embora não esteja claro se o silenciamento dessas variantes representa o silenciamento de todo um locus de rDNA. Embora esses métodos possam ser eficazes na quantificação da expressão de variantes específicas de rRNA, eles não podem ser feitos com resolução de célula única. A heterogeneidade do silenciamento do rDNA do cromossomo X nos tecidos de Drosophila sugere que há uma forte variação célula a célula na transcrição do locus do rDNA¹⁷ e destaca a necessidade de técnicas que possam explicar essa variabilidade. Características de imagem associadas à transcrição ativa em loci de rDNA, como a variante¹⁰ da histona H3.3 ou o fator de transcrição Pol I UBF²², têm sido usadas para identificar a transcrição de rRNA específica do locus com resolução de célula única. No entanto, ambos os métodos requerem os cromossomos condensados das células mitóticas para distinguir a transcrição que ocorre em qualquer locus de rDNA específico. Nas células de Drosophila, os loci de rDNA nos cromossomos X e Y podem ser identificados pela forma do cromossomo¹⁰, mas a identificação de loci de rDNA transcricionalmente ativos em células humanas também requer co-coloração com marcadores específicos do cromossomo²². O método SNP-FISH não requer co-marcação específica do cromossomo ou marcação de marcadores transcricionais e pode ser avaliado em qualquer estágio do ciclo celular ou células pós-mitóticas, proporcionando flexibilidade para uso em diversos tecidos e condições experimentais.

Este método rRNA SNP-FISH pode ser modificado para uso com outros SNPs que distinguem entre rRNAs de Drosophila ou potencialmente ser aplicado a SNPs que distinguem entre loci de rDNA em outros organismos. A aplicação deste método a organismos com mais de dois loci de rDNA exigirá que um locus tenha um haplótipo variante de rDNA exclusivo contendo pelo menos dois SNPs que não estão presentes em nenhum outro locus de rDNA e que são compartilhados entre todas as cópias 45S nesse locus. Esse requisito significa que o método só será capaz de especificar a transcrição de um locus específico em comparação com todos os outros (ou seja, SNPs de rRNA do locus 1 em comparação com SNPs compartilhados pelos loci 2 e 3). No entanto, se cada locus de rDNA tiver um haplótipo compatível, vários experimentos podem ser combinados para avaliar individualmente a transcrição de cada locus, um de cada vez. O rigor relativamente baixo da temperatura de hibridização (37 ° C) usada neste protocolo permite uma forte ligação da sonda, particularmente devido à parte curta e desmascarada da sonda, embora a hibridização em temperaturas mais altas (50-75 ° C) tenha demonstrado aumentar o sinal de algumas sondas FISH²³. Temperaturas de hibridização mais altas podem aumentar o deslocamento da fita da máscara e aumentar a ligação da sonda, mas temperaturas muito altas podem desestabilizar a ligação da sonda-máscara e perder a especificidade do SNP. Por esse motivo, não esperamos que o SNP-FISH rotule especificamente o DNA porque as temperaturas necessárias para derreter alvos de DNA de fita dupla para permitir a ligação da sonda também desestabilizariam a ligação da sonda-máscara e eliminariam a especificidade do alvo sensível ao SNP. Ainda assim, a otimização da temperatura de hibridização para novas sondas SNP de rRNA pode aumentar o sinal, principalmente quando apenas dois locais SNP estão disponíveis. A perda do silenciamento do rDNA do cromossomo X está associada à redução do número de cópias do rDNA em Drosophila¹³, portanto, o desenvolvimento de ensaios SNP-FISH para caracterizar a transcrição de rRNA específico do locus em outros sistemas pode servir como uma ferramenta útil para avaliar a integridade do rDNA e da função do ribossomo. Além disso, este método foi modificado para uso com uma variante de deleção em Drosophila, e esta única variante estrutural de rRNA era adequada para detecção (talvez devido à maior afinidade de ligação ao alvo sem uma máscara de sonda) ¹⁷ . O uso de variantes estruturais de rRNA potencialmente combinadas com variantes de SNP amplia o potencial de aplicação em outros sistemas. Uma vez que os mecanismos que regulam a transcrição do locus do rDNA permanecem em grande parte obscuros, a flexibilidade e a potencial adaptabilidade do rRNA SNP-FISH a outros sistemas o tornam uma ferramenta poderosa para estudos futuros para investigar a transcrição do rRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Thermal Cycler	Bio Rad	12015382	Qualquer termociclador pode ser usado
0,2 mL 8 tiras flatcap PCR	VWR	89133-912	Qualquer tubo compatível pode ser usado
1 kb DNA ladder	NEB	N3232S	Para usar ao verificar sequenciamento PCR tamanho amplicon por eletroforese em gel
1,5 mL tubos de microcentrífuga graduados	EUA Scientific	1615-5510	Qualquer tubo certificado livre de RNase fará
2 mM dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	Usado para eletroforese em gel. Qualquer tampão TAE pode ser usado.
5M NaCl			Qualquer NaCl pode ser usado ou preparado a partir de qualquer fonte
Agarose	VWR	97064-250	Qualquer Agarose pode ser usado
ApE - Um plasmídeo Software Editor	N/A	N/A
Esmalte			Qualquer esmalte de qualquer varejista pode ser usado
Vidro de cobertura, Espessura nº 1	Thomas Scientific	6672A38
Deionized Formamida	Fisher Scientific	NC9569627
Dextran Sulfato de Sódio	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont # 5 Pinças	Fine Science Tools	11252-20	Usado para dissecar amostras
EDTA (0,5 M), Ph 8,0	ThermoFisher Scientific	R1021	Qualquer produto comparável pode ser usado
Etanol	VWR	89125-172	Qualquer etanol de 200 provas pode ser usado. Usado para diluição a 70% de etanol para permeabilização e limpeza para condições livres de Rnase
Brometo de Etídio	ThermoFisher Scientific	15585011
Sistema de Eletroforese Mini Gel Horizontal	Fisher Scientific	14-955-170	Qualquer sistema de eletroforese em gel pode ser usado
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Micro-Teste Placa de Coloração	Eletrônica Microscopy Sciences	71564	Usado para dissecar amostras
Agitador de nutatas	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	Qualquer agitador de nutatas pode ser usado
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4, livre de RNase	Life Technologies	AM9624
Pierce 16% Formaldeído (p/v), sem metanol	Life Technologies	28908
Precision General Purpose Water Bath Life	Technologies	TSGP02	Qualquer banho-maria pode ser usado
Kit de extração de gel QIAquick	Qiagen	28704	Qualquer kit de extração de gel pode ser usado
Solução de proteinase K recombinante (20 mg/mL)	Invitrogen	AM2546	Qualquer produto comparável pode ser usado
UltraPure BSA ThermoFisher Scientific sem Rnase		AM2618
S. cerevisiae tRNA	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), sem RNase	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	15567027	Qualquer produto comparável pode ser usado
Água destilada sem DNase/RNase UltraPure	Life Technologies	10977023
complexo de ribonucleosídeo vanadil	NEB	S1402S
Mídia de montagem VECTASHIELD com DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost Microscope Slide	VWR	48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster line	Bloomington Drosophila Stock Center	1495
Zeiss LSM 980 microscópio confocal	Microscopia Zeiss		Qualquer microscópio confocal com emissão e detecção compatíveis pode ser usado
Microscópio estéreo Zeiss Stemi 2000-C e microscópio de fonte de luz	Central	455053	Qualquer esteromicroscópio pode ser usado