Administração de anestésicos voláteis a larvas de peixe-zebra para observação comportamental

Resumo

Este protocolo apresenta um método acessível para criar um ambiente à prova de gás para administrar anestésicos voláteis a larvas de peixe-zebra para experimentos comportamentais.

Resumo

Este estudo descreve um método único para administrar anestésicos voláteis, como isoflurano e sevoflurano, a larvas de peixe-zebra durante experimentos comportamentais. Embora o peixe-zebra ofereça inúmeras vantagens como organismo modelo de vertebrado - incluindo comportamentos complexos, tratabilidade genética, embriões transparentes e desenvolvimento rápido - seu uso no estudo de anestésicos voláteis tem sido limitado. A administração de anestésicos voláteis geralmente requer aparelhos complexos ou pesados que podem não ser amplamente acessíveis, criando barreiras ao estudo farmacológico de anestésicos voláteis em organismos modelo aquosos. Este método apresenta uma técnica simples usando folhas adesivas de silicone para criar uma vedação à prova de gás em placas de vidro de 96 poços. A validação foi realizada por meio da avaliação do movimento espontâneo, que não mostrou diferenças significativas entre poços selados e abertos em um período de 90 minutos. Além disso, a concentração do anestésico permaneceu estável ao longo do tempo, medida por HPLC. Os resultados representativos incluem a determinação experimental dos valores médios da concentração efetiva (EC₅₀) para o sevoflurano. Este estudo fornece uma abordagem simples e acessível para experimentos farmacológicos usando anestésicos voláteis, que podem ser facilmente adaptados para estudar outros agentes voláteis e desfechos experimentais.

Introdução

Modelos animais não aquáticos (vermes, moscas, roedores, coelhos, primatas, etc.) têm sido historicamente os modelos mais comumente usados para estudar a farmacologia anestésica. Em cada uma dessas espécies, os anestésicos voláteis (administrados por inalação de gás) são muito menos desafiadores do que a administração de anestésicos intravenosos (administrados por via intravenosa ou intraperitoneal)¹. Além do desafio técnico de simplesmente administrar os medicamentos intravenosos, alcançar um estado estacionário de anestesia é muito mais fácil com agentes voláteis do que com agentes intravenosos².

A administração de anestésicos intravenosos a larvas de espécies aquáticas pode ser obtida por difusão de seu meio aquoso circundante ^3,4 e, portanto, é mais semelhante à administração de anestésicos voláteis para espécies não aquosas. Por muitos anos, os girinos (Xenopus laevis) foram o modelo de escolha para o estudo de anestésicos devido à facilidade de administração de drogas e farmacocinética em estado estacionário alcançada pela simples adição do anestésico em banho à água artificial da lagoa ^5,6. No entanto, existem relativamente poucos exemplos do estudo de anestésicos voláteis neste modelo devido à necessidade de aparelhos estanques ao gás que geralmente são construídos especificamente e podem ser complicados de usar ^7,8.

Nos últimos anos, o peixe-zebra tornou-se um modelo preferencial para o estudo de anestésicos intravenosos devido à mesma facilidade de administração de medicamentos, além de outras vantagens, como seus comportamentos complexos bem descritos e disponibilidade de unidades comerciais para observar esses comportamentos⁹. Muitos estudos recentes empregaram essas unidades de observação disponíveis comercialmente para rastrear compostos neuroativos, incluindo anestésicos, usando formatos de placas de 96 e 24 poços para quantificar o comportamento das larvas de peixe-zebra 4,10,11,12,13,14,15 . Os estágios larvais são particularmente adequados para estudos de farmacologia devido à sua capacidade de avaliar muitas respostas comportamentais, seu tamanho pequeno, alta compatibilidade de rendimento e circuitos neurais bem caracterizados ^9,16,17. No entanto, uma limitação significativa nesses estudos de anestésicos no modelo de peixe-zebra é a relativa dificuldade em administrar anestésicos voláteis. Essa limitação levou a poucos exemplos de comparação entre agentes voláteis e intravenosos ^4,15,18. Ser capaz de estudar e comparar facilmente as duas classes de anestésicos em um único modelo animal adiciona uma ferramenta importante para facilitar o estudo da farmacologia anestésica em todas as classes.

Tradicionalmente, o estudo de anestésicos intravenosos em uma espécie aquática requer equipamentos especializados, muitas vezes personalizados, que podem ser difíceis de usar ou podem não ser suficientemente estanques ao gás para evitar a perda do anestésico durante o experimento. O procedimento descrito aqui apresenta um meio alternativo facilmente acessível de produzir uma vedação à prova de gás em uma câmara de vidro que é adequada para observação do comportamento das larvas de peixe-zebra usando uma unidade de observação comercial (ver Tabela de Materiais).

Protocolo

Todos os experimentos com peixe-zebra foram conduzidos de acordo com os protocolos de uso de animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Os peixes-zebra adultos foram mantidos nas instalações aquáticas da Universidade da Pensilvânia sob a supervisão do University Laboratory Animal Resources (ULAR). O peixe-zebra selvagem de barbatana longa de Tübingen foi criado internamente para todos os experimentos e mantido em condições padrão de criação com um ciclo claro/escuro de 13/11 h até atingir 5 dias após a fertilização (dpf). Os experimentos foram conduzidos usando repetições biológicas, com ninhadas derivadas de pares de acasalamento distintos para garantir a diversidade biológica adequada. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação de folhas adesivas de silicone

NOTA: Equivalentes deste material (folha de silicone mais adesivo) podem ser adquiridos comercialmente, mas muitas vezes com maior custo e menor disponibilidade.

1. Disponha a folha de silicone de 0,5 mm em uma superfície limpa e plana.
2. Inspecione as folhas quanto a vincos e evite-os quando possível.
   NOTA: Folhas de silicone com vincos podem não aderir adequadamente à fita e podem resultar em vedação inadequada dos poços e/ou má visualização do peixe-zebra.
3. Limpe as folhas com álcool 70% para remover qualquer óleo ou detritos e deixe-os secar.
4. Usando um aplicador, como um pincel, aplique uma camada fina e uniforme de primer adesivo na folha de silicone. Para evitar a aplicação excessiva, trabalhe em seções menores, pois o promotor adesivo seca rapidamente (endurece em 1-5 s).
   NOTA: Sem este promotor de adesão, a fita não aderirá adequadamente à folha de silicone.
5. Assim que o promotor de adesivo for aplicado, alinhe a fita dupla face com a folha de silicone com o suporte de papel voltado para cima.
6. Aplique gradualmente a fita no silicone usando um rolo para alisar a superfície e remover as bolhas de ar (após a aplicação inicial, trabalhar com o lado do silicone para cima ajudará na visualização e remoção das bolhas de ar).
7. Deixe o promotor adesivo curar completamente por 24 h em uma superfície plana.
8. Corte o silicone adesivo em tiras de pelo menos 10 mm de largura (7,5 mm de diâmetro do poço mais sobreposição de cada lado).
   NOTA: Ao usar todas as outras fileiras da placa do poço, uma variação maior nas tiras não afetará negativamente os poços nas fileiras adjacentes, o que pode não apenas facilitar a aplicação, mas também ser necessário para obter uma vedação em toda a circunferência do poço.
   1. Certifique-se de que as tiras sejam longas o suficiente para cobrir pelo menos a largura de uma fileira da placa do poço.
      NOTA: Se estiver usando uma placa de poço que não seja de 96 poços, como uma placa de 24 ou 48 poços, os tamanhos das tiras podem ser ajustados ou cortados para se adequar às dimensões específicas da placa, garantindo a cobertura adequada, independentemente do tamanho da placa.

2. Preparação de soluções

NOTA: Todas as soluções de estoque e ensaio de anestésicos voláteis foram feitas logo antes do experimento para evitar a perda da concentração de compostos voláteis.

1. Para cada solução (estoque ou solução de trabalho), adicione um volume de solvente não volátil (água embrionária E3, DMSO, etc.) a um frasco para HPLC ou cintilação que, quando combinado com a diluição final do anestésico volátil, o volume total preencherá suficientemente o frasco, deixando um espaço mínimo (ver Figura 1A).
2. Adicione anestésico volátil com uma seringa à prova de gás Hamilton e feche rapidamente o frasco.
   NOTA: As soluções de estoque em frascos para injetáveis com tampas de septo podem ser usadas para facilitar diluições adicionais por meio da transferência de solução com seringas estanques ao gás.
3. Em seguida, misture os frascos (vórtice, sonicação) conforme necessário e armazene-os temporariamente enquanto prepara os pratos de peixe-zebra.

3. Configuração do experimento comportamental

NOTA: Esta etapa do protocolo pode exigir alguma prática. Recomenda-se trabalhar sem peixes ou soluções contendo material precioso até se sentir confortável com a técnica.

1. Transfira uma larva de peixe-zebra (5 dpf) para cada duas fileiras da placa de vidro de 96 poços.
   NOTA: Deixar todas as outras linhas vazias permite reduzir o potencial de contaminação dos poços adjacentes por transbordamento, pois os poços são selados na etapa 3.4.
2. Remova cuidadosamente a solução E3 de cada poço. Isso pode ser feito uma linha de cada vez ou em toda a placa, se for capaz de trabalhar rapidamente.
   NOTA: A duração durante a qual as larvas ficaram fora da solução foi minimizada para reduzir o estresse potencial. Procedimentos alternativos podem ser usados com base em diferentes necessidades experimentais, incluindo apenas a remoção parcial da solução antes da adição da solução contendo o medicamento para minimizar o estresse. O protocolo deve ser adaptado para atender às necessidades do experimento, incluindo o tempo de equilíbrio dado aos animais para compensar qualquer estresse potencial, eficiência de mistura da solução e precisão das concentrações de uma solução contendo medicamento, se nem todo o E3 for removido antes da adição da solução de trabalho.
3. Em seguida, use uma pipeta de transferência para encher cada poço na linha com a solução experimental. Tome cuidado para não introduzir bolhas. Encha demais cada poço (Figura 1B).
4. Usando as tiras adesivas de silicone feitas na etapa 1, pressione a tira para baixo rapidamente (Figura 1C). Isso ajuda a evitar a formação de bolhas e evita que os peixes transbordem para os poços adjacentes.
5. Pressione firmemente a parte superior da placa para garantir que cada poço esteja selado.
6. Repita as etapas 2 a 5 até que a solução seja trocada e os poços para todas as outras fileiras da placa do poço sejam selados (Figura 1D).
7. Vire suavemente a placa e verifique se há bolhas de ar.
   NOTA: A presença de bolhas de ar obscurecerá a visualização do movimento do peixe-zebra.
8. Coloque a placa na unidade de observação do comportamento (lado adesivo de silicone para baixo) e execute o experimento comportamental (consulte a seção Resultados para obter detalhes).

Resultados

Comparação com a observação tradicional de poço aberto
Para avaliar se o selamento adesivo tem algum efeito sobre o movimento espontâneo, foi feita uma comparação entre os controles em poços abertos e selados. Como visto na Figura 2A, nenhuma diferença estatisticamente significativa no movimento foi observada entre esses grupos para a duração padrão de ~ 30 minutos usada nos experimentos descritos neste artigo. Reconhecendo que outros paradigmas experimentais podem precis...

Discussão

Este artigo descreve um método para administrar prontamente anestésicos voláteis, como o sevoflurano, a larvas de peixe-zebra, que foi usado para quantificar a potência do anestésico volátil em peixes selvagens. Embora essa técnica seja conceitualmente simples, pode ser necessária prática para garantir uma linha de poços adequadamente vedada e sem bolhas em um curto espaço de tempo para minimizar a perda de agentes voláteis. Como esse método se destina a compostos voláteis, ele requer nã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplacas de vidro de 96 poços	Zinsser América do Norte	3600500	"Essas microplacas de vidro são feitas de vidro borossilicato especial de alta pureza e resistente à temperatura e as superfícies são polidas com ácido. As placas são retangulares na área de microplaca SBS padrão (85 x 127 mm). Essas microplacas de reator de vidro são projetadas principalmente para uso com aplicações químicas e são resistentes a temperaturas de até 530° C. Eles podem ser autoclavados. Eles são usinados a partir de uma folha de vidro homogênea e apresentam geometria e forma uniformes para fornecer temperaturas consistentes de poço a poço (dentro de 0,2 graus C típicos)."
Frascos de 2,0 mL transparentes, grande abertura, rosca de 9 mm	Ciências da Vida Chemglass	CV-1150-1232	"Com uma abertura 40% maior, esses frascos são projetados especificamente para funcionar em amostradores automáticos de braço robótico. Eles também incorporam o design exclusivo do frasco de degrau que centraliza com precisão uma inserção de volume limitado no gargalo do frasco. "
Fita Dupla Face 3M 9490LE	AbbVie Inc	24WG90	"A Fita Dupla Face 3M 9490LE com Adesivo de Laminação 3M 300LSE fornece alta resistência de união para a maioria das superfícies, incluindo muitos plásticos de baixa energia superficial, como polipropileno e tintas revestidas a pó. O adesivo acrílico também oferece excelente adesão a superfícies levemente contaminadas com óleo normalmente usado em peças de máquinas. A fita dupla face 3M 9490LE oferece o recurso adicional do Adesivo de Laminação 3M 300MP em um lado para fornecer excelente resistência de união a uma variedade de materiais de espuma e tecido (6 pol x 5 jardas)"
Câmara de Observação DanioVision	Noldus	DVOC-0041	"O DanioVision é um sistema completo, projetado para o teste de alto rendimento de larvas de peixe-zebra em placas de vários poços. Inclui a Câmara de Observação e o renomado software de rastreamento de vídeo EthoVision XT."
Unidade de controle de temperatura DanioVision	Noldus	DVTCU-0011	"A Unidade de Controle de Temperatura DanioVision é um sistema de fluxo: a água flui uniformemente sob a placa do poço na temperatura de sua escolha. A temperatura é a mesma em toda a placa do poço.
Software Ethovision XT16	Noldus	NSE-EV-BASE	"O EthoVision XT é o software de rastreamento de vídeo mais amplamente aplicado que rastreia e analisa o comportamento, o movimento e a atividade de qualquer animal, marca registrada da Noldus"
Isoflurano	Cuidados Intensivos Piramal	NDC # 66794-017-10	Líquido para inalação, um anestésico inalatório não inflamável e não explosivo, contendo 100 mL de isoflurano. Armazenado em temperatura ambiente controlada 20º para 25º C
Primer Adesivo Instantâneo Scotch-Weld AC79 Transparente	3M	"62-3916-0860-1 (ID do produto) C2103N (lote)"	"O Primer Adesivo Instantâneo 3M Scotch-Weld AC79 foi projetado para uso em elastômeros de baixa energia superficial difíceis de colar, como EPDM, silicone e outras borrachas. A preparação e a aplicação da superfície são diretas e o primer adesivo é de secagem rápida para manter os trabalhos em andamento rapidamente."
Folhas de silicone com 0,5 mm de espessura	vários fornecedores	N/A	Folhas de silicone translúcidas foram compradas de vários fornecedores
Brayer de Borracha Dura Pop-in Speedball com Estrutura de Plástico, 4 Polegadas"	Speedball	793728	"O Speedball Pop-In Hard Brayer tem um rolo que se solta para facilitar a limpeza. Plástico, estrutura de uma peça com rolo destacável de 4 polegadas de largura. Feito de borracha de goma natural pura com acabamento retificado. O brayer de borracha dura tem 4 polegadas de largura com uma estrutura de plástico resistente e é ótimo para aplicação de cola"
Tampas de rosca SureSTART de 9 mm, nível 2 Aplicações de alto rendimento, Tipo: Tampa de rosca AVCS PP preto, Silicone branco/PTFE vermelho Septos de 1,0 mm	Thermo Científico	6ASC9ST1B	"Use as tampas de rosca Thermo Scientific SureSTART de 9 mm com frascos de rosca com abertura de 9 mm. As tampas de nível 2 de desempenho são fabricadas e testadas para garantir baixo sangramento, robustez e reprodutibilidade dos resultados para análises de GC-MS e LC-MS de rotina. Escolha entre tampas de polipropileno com septos de silicone/PTFE multiuso de vários valores de dureza projetados para reduzir os problemas de agulha do amostrador automático. Nossas tampas AVCS incorporam a tecnologia Advanced Vial Closure System para garantir a compressão ideal da vedação ao fechar um frasco."
Ultane Sevoflurano	AbbVie Inc	NDC # 0074-4456-04	Líquido Volátil para Inalação, é embalado em frascos de cor âmbar contendo 250 mL de sevoflurano. Armazenado a temperatura ambiente controlada 15º a 30º C
Frascos de Cintilação Líquida Wheaton, Tampas Anexadas a Frascos, Vidro, Folha de Metal / Polpa, 24-400, 20 mL	DWK Ciências da Vida	986561	Frascos de cintilação de 20 mL convertidos de tubos de vidro borossilicato Tipo I, PET ou HDPE. Disponível com tampa anexada.