É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Um protocolo robusto e reproduzível para geração de organoides por tubo neural a partir de células-tronco embrionárias individuais de camundongo

463 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67883

⸱

19 de dezembro de 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

Neste artigo

Resumo

Organoides do tubo neural tridimensional (NTOs) derivados de células-tronco embrionárias de camundongos são ferramentas valiosas para estudar o sistema nervoso central durante o desenvolvimento inicial. Aqui, é apresentada uma demonstração passo a passo de um protocolo otimizado para cultivar NTOs in vitro, fornecendo condições de cultivo estáveis e estratégias de solução de problemas para geração confiável e reprodutível de NTOs.

Resumo

O desenvolvimento dos mamíferos é um processo altamente complexo, caracterizado pela necessidade de sinalização precisa dependente da concentração e do tempo para a formação correta de padrões e morfogênese. Apesar dos consideráveis avanços tecnológicos e do conhecimento acumulado, inúmeros aspectos do desenvolvimento mamífero permanecem inalcançáveis. Ao examinar todo o organismo, torna-se desafiador separar os efeitos de vias individuais ou o mecanismo pelo qual estímulos externos guiam a interferência dos tecidos e fatores ao redor. Ao enfrentar essa complexidade, modelos in vitro tridimensionais (3D), como organoides, emergiram como ferramentas valiosas. Organoides, derivados de células-tronco embrionárias (ESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), apresentam características semelhantes a tecidos que se assemelham muito aos seus equivalentes in vivo em termos de padrões de expressão e funcionalidade. Importante, eles oferecem acessibilidade para manipulação e estudos biológicos extensos em um ambiente experimental controlado. Apesar de terem se originado de culturas pluripotentes, os sistemas organoides frequentemente exibem heterogeneidade e variabilidade substancial, limitando sua utilidade ao estudar questões biológicas complexas e intrincadas. Portanto, há uma necessidade urgente de protocolos detalhados voltados para harmonizar procedimentos que resultem em dados reproduzíveis de alta qualidade, redução de materiais usados e que, de forma importante, permitam a investigação de fenômenos complexos. Nesse contexto, um protocolo otimizado para o cultivo de organoides de tubo neural (NTOs) in vitro é apresentado aqui. Ao produzir condições de cultura estáveis e oferecer estratégias abrangentes de solução de problemas, esse protocolo possibilita a geração confiável e reprodutível de NTOs, que servem como um modelo adequado para estudar questões científicas relevantes, incluindo os mecanismos de indução neural, padronização e desenvolvimento precoce do sistema nervoso central.

Introdução

O desenvolvimento em mamíferos, começando a partir de uma única célula-tronco totipotente, é um processo complexo que envolve a indução da formação de padrões emorfogênese 1,2. Esse desenvolvimento requer programas celulares rigidamente regulados para gerenciar interações dinâmicas entre as células e seus ambientes. As células-tronco possuem a capacidade intrínseca de sentir, integrar e responder a sinais sistêmicos e locais, incluindo gradientes demorfógeno 3, limitesmecânicos 4, proliferação celular e remodelaçãoambiental 5. Pistas espaço-temporais externas também impulsionam respostas multicelulares, inicialmente, em tecidos homogêneos, para garantir a formação precisa de estruturas complexas. As células-tronco, distinguidas por sua capacidade deautorrenovação 6,7 e diferenciação, desempenham um papel crucial no desenvolvimento embrionário e na reparação de tecidos adultos, com os principais tipos incluindo células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco adultas (ASCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

As ESCs são extraídas da massa celular interna (ICM) de um blastocisto e tipicamente cultivadas em um ambiente bidimensional (2D) em células alimentadoras ou matriz extracelular, utilizando meios de cultivo específicos para manter suapluripotência 8. Nos últimos anos, a necessidade de condições e tecnologias de cultura celular mais realistas aumentou drasticamente, de modo que modelos celulares e de tecidos tridimensionais (3D) foram estabelecidos para estudar processos biomédicosfundamentais 9. Especialmente na biologia do desenvolvimento, esses modelos 3D, como organoides, oferecem um método robusto para modelar morfogênese e organogênese tecidular exvivo 9. Os organoides se formam por meio da auto-organização de células-tronco proliferantes que se desenvolvem espontaneamente em estruturas 3D complexas por meio da quebra de simetria e formação de padrões. Esse processo é semelhante, embora não idêntico ao observado in vivo, e ocorre principalmente sem orientação externa, mas impulsionado por dinâmicas e interaçõesinternas 10. Como os organoides imitam de perto a estrutura e a função dos órgãos reais, eles podem fornecer uma representação mais precisa da biologia mamífera em comparação com culturas celulares tradicionais2D 11. Além disso, um dos principais benefícios é a vantagem ética, já que os organoides reduzem a necessidade de modelos animais, abordando preocupações relacionadas aos testes emanimais 12,13. Além disso, os organoides oferecem uma plataforma para triagem de medicamentos de alta produção, melhorando a previsão da eficácia e toxicidade dos medicamentos. No entanto, também existem vários desafios associados ao uso de organoides. Embora sejam mais realistas do que culturas 2D, não replicam totalmente a complexidade e as interações de órgãos inteiros dentro de um organismovivo 14. Além disso, pode haver variabilidade significativa observada entre organoides, mesmo quando derivados do mesmo tipo de célula, levando a inconsistências nos resultadosexperimentais 15. Assim, cultivar organoides de forma robusta e reproduzível é essencial e requer habilidades técnicas avançadas, equipamentos especializados e protocolos detalhados.

O sistema nervoso é uma rede complexa responsável por coordenar ações e processar informações sensoriais enviando e recebendo sinais por todo o corpo, controlando e coordenando todas as funções necessárias, incluindo movimento, sensação, pensamento e funções autônomas, como batimentos cardíacos e digestão. O precursor do sistema nervoso central, composto pelo cérebro e pela medula espinhal, é o tubo neural. É fundamental entender como as estruturas neurais se formam e funcionam no desenvolvimento inicial do tubo neural para obter insights sobre diversos distúrbios neurológicos e anormalidades do desenvolvimento. Transtornos neurodesenvolvimentais são difíceis de estudar in vivo, especialmente quando se originam de sujeitos humanos devido a questões éticas. Organoides neurais, como os organoidescerebrais 16,17, aprimoraram significativamente a compreensão do desenvolvimento do sistema nervoso e das doenças ao fornecer modelos versáteis e acessíveis que imitam de perto o tecido cerebral humano. Essas estruturas tridimensionais, derivadas de células-tronco pluripotentes (PSCs), replicam vários aspectos do desenvolvimento cerebral, incluindo a formação de regiões cerebrais distintas, diversidade celular e redes neuraiscomplexas 16,18,19. Ao permitir que os pesquisadores observem estágios de desenvolvimento em tempo real e estudem mecanismos regulatórios-chave, esses organoides oferecem insights profundos sobre o desenvolvimento cerebral normal. Organoides cerebrais também possibilitam a modelagem de doençasneurodesenvolvimentais 19 eneurodegenerativas 20, como microcefalia 16,21, infecção pelo vírusZika 22, transtornos do espectroautista 23, entre outras, elucidando mecanismos de doenças e identificando potenciais alvos terapêuticos. Além disso, organoides cerebrais servem como plataformas valiosas para testes e desenvolvimento de medicamentos, facilitando a avaliação da eficácia e toxicidade dos medicamentos em um ambiente semelhante ao do cérebro humano e acelerando abordagens de medicina personalizada. Além disso, eles fornecem um ambiente controlado para estudar as interações gene-ambiente, ampliando a compreensão de doenças complexas resultantes da interação de fatores genéticos e ambientais. No entanto, como organoides neurais, assim como os organoides cerebrais, são tipicamente formados a partir de agregados de células, eles frequentemente apresentam heterogeneidade celular significativa e variabilidade nos resultados experimentais, o que, por sua vez, influencia a interpretabilidade dos dados gerados, representando um desafio considerável para ospesquisadores 17. Por essa razão, a otimização de protocolos e critérios precisos de controle de qualidade são críticos para a atenuação de dados valiosos que representam adequadamente a condição in vivo.

Meinhardt ecolegas 24 tiveram um impacto crucial ao relatar primeiro um protocolo de organoide neural clonal que imita o desenvolvimento inicial do tubo neural, formado a partir de células-tronco embrionárias (ESCs) individuais, minimizando drasticamente a heterogeneidade entre organoides. Essa inovação permite que pesquisadores estudem processos e mecanismos de desenvolvimento, bem como padrões neurais, em um ambiente preciso e definido com resolução excepcional. Até agora, muitos laboratórios desenvolveram organoides neurais, principalmente de origem camundongo ou humana, que imitam diferentes partes do tubo neural e seu desenvolvimento, como resumido em25. No entanto, com base nas informações disponíveis, o protocolo estabelecido por Meinhardt et al.24 é o único método em que NTOs se formam de forma confiável a partir de uma única célula, auto-organizam e se padronizam eficientemente em destinos dorsoventrais após um único pulso global de ácido retinoico (AR) sem a adição de outros fatores ventralizantes, como o Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26, ou o uso de câmaras microfluídicas que fornecem informações espaciais devido à formação de gradientes. O protocolo fornecido aqui foi adaptado de Meinhardt et al.24 , conforme fornecido em Krammer et al.26. Neste protocolo, CECs individuais de camundongos são semeados em uma matriz de cultura celular e expostos a condições definidas de neurodiferenciação. Em dois dias, essas células se expandem e epitelizam clonalmente, formando uma estrutura 3D de arredondamento a elipsoide com um único lúmen e células estratificadas apical-basicamente ao redor. No segundo dia, um pulso global de 18 horas da molécula sinalizadora AR potencializa a diferenciação neural, posterioriza os NTOs do mesencéfalo para os níveis do cérebro posterior/medula cervical e induz a formação de uma única placa funcional até o sexto dia, que modela o NTO do ventral para o dorsal.

O protocolo otimizado oferece várias vantagens importantes. Ele permite uma epitelialização robusta nos primeiros três dias e gera tecidos esféricos relativamente pequenos, com aproximadamente 200 μm de diâmetro, cada um contendo um único lúmen. Os organoides surgem clonalmente a partir de células individuais e são mantidos em um meio de cultura quimicamente definido sem soro. Em seis dias, é alcançada uma diferenciação neural gradual a partir de culturas pluripotentes, resultando em organoides que exibem identidade mesencéfalo anterior até o 6º dia e estruturas dorsoventral semelhantes a medula espinhal posterior ou cervical após um pulso global deAR 26.

Vários aspectos foram adaptados e diferem do protocolooriginal 22,25 para aumentar a reprodutibilidade e o throughput. Essas incluem condições modificadas de cultura de ESC, menor número de células de entrada, meio de diferenciação aprimorado e um protocolo de diferenciação ajustado que omite a suplementação de Noggin durante os dias 0-2 (já usado em26). Além disso, a densidade de semeadura foi otimizada para uso em placas de 96 poços, permitindo análise de alto rendimento. Juntos, esses refinamentos levaram a um aumento de 40% na formação e eficiência de padronização de NTOs, de inicialmente ~40%24 para agora ~80%26 na versão atualizada.

Aqui (Figura 1), é fornecida uma descrição detalhada de um protocolo otimizado que permite uma geração robusta e reprodutível de NTOs em matriz de cultura celular. O protocolo abrange todas as etapas do tratamento de NTOs, desde a inicialização dos ESCs para ensaios de diferenciação até a manutenção, fixação e análise subsequentes. Também inclui diretrizes para controle de qualidade por meio da avaliação visual diária da morfologia dos NTO, bem como caracterização crítica da identidade organoide usando coloração por anticorpos para verificar o padrão correto e a diferenciação neural. Além disso, são oferecidas abordagens abrangentes de solução de problemas, permitindo uma avaliação crítica em cada etapa do protocolo, o que é necessário para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade dos protocolos experimentais. Essas instruções detalhadas ajudam a identificar e resolver possíveis problemas, minimizar erros e otimizar resultados. Isso é crucial para manter a integridade dos experimentos científicos e permitir que outros cientistas repliquem com sucesso o trabalho e tirem conclusões abrangentes a partir dos dados gerados, avançando assim o campo.

figure-introduction-1
Figura 1: Visão geral do protocolo. (A) Passagem de ESCs (veja passo 1.1). (B) Alicotação da matriz de cultura celular e semeadura de ESCs individuais para diferenciação em NTOs (veja o passo 1.2). (C) Alicotação da AR e do tratamento da AR (ver passo 2). (D) Remoção da AR e rotina diária de substituição de médio (ver passo 3). Essa figura foi criada com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

NOTA: Verifique células e NTOs diariamente para avaliação de qualidade antes de qualquer procedimento adicional (substituição do meio, tratamento, fixação, etc.). Todos os procedimentos que exigem exposição direta das células ao ar devem ser realizados dentro de um gabinete de biossegurança para garantir a esterilidade e evitar a contaminação da cultura.

1. Manutenção, passagem e seed de ESCs de camundongos para diferenciação de NTOs

  1. Passagem
    1. Mantenha os ESCs em placas de cultura celular ou poços de uma placa de 6 poços pré-revestida com gelatina a 0,15% por 30 minutos a 37 °C.
    2. Passagem ESCs a cada 2-3 dias, com substituição diária de médio a partir do segundo dia.
    3. Pré-aqueça todos os reagentes (meio, PBS, solução enzimática) a um mínimo de 21 °C e no máximo de 37 °C antes do uso.
    4. Verifique as células sob microscópio de contraste de fase (veja imagens representativas, Figura 2). Certifique-se de que as colônias tenham tamanho e morfologia adequados (Figura 2A), ao mesmo tempo em que confirme que elas aderem ao fundo do prato.
      NOTA: Descarte a cultura se mais de 10% dos ESCs de camundongos forem diferenciados (Figura 2B) e prepare uma cultura recém-descongelada, que você deve passar pelo menos duas vezes antes de semear os ESCs para um ensaio de diferenciação. Pesquisadores experientes podem julgar por avaliação visual (ver também Mulas et al.28) ou por coloração de anticorpos para expressão de marcadores (por exemplo, OCT4, veja também Ying et al.29).
    5. Abra a tampa do recipiente/prato de cultura, incline-o levemente e aspire cuidadosamente o meio. Mantenha as células fora da incubadora pelo menor tempo possível. Mantenha as células sem meio o mais pouco tempo possível para evitar que a cultura ressece.
    6. Lave as colônias com 500 μL de PBS pré-aquecido (adicione às células em um único poço de uma placa de 6 poços) e aspire imediatamente novamente.
      NOTA: Esta etapa é crucial porque: i) o transporte do meio ESC (2iLIF) deve ser evitado antes do ensaio de diferenciação (ou a formação de NTO será dificultada), ii) FBS ou BSA no meio de cultura podem impedir a dissociação. Isso se aplica a ESCs cultivados em um meio ESC diferente, contendo FBS ou BSA.
    7. Adicione 500 μL de solução enzimática pré-aquecida e transfira as células de volta para a incubadora.
    8. Incube as células a 37 °C por 3 minutos usando um temporizador.
    9. Após o tempo de incubação, retire a placa e verifique as células sob o microscópio de contraste de fase.
      NOTA: Os ESCs deveriam ter se destacado da placa de cultura; se não, bata firmemente, mas com cuidado no prato, (Figura 2C).
    10. Adicione 1 mL de meio N2B27 (Tabela 1) pipetando-o diretamente sobre as células.
      NOTA: Ao preparar o meio (N2B27), a glutamina é mantida por no máximo 5-10 minutos a 37 °C, preferencialmente em temperatura ambiente. Os ESCs devem ser lavados do prato, deixando áreas 'vazias' no prato de cultura.
    11. Use uma pipeta P1000 e incline levemente a placa para que todas as colônias que grudam no recipiente de cultura possam ser lavadas.
    12. Para dissociar aglomerados de células, incline levemente a placa, coloque a ponta da pipeta (P1000) no centro da placa, pressione a ponta contra o fundo da placa, mas ligeiramente fora do eixo perpendicular, e limpe as células. Repita de cinco a dez vezes para quebrar os aglomerados celulares.
    13. Verifique se as células estão dissociadas corretamente em células individuais sob o microscópio de contraste de fase (Figura 2D) e repita se ainda houver aglomerados.
    14. Após a dissociação completa, transferir a suspensão celular para um tubo centrífuga cônico estéril limpo de 15 mL, lavar o poço vazio onde as células foram cultivadas com 1 mL de meio N2B27 e transferir para o mesmo tubo cônico da centrífuga com a suspensão celular.
    15. Centrifuge as células por 5 minutos a 453 x g em uma ultracentrífuga.
    16. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
    17. Resuspenda as células em uma quantidade apropriada de meio N2B27 (por exemplo, 1 mL) e conte as células (veja a Tabela 2 para os números celulares recomendados para ensaio de diferenciação em NTOs).
  2. Diferenciação de ESCs em organoides de tubo neural (NTOs)
    1. Alicotação da matriz de cultura celular
      1. Descongele o frasco da matriz de cultura celular durante a noite sobre gelo a 4 °C (nunca em temperatura ambiente nem descongelando manualmente). Não deixe a matriz de cultura celular a 4 °C por mais tempo do que o necessário; Aliquot e congele o mais rápido possível para preservar sua funcionalidade.
      2. No gabinete de biossegurança, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mL sobre gelo para pré-resfriá-los, mantendo o frasco da matriz de cultura celular sobre gelo fresco.
      3. Misture cuidadosamente a matriz de cultura celular descongelada para evitar a formação de bolhas, pois bolhas podem causar descolamento do poço/prato após a gelatinificação.
      4. Matriz de cultura celular aliquota no volume desejado (recomenda-se 0,5-1 mL) e congele a -20 °C até novo uso. Evite substituir a ponta entre as alíquotas, pois pontas em temperatura ambiente podem fazer a matriz de cultura celular solidificar internamente, causando uma perda significativa. Em vez disso, resfrie as pontas da pipeta a 4 °C guardando-as na geladeira antes do uso.
    2. Semeadura de células individuais em uma matriz de cultura celular
      1. Quantifique o número de células necessárias (matriz de cultura celular de 100 células/μL, veja a Tabela 2).
      2. Transfira o número de célula apropriado (suspensão de células) para um tubo centrífugo cônico limpo de 15 mL e complete com 1 mL de N2B27.
      3. Centrifuge as células por 5 minutos a 453 x g na centrífuga.
      4. Aspire o sobrenadante e coloque o tubo cônico da centrífuga sobre o gelo.
      5. Suspenda cuidadosamente a pastilha celular no gelo em uma quantidade apropriada de matriz de cultura celular descongelada e líquida, evitando a formação de bolhas.
      6. Espalhe a quantidade adequada de suspensão matriz-célula de cultura celular, em uma camada fina, sobre um prato de fundo de vidro ou plástico que seja ideal para imagem (ver Tabela 2, Figura 3A-C), sem tocar nas paredes das placas de múltiplos poços. Devido à alta tensão superficial, a gota da matriz de cultura celular pode se mover do centro do poço para as paredes se já foram tocadas, o que causa uma distribuição inadequada das células/NTOs.
        NOTA: Se estiver usando placas multipoço: primeiro desenhe um círculo da matriz de cultura celular usando uma ponta de pipeta P20 (placa de 96 poços) ou P200 antes de 'preenchê-la' com a suspensão matriz de cultura celular (Figura 3B).
      7. Coloque a placa/placa multipoço na incubadora a 37 °C para deixar a matriz de cultura celular solidificar. Estime-se 1 min por matriz de cultura celular em μL para quantidades menores e um máximo de 15 min para 40 μL ou mais.
      8. Após o tempo de incubação, retire a placa e adicione um volume apropriado de meio (veja a Tabela 2). Os ESCs na matriz de cultura celular não devem secar durante a semeadura para ensaio de diferenciação em NTOs ou ao substituir o meio. Após a gelatinificação, o meio deve ser aplicado o mais rápido possível. A gelatina normalmente é concluída em 1 minuto a 37 °C por matriz de cultura celular de 1 μL e no máximo 15 minutos para matriz de cultura celular de 40-100 μL quando espalhada como uma camada fina.
        NOTA: Para evitar secar ESCs na matriz de cultura celular, manuseie no máximo 8 poços de uma placa de 96 poços com uma pipeta multicanal ou um prato/poço de fundo de vidro de 35 mm de qualquer outra placa multipoço. Mantenha as células fora da incubadora pelo menor tempo possível.
      9. Verifique a densidade de semeadura e a distribuição celular dentro da matriz de cultura celular sob o microscópio de contraste de fase (Figura 3C,D). Recomenda-se a densidade ideal de semeadura (Tabela 2 e Figura 3). No entanto, para certas aplicações, como a análise inicial, uma densidade de semeadura até 10 vezes maior pode ser vantajosa.
        NOTA: Misture cuidadosamente a suspensão da matriz de cultura celular com a ressuspensão com uma ponta de pipeta P300 ou P1000 antes de semear para o ensaio de diferenciação, a fim de neutralizar a variabilidade do número de células entre poços/recipientes. Essa etapa não é recomendada antes de semear todos os poços para proteger contra a perda da matriz da cultura celular, pois isso pode solidificar e aderir à ponta da pipeta.

Tabela 1: Componentes médios (base N2B27, 2iLIF, N2B27diff). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Informações sobre número de células por prato, quantidade de matriz de cultura celular, volume do meio e tempo de gelatinificação. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

2. Tratamento de AR de NTOs para aumentar a diferenciação neural e induzir posteriorização e ventralização

  1. Alicotação do ácido retinoico (AR)
    1. Leve pó totalmente trans de RA para temperatura ambiente (armazenado a -20 °C).
    2. Reconstitua o pó em um volume apropriado de DMSO para atingir uma concentração final de 100 mM.
    3. Aliquota 1 μL de 100 mM de AR em um frasco de 1,5 mL com tampa roscada cada.
    4. Adicione gás argônio até o tubo ficar 'cheio'.
      NOTA: Como o gás argônio é mais pesado que o oxigênio, ele vai afundar para o fundo do tubo para cobrir e preservar a AR do ar. Isso pode ser sentido nas mãos quando o vazamento está cheio.
    5. Feche bem o frasco. A AR é altamente sensível à luz e ao ar.
    6. Armazene as aliquotas no escuro a -80 °C até novo uso. Alternativamente, a AR reconstituída pode ser armazenada em tubos microcentrífugas de 1,5 mL no líquidoN 2.
      NOTA: A AR reconstituída e diluída pode ser armazenada na geladeira quando coberta com papel alumínio por no máximo 2 dias.
  2. Tratamento de AR de NTOs por 18 horas (Figura 4A)
    1. Retire 1 μL da alíquota com concentração de 100 mM de -80 °C e mantenha no escuro até descongelar em temperatura ambiente (por exemplo, na palma da mão ou em um suporte de tubos em um armário de biossegurança sem luzes acesas).
      NOTA: Se alíquotas de AR estiverem armazenadas no líquido N2, abra imediatamente a tampa do tubo da microcentrífuga para evitar a explosão do tubo, feche novamente e prossiga para o passo 2.2.2.
    2. Após o descongelamento, adicione 400 μL de meio N2B27diff pré-aquecido para uma concentração de 250 μM usando uma pipeta P1000. Misture bem para alcançar homogeneidade.
      NOTA: Alternativamente, a AR pode ser reconstituída e diluída em DMSO puro em vez de meio N2B27diff, embora isso aumente a concentração de DMSO na cultura. Ao preparar o meio (N2B27diff), a glutamina é mantida por no máximo 5-10 minutos a 37 °C, preferencialmente em temperatura ambiente.
    3. Pegue pratos/pratos que cultivam NTOs da incubadora e coloque-os em um armário de biossegurança estéril.
    4. Examine os NTOs em crescimento sob o microscópio de contraste de fase. A morfologia dos NTOs é crucial para fornecer informações sobre a viabilidade da cultura e a eficácia do experimento (Figura 4B-D).
    5. Remova a tampa do prato/prato e incline levemente o prato para o lado. Aspire o meio cuidadosamente, seja usando uma pipeta P200 ou um aspirador, sem perturbar a matriz de cultura celular. Mantenha os NTOs sem meio o máximo de tempo possível para evitar que a cultura e/ou a mistura de cultura celular ressecem.
    6. Adicione um volume apropriado de N2B27diff suplementado com solução de AR de 250 nM (veja a Tabela 2), cubra com a tampa e transfira os NTOs de volta para a incubadora.
      NOTA: Às vezes, especialmente se a AR não foi completamente misturada, podem se formar precipitados que são mais difíceis de dissolver no N2B27diff normal. Nesse caso, descarte as alíquotas e faça alíquotas frescas de AR, pois esses precipitados têm uma concentração desconhecida e descontrolada de AR.

3. Remoção da AR e rotina de substituição diária de médio dos NTOs

  1. Transfira a placa de cultura da incubadora para o gabinete de biossegurança estéril.
  2. Remova a tampa e incline levemente a placa para o lado.
  3. Aspire cuidadosamente o N2B27diff contendo AR, seja usando uma pipeta ou aspirador P200, sem tocar na matriz de cultura celular.
  4. Adicione PBS pré-aquecido (use volume suficiente para cobrir a gotícula da matriz de cultura celular ou como referido na Tabela 2), depois incline a placa novamente e remova cuidadosamente para lavar a AR restante.
  5. Adicione um volume apropriado de N2B27diff (conforme referido na Tabela 2), pipetando o meio ao longo da parede do poço/prato para evitar danificar a gotícula da matriz da cultura celular.
  6. Substitua o meio diariamente seguindo os passos 3.1-3.3, depois adicione suavemente N2B27diff fresco pré-aquecido, pipetando o meio na parede do poço/prato antes de devolver os NTOs à incubadora. Pipeteamento direto e vigoroso ou adição de meio frio/PBS sobre a gota da matriz de cultura celular pode causar sua quebra e descolamento da placa/prato.
    NOTA: Ao perturbar vias usando pequenas moléculas ou proteínas recombinantes, é importante substituir o meio diariamente. Se os medicamentos forem aplicados por mais de um dia, as soluções devem ser preparadas de forma fresca diariamente ou pelo menos a cada dois dias para garantir a estabilidade de proteínas/fármacos e a presença contínua das concentrações corretas.

4. Fixação dos NTOs

NOTA: NTOs são fixos conforme descrito por Krammer et al.26. Dependendo do anticorpo a ser usado posteriormente, pode ser necessário PFA de diferentes fontes (comprado em loja, interno, etc.).

  1. Descongelar a aliquota de PFA a 4 °C durante a noite.
  2. Leve o PFA à temperatura ambiente antes do uso.
  3. Se estiver usando uma concentração maior de PFA, dilua o PFA até 4% em meio N2B27diff ou PBS em um capuz químico.
  4. Retire os NTOs da incubadora e transfira-os para um capuz químico.
  5. Abra a tampa e adicione 4% de PFA em uma proporção de 1:1 diretamente aos NTOs para alcançar uma concentração final de 2% (por exemplo, 100 μL de 4% de PFA adicionados aos 100 μL de N2B27diff na placa de 96 poços).
  6. Coloque a tampa de volta e incube os NTOs por 30 minutos em temperatura ambiente. Defina um temporizador, pois uma fixação mais longa pode prejudicar o desempenho de certos tratamentos com anticorpos.
    NOTA: O PFA é tóxico e não deve ser inalado. Trabalhe com cuidado e cautela sob o capô químico. Alguns anticorpos exigem o uso de um PFA específico ou um tempo de fixação mais curto/otimizado.
  7. Após 30 minutos, remova a tampa e incline levemente a placa para o lado, depois siga os passos 3.3-3.4.
  8. Adicione cuidadosamente PBS pré-aquecido (use volume suficiente para cobrir a gota da matriz de cultura celular ou conforme referido na Tabela 2) e incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Repita essa etapa 3 vezes para remover todo o PFA que sobrou.
  9. Após a lavagem final, adicione uma quantidade adequada de PBS (veja a Tabela 2), fele a placa usando parafilme e armazene a 4 °C até novo uso.

5. Coloração por anticorpos de NTOs

  1. A coloração por anticorpos é uma ferramenta valiosa para avaliar a identidade correta dos NTOs, bem como o sucesso do ensaio/experimento. A coloração por anticorpos pode ser realizada conforme descrito em Meinhardt et al.24 e Krammer et al.26.
    NOTA: Se NTOs parecerem subótimos (Figura 4E-G) ou não apresentarem expressão correta de marcadores espaço-temporais (Figura 5 a Figura 7), descarte o material pois ele não atende aos padrões de qualidade.
  2. Mantenha o bloco/solução de permeabilização (1x PBS com 1% de BSA e 0,5% de Triton-X) a 4 °C e adapte à temperatura ambiente antes do uso.
  3. Para reconstituição e análise 3D completas, mantenha os anticorpos (1 e 2º) a 4 °C por pelo menos 1, mas preferencialmente 2 a 3 noites, para garantir uma boa penetração de anticorpos.
    NOTA:O anticorpo 2nd do anti-561 da Alexa Fluor pode fornecer um sinal de fundo mais forte na matriz de cultura celular nos primeiros três dias do ensaio de diferenciação.

6. Desmatamento de NTOs

  1. Prepare-se para a limpeza26
    1. Conclua o processo de coloração de anticorpos antes de iniciar o procedimento de eliminação (certifique-se de que tanto o1º quanto o2º anticorpos sejam incubados e bem lavados).
    2. Adicione propigalato à solução de limpeza (2 mg de propilgalato por mL de solução de limpeza) para minimizar o fotobranqueamento dos NTOs.
      NOTA: Realize a limpeza 1-2 horas antes da imagem para evitar oxidação (líquido que muda de amarelo claro/creme para amarelo escuro brilhante ou até marrom) ou a cristalização da solução de limpeza. Se ocorrer cristalização, dissolva-se adicionando PBS ao poço.
  2. Precauções sobre pH da solução e mistura
    1. Mantenha o pH correto da solução de limpeza para evitar oxidação rápida ou dissolução da matriz de cultura celular.
    2. Evite sacudidas vigorosas ou misturas agressivas da solução para evitar a formação de bolhas de ar.

7. Análise de NTOs

  1. Preparação para microscopia
    1. Após a coloração por anticorpos e a limpeza do tecido inteiro, use um microscópio confocal com alvos de 10 a 40x para imagem.
  2. Avaliação visual
    1. Use avaliação visual e quantificação manual para determinar eficientemente se os NTOs apresentam expressão neural apropriada de marcadores neurais e organização dorsoventral.
  3. Software de análise 3D
    1. Para análise 3D, utilize softwares como CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) ou uma ferramenta similar para avaliar marcadores espaciais e detalhes estruturais.
  4. Verificação da identidade da NTO
    1. Confirme a identidade correta dos NTOs avaliando a expressão temporal dos marcadores neurais e a expressão espaço-temporal de marcadores específicos de padrão dorsoventral. Essa etapa é essencial para garantir que o ensaio de diferenciação tenha sido bem-sucedido antes de pesquisas adicionais.
  5. Aspectos de caracterização: Consulte a Figura 4, assim como a Figura 6 e a Figura 7 para verificar os seguintes aspectos críticos do sucesso cultural:
    1. Consulte a Figura 4 e a coloração por ZO-1 mostradas em Meinhardt et al.24 para verificar epitelização bem-sucedida e formação do lúmen.
    2. A diferenciação neural bem-sucedida é caracterizada pela regulação descendente do OCT4 e pela regulação para cima do SOX1, seguida pela expressão de β3TUBULINA (detalhada no24). Consulte as Figuras 6 e 7 para verificar a diferenciação neural bem-sucedida.
    3. O padrão dorsoventral é confirmado pela presença de uma placa ventral FOXA2+/SHH+ e expressão de PAX3+ no polo dorsal oposto (padrão ventral detalhado em26). Consulte as Figuras 6 e 7 para verificar o sucesso do padrão dorsoventral.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Os ESCs de camundongos R1 foram usados para todos os exemplos representativos nas figuras apresentadas neste manuscrito. Outros ESCs de camundongos mencionados podem apresentar diferenças leves no tempo de epitelialização, diferenciação neural ou eficiência de padrões quando semeados para NTOs, porém, os resultados não devem diferir significativamente dos dados apresentados aqui.

Apenas ESCs de boa qualidade (Figura 2A) semeados n...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, são apresentadas várias adaptações e melhorias otimizadoras ao protocolo original para gerar NTOs de alta qualidade para facilitar a padronização entre laboratórios. Modificações-chave incluem diferentes condições de cultura de ESC, redução do número de células de entrada, meio de diferenciação aprimorado, protocolo de diferenciação modificado e ajustes de densidade de semeadura para análise de alto rendimento usando placas multi-poço. Vários aspectos do protocolo são particularmen...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos membros atuais e antigos do laboratório Tanaka pelo apoio e discussões no desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos especialmente a A. Pelzl por ler criticamente o manuscrito, dar opiniões e ajudar com os esquemas, e a E. Chatzidaki por ler criticamente o manuscrito, editar e apoiar os esquemas, além de conseguir o financiamento do PUD 25 junto com Juergen A. Knoblich. Esta publicação foi financiada pelo Fundo Austríaco de Ciência (FWF): "Projeto de publicação independente número PUD 25". Além disso, este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de subvenção ERC AdG 742046), e do Fundo Austríaco de Ciência (FWF) [10.55776/ F7803-B] (Modulação de Células-Tronco). Para fins de Acesso Aberto, os autores aplicaram uma licença pública de direitos autorais CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceita pelo Autor (AAM) decorrente desta submissão.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antena 35 mm | Cobertura nº 1.5 | Diâmetro de vidro de 14 mm | Sem revestimentoMatTek CorporationCat# P35G-1.5-14-C
AccutaseInvitrogenCat# 00-4555-56
Fração V de Albumina (BSA) (pH 7,0)Panreac AppliChemCat# A1391
Ácido Retinoico All-TransMerckCat# R2625
Suplemento de B-27 (50X), sem soroGibcoCat# 17504044
Matriz de Membrana do Embasamento (Matrigel)CorningCat# BDL354234Concentração de proteína 10 mg/ml 
Microplacas CellCarrier-96 UltraPerkinElmerCat# 6055302
CellProfiler 4Stirling et al. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021TocrisCat# 4423
CUBIC-R+(N)Matsumoto et al, 2019N/A
DimetilsulfóxidoSigma AldrichCat# D2650
DMEM/F-12, sem glutaminaGibcoCat# 21331020
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS, 1X)GibcoCat# 14190144
Centrífuga Eppendorf 5810 REppendorfCat# 5811000015
Microtubo Eppendorf 3810XMerckCat# EP0030125150
Tubos Centrífugas Cônicos FalconCorningCat# 352095
GelatinaMerckCat# G2500
L-Glutamina (200 mM)GibcoCat# A2916801
Incubadora de CO2 HeracellVIOS 160i, 165 LThermoFisher ScientificCat# 51033557
ImarisOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Microscópio de contraste de fase LED invertido (CKX53)Olympus
2-Mercaptoetanol (50 mM)GibcoCat# 31350010
Anti-OCT-3/4 monoclonal de camundongosSanta Cruz BiotecnologiaCat# SC-5279; RRID:AB_628051Use 1:200
Anti-PAX3 monoclonal de camundongosDSHBCat# PAX3-C; RRID:AB_528426Use 1:100
Anti-SHH monoclonal do coelhoTecnologias de Sinalização CelularCat# 2207; RRID:AB_2188191Use 1:300
Coelho monoclonal anti-& beta; 3-TubulinaTecnologias de Sinalização CelularCat# 5568; RRID:AB_10694505Use 1:500
Anti-ZO-1 monoclonal de camundongosInvitrogenCat# 33-9100; RRID:AB_2533147Use 1:200
Mouse LIFQkineCat# Qk018-1000
Suplemento N-2 (100X)GibcoCat# 17502048
Meio NeurobasalGibcoCat# 21103049
Paraformaldeído, grau reagente, cristalinoMerckCat# P6148
PD 0325901TocrisCat# 4192
Solução de Penicilina-EstreptomicinaGibcoCat# 15140130
Microscópio de contraste de fase
Anti-FOXA2 policlonal de cabraR& DCat# AF2400; RRID:AB_2294104Use 1:400
Anti-SOX1 policlonal de cabraR& Sistemas DCat# AF3369; RRID:AB_2239879Use 1:200
Dados de RNA-Seq relacionados à Figura 6Ishihara et al., 2022GEO: GSE214368
Armário Premium de Segurança Microbiológica SafeFASTGrupo Dasit FASTERCat# F00025200000
Piruvato de Sódio (100 mM)GibcoCat# 11360070
Microscópio confocal invertido com disco giratório (IX3)Olympus
Triton X-100Sigma AldrichCat# 9036-19-5

Referências

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Organoides do Tubo NeuralModelos In VitroC lulas Tronco PluripotentesIndu o NeuralForma o de Padr esSistema Nervoso CentralProtocolo de OrganoidesMorfog nese Tecidual
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.