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Artigo de método

MEDUSA para identificação de genes reguladores de morte em dados de perfil quimiogenético

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⸱

DOI:

10.3791/67892

⸱

7 de fevereiro de 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como usar o método analítico MEDUSA para quantificar o efeito regulador da morte de cada nocaute gênico. Ele inclui instruções sobre como determinar as condições experimentais que otimizam a sensibilidade e um tutorial passo a passo sobre como realizar a análise.

Resumo

A triagem sistemática de perturbações genéticas de ganho ou perda de função pode ser usada para caracterizar as dependências genéticas e os mecanismos de regulação para essencialmente qualquer processo celular de interesse. Esses experimentos geralmente envolvem o perfil de um conjunto de perturbações de um único gene e como cada perturbação genética afeta a aptidão celular relativa. Quando aplicados no contexto de estudos de eficácia de medicamentos, muitas vezes chamados de perfis quimiogenéticos, esses métodos devem ser eficazes na identificação dos mecanismos de ação dos medicamentos. Infelizmente, os estudos de perfil quimiogenético baseados em aptidão são ineficazes na identificação de todos os componentes de uma resposta a medicamentos. Por exemplo, esses estudos geralmente não conseguem identificar quais genes regulam a morte celular induzida por drogas. Várias questões contribuem para obscurecer a regulação da morte em telas baseadas em condicionamento físico, incluindo os efeitos confusos da variação da taxa de proliferação, variação na coordenação induzida por drogas entre crescimento e morte e, em alguns casos, a incapacidade de separar o DNA de células vivas e mortas. O MEDUSA é um método analítico para identificar genes reguladores de morte em dados convencionais de perfil quimiogenético. Ele funciona usando simulações computacionais para estimar as taxas de crescimento e mortalidade que criaram um perfil de aptidão observado, em vez de pontuar a aptidão em si. O uso eficaz do método depende da titulação ideal das condições experimentais, incluindo a dose do medicamento, o tamanho inicial da população e a duração do ensaio. Este manuscrito descreverá como configurar um estudo de perfil quimiogenético para análise baseada no MEDUSA e demonstraremos como usar o método para quantificar as taxas de mortalidade em dados de perfil quimiogenético.

Introdução

No perfil quimiogenético, perturbações genéticas sistemáticas são usadas para entender a contribuição de cada gene para uma determinada resposta a drogas 1,2,3. Esses experimentos são valiosos e podem revelar informações importantes sobre as respostas aos medicamentos, incluindo o alvo de ligação do medicamento e os mecanismos de influxo/efluxo do medicamento. No entanto, como esses experimentos são normalmente realizados de maneira agrupada que avalia todos os genes simultaneamente, gerar insights mecanicistas a partir de dados de perfil quimiogenético pode ser um desafio.

Os mecanismos de controle e dependências genéticas para a morte celular induzida por drogas tendem a ser difíceis de resolver em dados de perfil quimiogenético. Existem várias razões para esse problema, mas muitas delas decorrem dos impactos da variação na proliferação celular4. Por exemplo, como as células proliferam exponencialmente, o efeito de uma perturbação genética na taxa de proliferação tem um impacto maior no tamanho da população do que a alteração das taxas de mortalidade celular. Além disso, como essa sensibilidade tendenciosa é exacerbada ao longo do tempo e como esses experimentos são normalmente realizados ao longo de várias semanas, a maioria dos estudos é otimizada para ser altamente sensível a defeitos de proliferação e essencialmente insensível a mudanças na morte celular induzida por drogas. Outras questões relacionadas à proliferação incluem coordenação variada entre proliferação e morte (por exemplo, com que rapidez cada clone está crescendo enquanto também morre, e isso varia entre as perturbações genéticas) e as variações nas taxas de proliferação para cada clone na ausência de droga, o que altera o número esperado de células que deveriam / poderiam ter sido recuperadas se a droga não fosse eficaz. O resultado final é que os experimentos de perfil quimiogenético geralmente pontuam o impacto das perturbações genéticas usando medições proporcionais aos tamanhos relativos da população, comparando populações tratadas e não tratadas. Como o tamanho da população é um produto das taxas de crescimento e morte celular, do ponto de vista da morte celular, a proliferação representa uma influência confusa.

Para sanar esses problemas, criamos um Método de Avaliação de Óbito Usando uma Abordagem Assistida por Simulação (MEDUSA)5. O MEDUSA funciona interpretando os dados de tamanho relativo da população observados através das lentes de simulações computacionais para inferir a combinação de crescimento induzido por drogas e taxas de mortalidade que geraram a resposta observada a drogas para cada clone genético. Dados anteriores sugerem que o método pode inferir com precisão como as perturbações genéticas afetam a taxa de mortalidade induzida por drogas, mas a precisão desse método depende de uma compreensão detalhada de como a proliferação celular e a morte celular são coordenadas por uma droga e como essas taxas variam ao longo do tempo 5,6. Além disso, as inferências baseadas no MEDUSA exigem que um medicamento seja testado em uma dose que cause morte celular substancial. É importante ressaltar que essas condições de drogação criam preocupações adicionais sobre os tamanhos da população inicial e os comprimentos dos ensaios, que devem ser cuidadosamente considerados e otimizados. Neste protocolo, descrevemos como configurar um estudo de perfil quimiogenético para análise baseada em MEDUSA e fornecemos um uso detalhado desse método analítico. O objetivo geral do MEDUSA é determinar como cada deleção de gene afeta o crescimento induzido por drogas e as taxas de mortalidade.

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Protocolo

1. Otimização da dose do medicamento para induzir a morte celular

NOTA: O protocolo abaixo é para otimizar uma combinação de linhagem celular, medicamento e dose usando o ensaio FLICK 7,8. Os dados de exemplo para este protocolo descrevem a otimização e triagem de etoposídeo de 5 μM em células U2OS, mas as mesmas etapas de otimização podem ser aplicadas a qualquer outra combinação desejada de linhagem celular e medicamento/dose. Este protocolo não requer a coleta ou análise de células mortas. Este protocolo pode ser usado para culturas de suspensão, desde que as células mortas sejam removidas. Para culturas em suspensão, as células mortas podem ser classificadas/separadas usando um marcador de viabilidade ou um marcador específico para a morte celular.

  1. Antes de realizar um ensaio FLICK, otimize o número de células, a permeabilização do Triton-X, a concentração de SYTOX e as configurações de aquisição do leitor de placas usando o protocolo detalhado descrito em8.
  2. Células de placa em placas pretas de 96 poços de fundo transparente. As densidades típicas de semeadura são de 1500-5000 células por poço, e esse número deve ser otimizado por linha celular. Incubar células a 37 °C com 5% de CO2 e umidade por 16-24 h.
  3. Prepare diluições de medicamentos em meios contendo a concentração de SYTOX que foi identificada como ideal na etapa (1.1). Os medicamentos são normalmente testados em uma série de diluição logarítmica contendo 8-12 doses biológica ou clinicamente relevantes.
    NOTA: Certos medicamentos podem emitir fluorescência no mesmo comprimento de onda que o SYTOX, impossibilitando a quantificação com este ensaio. Nesses casos, a utilização de variantes SYTOX que emitem fluorescência em diferentes comprimentos de onda pode ser benéfica. Além disso, este ensaio não pode avaliar a reação a medicamentos que afetam a fluorescência do SYTOX ou impedem que o SYTOX se ligue ao DNA.
  4. Lisar uma placa (T0) utilizando Triton-X na concentração otimizada no passo (1.1). Após a lise celular, use um leitor de placas para medir a fluorescência SYTOX e determinar o número total de células iniciais com base na relação empiricamente estabelecida entre fluorescência e número de células (consulte o protocolo FLICK 7,8).
  5. Meça a fluorescência SYTOX nas placas experimentais em T0 usando um leitor de placas, com configurações otimizadas na etapa (1.1).
  6. Monitore o sinal SYTOX ao longo do tempo por três dias. Para restringir os dados cinéticos resultantes, use pelo menos três pontos de tempo por dia, cada um com 4 h de intervalo.
    NOTA: Este protocolo avalia a morte e o crescimento celular ao longo de 3 dias. Esse período de tempo geralmente é suficiente para drogas indutoras de morte; no entanto, o ensaio pode ser encurtado ou alongado para acomodar medicamentos com cinética de morte alternativa.
  7. Após o ponto de tempo final, lise a(s) placa(s) experimental(is) com Triton-X para determinar o tamanho final da população de cada condição.
  8. Calcule a viabilidade fracionada (FV) e ajuste os dados do endpoint às curvas de dose, conforme descrito no protocolo FLICK 7,8.
  9. Identifique as doses de medicamentos que induzem cerca de 50% da morte celular avaliando as curvas de dose de FV.
    NOTA: A identificação de células mortas por SYTOX requer ruptura da membrana plasmática e ruptura do envelope nuclear. Essas membranas precisam de manutenção contínua, portanto, o SYTOX identificará células mortas, independentemente do mecanismo de morte celular induzido pelo medicamento. No entanto, esses processos não acontecem com a mesma eficácia para todas as formas de morte celular, o que poderia influenciar a capacidade do SYTOX de medir as células mortas com precisão. Além disso, diferentes mecanismos de morte celular produzirão cadáveres celulares de estabilidades variadas. No entanto, descobrimos que todas as formas de morte celular testadas até agora resultam em DNA ligado a SYTOX (dentro de um núcleo permeabilizado ou no meio de cultura celular). Este sinal SYTOX é geralmente estável ao longo de um ensaio de 72 h, mas pode ser monitorado avaliando o número total de células no início e no final do ensaio.

2. Seleção do comprimento do ensaio

  1. Usando os dados FLICK coletados na etapa 1, calcule a Fração Letal (LF) de cada condição ao longo do tempo, conforme descrito no protocolo FLICK 7,8. Ajuste os dados cinéticos de LF a um modelo de morte exponencial de defasagem (LED), conforme descrito anteriormente9.
  2. Plotar LF ao longo do tempo para cada dose letal identificada na etapa 1. Selecione uma dose e um ponto de tempo que produza ~ 50% LF.
    NOTA: Uma fração letal de ~ 50% enriquece sinais fortes e específicos de morte nos dados de triagem CRISPR, deixando células vivas suficientes para manter a representação da biblioteca5. No entanto, alguns medicamentos serão limitados pela precedência da literatura ou por uma faixa estreita de doses que induzem um fenótipo desejado específico. Se a dose for restrita, o ponto final do ensaio deve ser encurtado ou estendido para garantir que a dose desejada atinja ~ 50% LF. Se a letalidade de 50% não for possível, o tamanho da população inicial pode precisar ser aumentado.

3. Determinando o tamanho inicial da população

  1. Selecione a dose de medicamento desejada para otimizar ainda mais a triagem com base na otimização acima.
  2. Células de placa em pratos de 10 cm em mídia completa. Cada condição deve ser plaqueada com triplicados técnicos e réplicas biológicas suficientes para que as células possam ser contadas a cada 12-24 h durante o comprimento da tela, incluindo o ponto de tempo T = 0.
    NOTA: O número de células plaqueadas pode precisar ser otimizado separadamente para células não tratadas e tratadas, considerando a taxa líquida de crescimento populacional e o tamanho da célula. As células geralmente devem ser plaqueadas em densidades que resultem em uma confluência que não comprometa a saúde celular no ponto final do ensaio (ou seja, para muitos tipos de células < 80% confluentes). As células tratadas e não tratadas também podem ser replaqueadas durante a tela, se necessário, desde que a representação da biblioteca seja mantida.
  3. Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
  4. Adicione o medicamento na concentração desejada às placas de tratamento. Paralelamente, colha células de 3 placas não tratadas e conte o número de células vivas usando um hemocitômetro. Manchar as células mortas com azul de tripano (ou um corante de viabilidade comparável) para garantir que apenas as células vivas sejam contadas. Esses dados estabelecem o número de células no ponto de tempo T = 0.
  5. Após 12-24 h, colher células de 3 placas não tratadas e 3 placas tratadas e contar o número de células vivas. Repita a colheita até que o ponto final do ensaio seja alcançado. Para entender completamente a cinética do medicamento e da morte celular, recomenda-se que as células vivas sejam monitoradas por 24-48 horas após o ponto de tempo identificado na etapa (2.2).
  6. Visualize as mudanças na viabilidade plotando o tamanho da população (eixo y) ao longo do tempo (eixo x).
    NOTA: Com base no número máximo de células observado e no tamanho final da população, pode ser feita uma estimativa aproximada da fração letal no ponto final. Isso deve ser comparado com os dados de viabilidade fracionada e fração letal gerados usando o ensaio FLICK (etapa 1.9 e etapa 2.2) para garantir que a quantidade esperada de morte celular seja alcançada.
  7. Identifique o ponto de tempo com o menor tamanho da população. Dependendo da quantidade de crescimento que ocorre na presença do medicamento, isso ocorrerá no início ou no final da tela CRISPR.
  8. Selecione um tamanho de população inicial. Certifique-se de que o número inicial de células esteja otimizado para manter uma cobertura mínima de 500x-1000x da biblioteca em toda a tela.
    NOTA: Por exemplo, a biblioteca TKOv3 tem 70.948 sgRNAs. Para representar esta biblioteca com cobertura de 500x, nada menos que 35.474.000 células por repetição por condição devem ser mantidas durante todo o ensaio. Esse tamanho populacional de gargalo é frequentemente encontrado no início do ensaio ou após tripsinização e redução da amostragem para condições não tratadas ou em proliferação. Em contraste, o tamanho da população de gargalos é frequentemente ditado pelo tamanho da população no endpoint do ensaio para tratamentos medicamentosos que induzem letalidade substancial.
  9. Se desejar, repita a otimização acima nas placas que serão usadas para a tela CRISPR (por exemplo, placas de 15 cm) para confirmar se a eficácia do medicamento é dimensionada corretamente.

4. Executando a tela CRISPR

NOTA: As células podem ser rastreadas usando métodos de triagem CRISPR estabelecidos após a otimização da dose do medicamento e da duração do ensaio. Protocolos estabelecidos, como o protocolo de triagem TKO do laboratório Moffat10,11, podem ser usados para preparar a biblioteca de triagem CRISPR, produzir vírus, realizar a triagem CRISPR e preparar bibliotecas para sequenciamento (Figura 1A-B). O protocolo abaixo descreve as etapas específicas para a análise MEDUSA, que deve ser realizada em dados de nível de contagem após o sequenciamento.

  1. Calcule as mudanças de dobra observadas experimentalmente para cada sgRNA (Figura 1C) conforme descrito abaixo.
    1. Gere uma tabela de contagens no nível do sgRNA para preparar os dados de sequenciamento para análise. Corte e mapeie bibliotecas de sequenciamento usando pipelines padrão, conforme descrito 5,12.
    2. Normalize a profundidade da biblioteca de sequenciamento. Normalize as bibliotecas manualmente ou usando funções integradas, como as do DESeq2, como em 5,12. Execute a normalização em todos os guias ou usando a distribuição de guias que não são de direcionamento.
    3. Atribua aleatoriamente sgRNAs não direcionados a genes não direcionados. Por exemplo, uma biblioteca com quatro sgRNAs por gene deve ter quatro sgRNAs não direcionados por gene não direcionado.
    4. Para cada comparação de interesse (não tratada/T0 e/ou tratada/não tratada), calcule o log2(fold-change). Recomenda-se que isso seja calculado usando um ajuste paramétrico no DESeq2, embora um cálculo manual da mudança de dobra também possa ser realizado.
    5. Corte sgRNAs com um baixo número de contagens. A estratégia de corte correta dependerá do nível de ruído entre as réplicas e de como isso varia ao longo das contagens. Esses recursos variam dependendo da biblioteca CRISPR e testam vários cortes em paralelo para novos dados. Estratégias de corte comuns baseadas em precedentes da literatura incluem a remoção dos 5% mais baixos dos guias ou a remoção de guias abaixo de algum limite nominal13.
  2. Determine o impacto de cada nocaute de gene na taxa de crescimento, conforme descrito abaixo.
    1. Calcule a taxa líquida de crescimento populacional (NPG) das células não tratadas (ou seja, o tempo de duplicação da população observado, Figura 1D). Isso pode ser extraído dos dados FLICK na etapa 1, contagens de células vivas ao longo do tempo na etapa 3 ou medições experimentais anteriores para a linha celular de interesse.
    2. O MEDUSA requer três parâmetros para modelar a condição não tratada: NPG: Taxa líquida de crescimento populacional, em duplicações/h; Tinício: Ponto de tempo inicial, em h. Isso é definido como um padrão de 0; Tendunt: Ponto final para a condição não tratada, em h.
    3. Simule todas as perturbações possíveis para a taxa NPG. Use um loop for para avaliar um intervalo de possíveis valores NPG. Para cada taxa de crescimento relativo, calcule o log2 (mudança de dobra) que seria observado no ponto final do ensaio.
    4. Para cada sgRNA experimental na etapa 4.1.5, identifique a mudança de dobra simulada mais próxima dos dados observados. Atribua a taxa de crescimento relativa que resultou na mudança de dobra simulada a esse sgRNA.
  3. Caracterize a coordenação entre crescimento e morte conforme descrito abaixo.
    NOTA: Os parâmetros necessários para o MEDUSA podem ser extraídos de dados no estilo FLICK quando analisados com o método de análise GRADE14. Os dados de (1) e (2) podem ser usados para isso, ou um experimento de parametrização adicional pode ser realizado.
    1. O MEDUSA usa quatro parâmetros para caracterizar a coordenação entre crescimento e morte na presença de drogas: GRdroga1: Taxa de crescimento induzida por drogas antes do início da morte, em duplicações/h; DO: Tempo de início da morte, em h; GR droga2: Taxa de crescimento induzida por drogas após o início da morte, em duplicações/h; Droga DR: Taxa de mortalidade induzida por drogas, em unidades de Fração Letal/h. Para parametrizar DO, use a cinética LF. Extraia o tempo de início da morte do ajuste do LED.
  4. Determine omedicamento DR usando a cinética LF. Determine a taxa média de mortalidade dividindo o LF final pelo tempo após o início da morte (em h).
  5. Determine omedicamento GR1 a partir dos dados de contagem de células vivas na etapa 3. Antes do início da morte, determine a taxa de crescimento induzida por drogas ajustando os dados a uma equação exponencial simples.
    1. Determine omedicamento GR2 usando uma combinação de dados da etapa 3 e do medicamento GRAU14. Calcule e plote o GRADE para a dose de medicamento selecionada em um gráfico GRADE. Se GRADE = 0, suponha que GRdrug2 seja 0; Se GRADE > 0, use GRADE para determinar a taxa média de crescimento da população. Com base no valor determinado experimentalmente para omedicamento GR1, determine o valor para omedicamento GR2 que resulta na taxa média de crescimento observada.
      NOTA: A taxa média de crescimento induzido por drogas pode ser inferida a partir de um gráfico GRADE calculando a distância em pares entre o ponto de dados observado (ou seja, par de dados GR e FV para uma droga) e cada ponto que compõe o espaço GRADE e identificando o ponto mais próximo. Para instruções detalhadas, consulte a ref14. As taxas de crescimento induzidas por drogas e as taxas de mortalidade não são valores fixos por droga e são específicas para uma droga em uma determinada dose em um determinado contexto celular.
  6. Gere mudanças de dobra simuladas para todas as combinações possíveis de taxa de crescimento e taxa de mortalidade, conforme descrito abaixo.
    1. Usando a coordenação determinada experimentalmente da taxa de crescimento induzida por drogas e taxa de mortalidade, construa um modelo que simule o tamanho da população induzida por drogas ao longo do tempo (Figura 1D). Este modelo pode ser construído como uma função por partes que combina duas fases independentes da resposta ao medicamento (tempo de início pré e pós-morte).
    2. Para um modelo MEDUSA completo, inclua estes oito parâmetros: NPG: Taxa de crescimento populacional líquido, em duplicações/h; GRdroga1: Taxa de crescimento induzida por drogas antes do início da morte, em duplicações/h; DO: Tempo de início da morte, em h; GR droga2: Taxa de crescimento induzida por drogas após o início da morte, em duplicações/h; Droga DR: Taxa de mortalidade induzida por drogas, em unidades de Fração Letal/h; Tinício: Ponto de tempo inicial, em h. Isso é definido como um padrão de 0; Tendunt: Ponto final para a condição não tratada, em h; Tendertr: Ponto de tempo final para a condição tratada, em h.
    3. Para o modelo de linha de base, simule todas as possíveis perturbações da taxa de crescimento e mortalidade. Para cada combinação, calcule o log2 (mudança de dobra) que seria observado.
      NOTA: No MEDUSA, as perturbações na taxa de crescimento são consideradas proporcionais entre NPG, GRdrug1 e GRdrug2. Por exemplo, uma redução de 80% na taxa de NPG também resulta em uma redução de 80% em ambas as taxas de crescimento induzidas por drogas.
  7. Inferir a taxa de mortalidade de cada nocaute (Figura 1D-E) conforme descrito abaixo.
    1. Para cada sgRNA, triangule a taxa de mortalidade induzida por drogas que teria produzido a mudança de dobra observada. Em primeiro lugar, extrair a taxa de crescimento relativa determinada no passo (4.2.4).
    2. Determine as taxas para omedicamento GR1 e omedicamento GR2. Aplique a taxa de crescimento relativo do NPG para calcular uma taxa de crescimento proporcional para omedicamento GR1/GR2.
    3. Usando as restrições para NPG, GRdrug1 e GRdrug2, identifique a mudança de dobra simulada mais próxima da mudança de dobra observada para cada sgRNA (tratado/não tratado). Use uma combinação dessas observações para calcular a taxa de mortalidade induzida por drogas.
  8. Calcule as taxas de crescimento em nível de gene e as taxas de mortalidade conforme descrito abaixo.
    1. Determine as taxas de nível de gene para cada gene na biblioteca. Calcule a média de cada taxa de crescimento e taxa de mortalidade para todos os sgRNAs associados a um determinado gene (normalmente 4-10).
    2. Para calcular os valores de p empíricos, inicialize os dados no nível do sgRNA. Realize uma correção FDR com o procedimento de Benjamini-Hochberg.
      NOTA: Instruções complementares, bem como dados de amostra para analisar dados de triagem CRISPR usando MEDUSA, estão incluídos em nosso repositório GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

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Resultados

Usando este protocolo, exploramos as dependências genéticas da morte induzida por etoposídeo em células U2OS. O etoposídeo é uma quimioterapia comumente usada para danificar o DNA15. Este experimento de perfil quimiogenético foi realizado usando a biblioteca GeCKOv216 em Cas9 expressando células U2OS5. Nesses tipos de experimentos, a função do gene é tipicamente inferida a partir da abundância relativa de um determinado clone knockout ao comparar pop...

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Discussão

Neste protocolo, descrevemos o uso do método analítico MEDUSA para quantificar dados de perfil quimiogenético para pontuar como as perturbações genéticas alteram o crescimento induzido por drogas e as taxas de mortalidade. Como a saída primária de um experimento de perfil quimiogenético está relacionada ao tamanho da população, não às taxas, as taxas subjacentes são inferidas usando simulações. Assim, as etapas críticas do método são a parametrização experimental precisa da cinética de r...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros do Lee Lab, do passado e do presente, por suas contribuições para o ponto de vista de nosso laboratório sobre a avaliação de respostas a medicamentos. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento MJL e MEH dos Institutos Nacionais de Saúde (U01CA265709, R21CA294000 e R35GM152194 para MJL e F31CA268847 para MEH), o financiamento MJL da Fundação Jayne Koskinas Ted Giovanis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pratos Fisherbrand TC de 100 mmFisherScientific FB012924Para células em crescimento e otimização do tamanho da população
Pratos TC Fisherbrand de 150 mmFisher ScientificFB012925Para células em crescimento e otimização do tamanho da população
DESeq2R Pacotev1.44.0Para calcular a mudança de dobra
DMEMCorning10017CVPara semeadura e droga células
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCPara semear e drogar células
Fisherbrand 96-Well, Célula Tratada por Cultura, Microplaca de Fundo em UFisher ScientificFB012932Para semear e drogar células (placa de pino)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Microplaca de Fundo Plano Tratada com Cultura de Células Transparente de 96 poçosGreiner655090Para semear e drogar células
MATLABMathworks R2024aPara realizar FLICK, GRADE e MEDUSA
Leitor de fluorescência de microplacasTecanSparkPara medições de células mortas
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020Para medições de células mortas
TKOV3 Biblioteca CRISPRAddgene125517Para realizar tela CRISPR
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APPara células permeabilizantes
Azul tripano Corning MT25900CIPara medir células vivas/mortas

Referências

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